Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T12:18:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aguiar-Oliveira_Elizama_D.pdf: 4155399 bytes, checksum: 664192a1e372b0f5556340a23b235a02 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A obtenção de fruto-oligossacarídeos (FOS), um açúcar prebiótico de vasta aplicação industrial, por enzimas imobilizadas abrange dois conceitos em grande expansão: aplicação industrial de enzimas imobilizadas e alimentos funcionais. A partir de flores da Mata Atlântica Brasileira uma cepa foi isolada e identificada como Rhodotorula sp. LEB-V10 e apresentou grande potencial para produção da enzima extracelular frutosiltransferase (FTase) - capaz de produzir FOS a partir da sacarose - sendo obtida apenas por precipitação com etanol (purificação parcial) direto do meio de cultivo livre de células, de acordo com estudos realizados previamente, a cinética entre a enzima imobilizada pura e a parcialmente purificada não apresentou diferenças significativas que justificassem etapas adicionais de purificação. Estudos anteriores selecionaram a adsorção em partículas do composto sólidoácido (Nb), uma liga formada por nióbio (~95%) e grafite (~5%) como metodologia sugerida para imobilização da FTase para produção de FOS. Dessa forma, este trabalho apresenta uma série de estudos de caracterização deste biocatalisador imobilizado. Após a imobilização, foi possível observar que além do pH de máxima atividade apresentado pela enzima livre (pH 4,5) um segundo ponto distinto de máxima atividade (25% menor que em pH 4,5) também foi observado, o pH 6,0 que demonstrou também ser uma condição de maior estabilidade térmica e também melhor condição de síntese com a enzima imobilizada. O estudo da termo-estabilidade revelou também que a imobilização induziu a formação de duas zonas de energias de ativação da desnaturação (Ead) diferenciadas: entre 47 e 51°C a enzima imobilizada é mais estável que a enzima livre e entre 52 e 70°C ela é menos estável. A incubação da FTase, imobilizada e livre, em 52°C por 15 min resultou numa ativação dos biocatalisadores, sendo mais pronunciada com a enzima imobilizada e em pH 4,5 apresentando um aumento de 1,8 vezes na atividade enzimática; no entanto, observou-se que esta ativação é momentânea e não acumulativa com outras metodologias como a liofilização; isto sugere que esta temperatura representa algum tipo de limite energético para a FTase que é um hetero-dímero e pode apresentar diversas interações com o nióbio. A otimização da síntese de FOS realizada pela aplicação da metodologia de planejamento experimental com a enzima imobilizada permitiu um aumento do rendimento (YFOS = 0,58) em 5%, uma redução no tempo de síntese (24 h) em 4 vezes e um aumento da produtividade (12,05 g/L.h) em 6 vezes. A adsorção da FTase ao nióbio demonstrou não utilizar os sítios ativos uma vez que, a adição da sacarose ao meio de dispersão para adsorção, não alterou o desempenho do biocatalisador, porém a adição de CuSO4 que é um forte estabilizador térmico para esta enzima, resultou num biocatalisador incapaz de produzir FOS. Tendo em vista a aplicação industrial da FTase, avaliou-se também os efeitos da liofilização sobre a enzima livre e imobilizada. Com a enzima livre a liofilização causou perda de atividade enzimática em função da densidade da solução de partida, mas, resultou num pó com até 6 vezes mais atividade por grama do que em relação à enzima livre não liofilizada; a adição individual de compostos crio-protetores apresentou maior efeito estabilizador do que em formulações. Com a enzima imobilizada, a liofilização não apresentou grandes diferenciações, observou-se de forma geral uma manutenção das características originais do imobilizado de partida. Todavia, uma importante diferenciação proveniente da liofilização foi observada tanto para a enzima livre quanto imobilizada: a cinética de produção de FOS, o rendimento foi aumentado em diferentes proporções mas, especialmente, foi observada uma elevada composição de GF4. Estudos mais específicos sobre a estrutura tridimensional forneceriam informações mais precisas sobre o efeito da liofilização. Adicionalemente, duas enzimas comerciais (inulinase e invertase) foram igualmente imobilizadas em nióbio, mas, não foram observadas alterações tão expressivas quanto às observadas com a FTase. Dessa forma, a imobilização da FTase em nióbio revela ser uma metodologia com grande potencial de aplicação em reatores. Como resultado deste trabalho, encontram-se publicados até o momento os Capítulos 2 e 4 e aceito para publicação o Capítulo 5 / Abstract: The production of fructooligosaccharides (FOS) - a prebiotic sugar with wide industrial application - from immobilized enzymes includes two modern concepts: industrial application of immobilized enzymes and functional food. A strain isolated from flowers from the Brazilian