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Estudo do efeito do inibidor da enzima adenosina desaminase, EHNA, sobre a enterite induzida pela toxina a do Clostridium difficile em alça ileal isolada de camundongos / The effect of the adenosine deaminase inhibitor, EHNA, on Clostridium difficile toxin-A-induced enteritis in murine ileal loopsJunqueira, Ana Flávia Torquato de Araújo January 2008 (has links)
JUNQUEIRA, Ana Flávia Torquato de Araújo. Estudo do efeito do inibidor da enzima adenosina desaminase, EHNA, sobre a enterite induzida pela toxina a do Clostridium difficile em alça ileal isolada de camundongos. Fortaleza, 2008. 141 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-05T14:24:00Z
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Previous issue date: 2008 / The main factor of virulence in Clostridium difficile is toxin A (TxA), which can induce inflammation and acute tissue injury in the bowels of animals and humans affected by this organism. The high concentration of adenosine generated upon injury produces a number of antiinflammatory effects limited by rapid degradation by adenosine deaminase. The objective of this study was to determine the effect of EHNA (erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-adenine) inhibition of adenosine deaminase upon TxA-induced ileal loop enteritis in mice. EHNA (90 μmol/kg) or PBS was injected i.p. 30 minutes prior to TxA (10-100 μg) or PBS instillation into the ligated ileal loop. The animals were euthanized 3 hours after enteritis induction and the ileal loops were retrieved for analysis. The weight/length ratio and the secretion volume/length ratio were calculated and tissue samples were submitted to histopathological study, myeloperoxidase assay (MPO), measurement of TNF-α, IL-1β and IL-10 levels with ELISA, immunohistochemical tests for TNF-α, IL-1β, inducible NOS and PTX3, and PCR assay for TNF-α, IL-1β and PTX3. The instillation of TxA (10-100 μg) into the ileal loop significantly increased (p<0.05) the weight/length ratio and the secretion volume/length ratio with consistent results above 50 μg. TxA induced a significant amount (p<0.05) of histological damage, edema and inflammatory cell infiltration and increased the production of TNF-α, IL-1β, iNOS and PTX3. All changes were significantly reverted by treatment with EHNA (p<0.05). Moreover, IL-10 levels remained unchanged in animals treated with TxA, but increased in animals receiving EHNA. In conclusion, in mice with TxA-induced enteritis EHNA produced considerable antiinflammatory effects, reducing tissue injury, neutrophil migration, the expression and levels of proinflammatory cytokines (TNF-α and IL-1β) and producing an increase in IL-10 levels. In addition, TxA instillation increased PTX3 expression and the number of cells immunolabeled for iNOS in the ileal tissue, both of which were reverted by EHNA. / O Clostridium difficile tem como principal fator de virulência