Atlantic Forest identified as Rhodotorula sp. LEB-V10 showed great potential for production of the extracellular fructosyltransferase (FTase), which is capable of producing FOS from sucrose. It can be recovered only by precipitation with ethanol (partial purification), directly from the cell-free culture medium. According to previous studies, the kinetics between purified and partially purified immobilized enzymes showed no significant differences that could justify additional purification steps. Other previous studies have selected the adsorption on particles of a solid-acid support (Nb) an alloy consisting of niobium (~95%) and graphite (~5%) as suggested methodology for the immobilization of FTase for FOS production. Thus, this work presents a series of characterization studies of this immobilized biocatalyst. After the immobilization, it was observed that besides the pH of maximum activity presented by the free enzyme (pH 4.5), a second distinct point of maximum activity (25% lower than at pH 4.5) was also observed, pH 6.0, wich was proved to be the best condition for thermal stability and also better for synthesis with the immobilized enzyme than pH 4.5. The study of thermal stability has also shown that immobilization induces the formation of two distinct phases with different denaturation activation energy (Ead): between 47 and 51°C, the immobilized enzyme is more stable than the free enzyme, and between 52 and 70°C it is less stable. Incubation of free and immobilized FTase at 52°C for 15 min resulted in enzymatic activation, being more pronounced with the immobilized enzyme at pH 4.5 with a 1.8-fold increase in enzyme activity. However, due to other studies carried out in this work, it has been shown that this activation is merely transient and not cumulative regarding other methodologies, indicating that this temperature is a kind of energetic threshold, and also because FTase is a hetero-dimer, which may lead to different interactions with the niobium support. The optimization of the synthesis of FOS carried out by applying the methodology of experimental design with the immobilized enzyme, allowing a yield increase (YFOS = 0.58) of 5%, a reduction in synthesis time (24 h) of 4 times and an increased productivity (12.05 g/L.h) of 6 times. The adsorption on niobium has shown not to involve the FTase active sites, since the addition of sucrose to the dispersion medium for adsorption did not affect the performance of the biocatalyst. On the other hand, the addition of CuSO4, which is a strong thermal stabilizing agent for this enzyme, resulted in a biocatalyst incapable of producing FOS. Considering the industrial application of FTase, it was also evaluated the effects of lyophilization over the free and immobilized enzyme. With the free enzyme, lyophilization caused loss of enzyme activity in dependence on the density of the starting solution, but in general, resulted in a powder with up to 6 times more activity per gram as compared to non-lyophilized free enzyme; the individual effects of cryo-protectants additives presented higher stabilizing effect than with the presence of other protectants. The lyophilization of the immobilized enzyme did not show drastic effects and it was observed, in general, the maintenance of the initial properties and characteristics before lyophilization. For both, free and immobilized enzyme was possible to observe significant changes in the kinetics of FOS production, the yield was increased in different proportions but, especially, there was a high composition of GF4, which was not observed before lyophilization. In addition, two commercial enzymes (inulinase and invertase) were immobilized on niobium but no significant changes were observed as those with FTase. Thus, the immobilization of FTase in niobium proves to have a big potential for application due to operational features. As a result of this work, two articles have been published (Chapters 2 and 4) and one has been accepted for publication (Chapter 5) / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutor em Engenharia de Alimentos

O presente trabalho consistiu na padronização do ratio, definido como a razão entre o teor de sólidos solúveis (SS) e a acidez titulável (AT), no processamento em escala piloto e no estudo da vida de prateleira (VP) de caldo de cana estocado sob refrigeração. Utilizando-se um delineamento central composto rotacional, com onze formulações de caldo de cana, investigou-se o ratio da formulação que resultou em melhor aceitação sensorial, em uma ampla faixa de SS (13,1 a 25,9 ºBrix) e de AT (0,02 a 0,09 % de ácido cítrico). Determinada a melhor formulação, processaram-se três lotes de caldo de cana padronizado (L1, L2 e L3). A estabilização da bebida foi baseada na seguinte combinação de métodos térmicos e não térmicos: acidificação, pasteurização (95 ºC/ 30 s), envase asséptico em garrafas de polietileno tereftalato (PET) e estocagem refrigerada. Testes físico-químicos, microbiológicos e enzimáticos, incluindo-se a determinação da atividade da peroxidase (POD) e da polifenoloxidase (PPO) foram realizados na bebida in natura e recém-processada (tempo zero da VP). Para o estudo da VP do caldo de cana padronizado pasteurizado, as amostras, em todos os lotes processados, foram fracionadas e estocadas nas temperaturas de 4, 8, 12 e -18 ºC (controle), na ausência de luz. A estimativa de VP do produto foi fundamentada em testes microbiológicos e sensoriais. A avaliação da estabilidade microbiológica baseou-se na enumeração de bactérias e fungos psicrotróficos. Testes de escala hedônica de nove pontos para avaliação da aparência e do sabor foram empregados na análise da estabilidade sensorial. As médias da aceitação sensorial para impressão global das onze formulações não apresentaram diferença estatística (p > 0,05) entre si, nas faixas de SS e AT estudadas. Verificou-se que apenas o efeito da AT foi significativo (p < 0,05) na aceitação da bebida. A formulação escolhida para a padronização do caldo de cana foi aquela com AT equivalente a 0,09 % (pH próximo a 3,9) e 19,5 ºBrix. Para o caldo de cana padronizado pasteurizado recém-processado, os valores de pH foram inferiores a 4,4 em L1, L2 e L3. As contagens de mesófilos não ultrapassaram 50 UFC/ mL, constatando-se a ausência de coliformes termotolerantes e Salmonella em todos os lotes processados. As médias das atividades de POD e PPO foram de 2,11 U/mL e 1,03 U/mL, respectivamente. As contagens de bactérias e fungos psicrotróficos não ultrapassaram 102 UFC/ mL. As médias dos tempos de VP estimadas para as frações dos lotes estocadas a 4, 8 e 12 ºC foram equivalentes a 71, 74 e 23 dias, respectivamente. Concluiu-se que o caldo de cana foi bem aceito pela equipe de provadores, em uma ampla faixa de SS e AT. A combinação dos métodos empregados na estabilização da bebida foi eficiente na redução da atividade enzimática e da contagem microbiana. Além disso, as temperaturas de 4 e 8 ºC mostraram-se efetivas na manutenção da estabilidade da bebida, satisfazendo a uma eventual demanda do mercado consumidor pela bebida processada. / The present study consisted in standardizing the total soluble solids (SS) and titratable acidity (TA) ratio, in small scale processing and in estimating the shelf-life (SL) of sugarcane juice stored under ideal, commercial and abusive temperature conditions. A central composite rotational design with eleven formulations of sugarcane juice was used to investigate the ratio of the formulation that resulted in the best sensory acceptance in a wide range of SS (13,1 a 25,9 ºBrix) and TA (0,02 a 0,09% citric acid). Found the best formulation, three batches of standardized sugarcane juice were processed (L1, L2 and L3). The juice´s stabilization was based on the following combination of thermal and non-thermal methods: acidification, pasteurization (95 °C/30 s), aseptic filling in polyethylene terephthalate (PET) bottles and refrigerated storage. Physico-chemical, microbiological and enzymatic tests, including the determination of the peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO) activities, were performed in the fresh and freshly processed (time zero of SL) juice. For the SL study, standardized pasteurized sugarcane juice samples were stored at temperatures of 4, 8, 12 and -18 °C (control), kept in the dark. The estimate of the product´s SL was based on microbiological and sensory tests. The evaluation of the microbiological stability was based on the psychrotrophic bacteria and fungi counts. Nine-point hedonic scale tests for appearance and flavor evaluation were used in order to assess the sensory stability. The mean values of sensory acceptance, for overall impression, of the eleven formulations showed no statistical difference (p > 0.05) among them. It was found that only the effect of TA was significant (p < 0.05). The chosen formulation for sugarcane juice standardization was that one with TA 0.09 % (pH near 3.9) and SS 19.5 ºBrix. For the freshly processed standardized pasteurized juice, the pH was less than 4.4 in L1, L2 and L3. The mesophilic counts did not exceed 50 CFU/mL. The presence of coliforms at 45 ºC and Salmonella was no confirmed. The average POD and PPO activities were 2.11 U/mL and 1.03 U/mL respectively. The psychrotrophic bacteria and fungi counts did not exceed 102 CFU/mL. The juice´s SL stored at 4, 8 and 12 °C were 71, 74 and 21 days, respectively. It was concluded that the juice was well accepted in a wide range of SS and TA, and the combination of methods was effective in reducing the enzyme activity and microbial counts. Moreover, temperatures of 4 and 8 °C were proved to be effective in maintaining the sugarcane juice´s quality for a period of time compatible with the consumer market demand.

As informações sobre a absorção de flavonóides ainda são muito controversas e na sua grande maioria os estudos foram realizados com O-heterosídeos, flavonóides bastante instáveis. Para o estudo de previsão de absorção de flavonóide foi utilizado a vicenina-2, que é um flavonóide C-heterosídeo, com atividade antinflamatório. A relação entre retenção-atividade (QRAR) usando a cromatografia micelar de biopartição (BMC) foi a técnica empregada para atingir tal objetivo. Os resultados deste método in vitro foram comparados com resultados obtidos em ensaios in vivo de permeação intestinal em ratos obtendo-se as mesmas taxas de absorção de 60%. A taxa de união a proteínas plasmáticas foi avaliada por eletroforese capilar (EC) e indicou uma relação entre estrutura-taxa de união a albumina (HSA). A presença ou a disponibilidade da hidroxila em C3 do anel C do flavonóide parece ser determinante para altas taxas de união a HSA, e as substituições no anel B não demonstraram importantes relações na taxa de união a HSA. No estudo de afinidade dos polifenólicos a proteínas plasmáticas totais verificou-se uma alteração de comportamento de ligação em relação a HSA de alguns compostos. Esse comportamento foi atribuído a uma degradação sérico pelas enzimas presentes no plasma ou pela competição pelos sítios de ligação dos compostos fenólicos com substâncias endógenas. Após a obtenção da informação de que a vicenina-2 é um flavonóide que possui absorção intestinal, foi possível desenvolver o extrato de Lychnophora ericoides com máxima extração de vicenina-2, utilizando delineamento fatorial. Esse delineamento estatístico mostrou-se eficiente para a obtenção de produto farmacêutico, utilizando um mínimo de experimentos. Nesses estudos, além do controle químico da presença de vicenina-2, estudos de genotoxicidade e atividade antinflamatória pela inibição da atividade sobre o óxido nítrico foram realizados e verificou-se que o extrato fluido padronizado, não possui atividade genotóxica e mantém a atividade antinflamatória, vista pela inibição da formação do NO. O extrato fluido padronizado com tais propriedades foi obtido com etanol 20° GL, 24 de maceração simples e proporção droga:solvente de 1:5. A secagem desse extrato, com o objetivo de melhorar a estabilidade e garantir propriedades tecnológicas adequadas, foi realizada por nebulização (spray dryer). O pó obtido foi avaliado e manteve suas propriedades. / Information on flavonoid absorption is still too controversial. Studies have been mostly carried out with O-heterosides, very unstable flavonoids. As for the study of flavonoid absorption forecast, vicenine-2 was used, which is a C-heteroside flavonoid with anti-inflammatory activity. The quantitative relationship retention-activity (QRAR) using biopartition micellar chromatography (BMC) was the technique used to achieve this purpose. The results of this method in vitro were compared with results obtained in tests in vivo of intestinal permeation with rats and the same 60% absorption rates were obtained. The linking rate to plasmatic proteins was evaluated by capillary electrophoresis (CE) and indicated a relation between structure-rate of linking to albumin (HSA). The presence or the availability of hydroxyl in C3 of the C ring of the flavonoid seems to be determinant for high linking rates to HSA and the replacements in the B ring did not show important relations in the linking rate to HSA. As for total plasmatic proteins, it was also possible to verify that flavonoid heteroside seem to undergo metabolism by enzymes present in the plasma. After obtaining the information that vicenin-2 is a flavonoid which has intestinal absorption, the development of an extract of Lychnophora ericoides enriched with vicenin-2 was possible, using factorial outlining. This statistical outlining showed to be efficient for obtaining a pharmaceutical product, using few experiments. In these studies, besides the chemical control of vicenin-2 presence, genotoxicity and anti-inflammatory (on nitric oxide (NO)) studies were carried out and it was verified that the standardized fluid extract does not have genotoxic activity and keeps the anti-inflammatory activity, that can be seen by the inhibition of NO formation. The standardized fluid extract with such properties was produced with ethanol 20 GL, 24 of simple maceration and ratio plant:solvent of 1:5. The drying process of this extract, with the purpose of improving stability and assuring adequate technological properties, was carried out by nebulization (spray dryer). The obtained result was evaluated and kept its properties.

As informações sobre a absorção de flavonóides ainda são muito controversas e na sua grande maioria os estudos foram realizados com O-heterosídeos, flavonóides bastante instáveis. Para o estudo de previsão de absorção de flavonóide foi utilizado a vicenina-2, que é um flavonóide C-heterosídeo, com atividade antinflamatório. A relação entre retenção-atividade (QRAR) usando a cromatografia micelar de biopartição (BMC) foi a técnica empregada para atingir tal objetivo. Os resultados deste método in vitro foram comparados com resultados obtidos em ensaios in vivo de permeação intestinal em ratos obtendo-se as mesmas taxas de absorção de 60%. A taxa de união a proteínas plasmáticas foi avaliada por eletroforese capilar (EC) e indicou uma relação entre estrutura-taxa de união a albumina (HSA). A presença ou a disponibilidade da hidroxila em C3 do anel C do flavonóide parece ser determinante para altas taxas de união a HSA, e as substituições no anel B não demonstraram importantes relações na taxa de união a HSA. No estudo de afinidade dos polifenólicos a proteínas plasmáticas totais verificou-se uma alteração de comportamento de ligação em relação a HSA de alguns compostos. Esse comportamento foi atribuído a uma degradação sérico pelas enzimas presentes no plasma ou pela competição pelos sítios de ligação dos compostos fenólicos com substâncias endógenas. Após a obtenção da informação de que a vicenina-2 é um flavonóide que possui absorção intestinal, foi possível desenvolver o extrato de Lychnophora ericoides com máxima extração de vicenina-2, utilizando delineamento fatorial. Esse delineamento estatístico mostrou-se eficiente para a obtenção de produto farmacêutico, utilizando um mínimo de experimentos. Nesses estudos, além do controle químico da presença de vicenina-2, estudos de genotoxicidade e atividade antinflamatória pela inibição da atividade sobre o óxido nítrico foram realizados e verificou-se que o extrato fluido padronizado, não possui atividade genotóxica e mantém a atividade antinflamatória, vista pela inibição da formação do NO. O extrato fluido padronizado com tais propriedades foi obtido com etanol 20° GL, 24 de maceração simples e proporção droga:solvente de 1:5. A secagem desse extrato, com o objetivo de melhorar a estabilidade e garantir propriedades tecnológicas adequadas, foi realizada por nebulização (spray dryer). O pó obtido foi avaliado e manteve suas propriedades. / Information on flavonoid absorption is still too controversial. Studies have been mostly carried out with O-heterosides, very unstable flavonoids. As for the study of flavonoid absorption forecast, vicenine-2 was used, which is a C-heteroside flavonoid with anti-inflammatory activity. The quantitative relationship retention-activity (QRAR) using biopartition micellar chromatography (BMC) was the technique used to achieve this purpose. The results of this method in vitro were compared with results obtained in tests in vivo of intestinal permeation with rats and the same 60% absorption rates were obtained. The linking rate to plasmatic proteins was evaluated by capillary electrophoresis (CE) and indicated a relation between structure-rate of linking to albumin (HSA). The presence or the availability of hydroxyl in C3 of the C ring of the flavonoid seems to be determinant for high linking rates to HSA and the replacements in the B ring did not show important relations in the linking rate to HSA. As for total plasmatic proteins, it was also possible to verify that flavonoid heteroside seem to undergo metabolism by enzymes present in the plasma. After obtaining the information that vicenin-2 is a flavonoid which has intestinal absorption, the development of an extract of Lychnophora ericoides enriched with vicenin-2 was possible, using factorial outlining. This statistical outlining showed to be efficient for obtaining a pharmaceutical product, using few experiments. In these studies, besides the chemical control of vicenin-2 presence, genotoxicity and anti-inflammatory (on nitric oxide (NO)) studies were carried out and it was verified that the standardized fluid extract does not have genotoxic activity and keeps the anti-inflammatory activity, that can be seen by the inhibition of NO formation. The standardized fluid extract with such properties was produced with ethanol 20 GL, 24 of simple maceration and ratio plant:solvent of 1:5. The drying process of this extract, with the purpose of improving stability and assuring adequate technological properties, was carried out by nebulization (spray dryer). The obtained result was evaluated and kept its properties.

O presente trabalho consistiu na padronização do ratio, definido como a razão entre o teor de sólidos solúveis (SS) e a acidez titulável (AT), no processamento em escala piloto e no estudo da vida de prateleira (VP) de caldo de cana estocado sob refrigeração. Utilizando-se um delineamento central composto rotacional, com onze formulações de caldo de cana, investigou-se o ratio da formulação que resultou em melhor aceitação sensorial, em uma ampla faixa de SS (13,1 a 25,9 ºBrix) e de AT (0,02 a 0,09 % de ácido cítrico). Determinada a melhor formulação, processaram-se três lotes de caldo de cana padronizado (L1, L2 e L3). A estabilização da bebida foi baseada na seguinte combinação de métodos térmicos e não térmicos: acidificação, pasteurização (95 ºC/ 30 s), envase asséptico em garrafas de polietileno tereftalato (PET) e estocagem refrigerada. Testes físico-químicos, microbiológicos e enzimáticos, incluindo-se a determinação da atividade da peroxidase (POD) e da polifenoloxidase (PPO) foram realizados na bebida in natura e recém-processada (tempo zero da VP). Para o estudo da VP do caldo de cana padronizado pasteurizado, as amostras, em todos os lotes processados, foram fracionadas e estocadas nas temperaturas de 4, 8, 12 e -18 ºC (controle), na ausência de luz. A estimativa de VP do produto foi fundamentada em testes microbiológicos e sensoriais. A avaliação da estabilidade microbiológica baseou-se na enumeração de bactérias e fungos psicrotróficos. Testes de escala hedônica de nove pontos para avaliação da aparência e do sabor foram empregados na análise da estabilidade sensorial. As médias da aceitação sensorial para impressão global das onze formulações não apresentaram diferença estatística (p > 0,05) entre si, nas faixas de SS e AT estudadas. Verificou-se que apenas o efeito da AT foi significativo (p < 0,05) na aceitação da bebida. A formulação escolhida para a padronização do caldo de cana foi aquela com AT equivalente a 0,09 % (pH próximo a 3,9) e 19,5 ºBrix. Para o caldo de cana padronizado pasteurizado recém-processado, os valores de pH foram inferiores a 4,4 em L1, L2 e L3. As contagens de mesófilos não ultrapassaram 50 UFC/ mL, constatando-se a ausência de coliformes termotolerantes e Salmonella em todos os lotes processados. As médias das atividades de POD e PPO foram de 2,11 U/mL e 1,03 U/mL, respectivamente. As contagens de bactérias e fungos psicrotróficos não ultrapassaram 102 UFC/ mL. As médias dos tempos de VP estimadas para as frações dos lotes estocadas a 4, 8 e 12 ºC foram equivalentes a 71, 74 e 23 dias, respectivamente. Concluiu-se que o caldo de cana foi bem aceito pela equipe de provadores, em uma ampla faixa de SS e AT. A combinação dos métodos empregados na estabilização da bebida foi eficiente na redução da atividade enzimática e da contagem microbiana. Além disso, as temperaturas de 4 e 8 ºC mostraram-se efetivas na manutenção da estabilidade da bebida, satisfazendo a uma eventual demanda do mercado consumidor pela bebida processada. / The present study consisted in standardizing the total soluble solids (SS) and titratable acidity (TA) ratio, in small scale processing and in estimating the shelf-life (SL) of sugarcane juice stored under ideal, commercial and abusive temperature conditions. A central composite rotational design with eleven formulations of sugarcane juice was used to investigate the ratio of the formulation that resulted in the best sensory acceptance in a wide range of SS (13,1 a 25,9 ºBrix) and TA (0,02 a 0,09% citric acid). Found the best formulation, three batches of standardized sugarcane juice were processed (L1, L2 and L3). The juice´s stabilization was based on the following combination of thermal and non-thermal methods: acidification, pasteurization (95 °C/30 s), aseptic filling in polyethylene terephthalate (PET) bottles and refrigerated storage. Physico-chemical, microbiological and enzymatic tests, including the determination of the peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO) activities, were performed in the fresh and freshly processed (time zero of SL) juice. For the SL study, standardized pasteurized sugarcane juice samples were stored at temperatures of 4, 8, 12 and -18 °C (control), kept in the dark. The estimate of the product´s SL was based on microbiological and sensory tests. The evaluation of the microbiological stability was based on the psychrotrophic bacteria and fungi counts. Nine-point hedonic scale tests for appearance and flavor evaluation were used in order to assess the sensory stability. The mean values of sensory acceptance, for overall impression, of the eleven formulations showed no statistical difference (p > 0.05) among them. It was found that only the effect of TA was significant (p < 0.05). The chosen formulation for sugarcane juice standardization was that one with TA 0.09 % (pH near 3.9) and SS 19.5 ºBrix. For the freshly processed standardized pasteurized juice, the pH was less than 4.4 in L1, L2 and L3. The mesophilic counts did not exceed 50 CFU/mL. The presence of coliforms at 45 ºC and Salmonella was no confirmed. The average POD and PPO activities were 2.11 U/mL and 1.03 U/mL respectively. The psychrotrophic bacteria and fungi counts did not exceed 102 CFU/mL. The juice´s SL stored at 4, 8 and 12 °C were 71, 74 and 21 days, respectively. It was concluded that the juice was well accepted in a wide range of SS and TA, and the combination of methods was effective in reducing the enzyme activity and microbial counts. Moreover, temperatures of 4 and 8 °C were proved to be effective in maintaining the sugarcane juice´s quality for a period of time compatible with the consumer market demand.

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos. / Microbiological assays have been used to evaluate antimicrobial activity since the discovery of the first antibiotics. Despite of microbiological assays have been widely employed to determine antibiotic potency of pharmaceutical dosage forms, once they provide a measure of biological activity, they have limitations regarding the low reproducibility and increased time of analysis. The aim of this work is to develop, optimize and validate a rapid colorimetric microplate bioassay for the potency of neomycin and bacitracin in pharmaceutical drug products. Factorial and response surface methodologies were used in the development and optimization of the choice of microorganism, culture medium composition, amount of inoculum, triphenyltetrazolium chloride (TTC) concentration and antibiotic concentration. The optimized bioassays methods were validated by the assessment of linearity, precision, accuracy, and robustness. Statistical analysis showed equivalency between agar diffusion microbiological assays and rapid colorimetric microplate bioassays. In addition, microplate bioassay had advantages concerning the reproducibility, sensitivity of response, time of incubation, and amount of culture medium and solutions required.

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos. / Microbiological assays have been used to evaluate antimicrobial activity since the discovery of the first antibiotics. Despite of microbiological assays have been widely employed to determine antibiotic potency of pharmaceutical dosage forms, once they provide a measure of biological activity, they have limitations regarding the low reproducibility and increased time of analysis. The aim of this work is to develop, optimize and validate a rapid colorimetric microplate bioassay for the potency of neomycin and bacitracin in pharmaceutical drug products. Factorial and response surface methodologies were used in the development and optimization of the choice of microorganism, culture medium composition, amount of inoculum, triphenyltetrazolium chloride (TTC) concentration and antibiotic concentration. The optimized bioassays methods were validated by the assessment of linearity, precision, accuracy, and robustness. Statistical analysis showed equivalency between agar diffusion microbiological assays and rapid colorimetric microplate bioassays. In addition, microplate bioassay had advantages concerning the reproducibility, sensitivity of response, time of incubation, and amount of culture medium and solutions required.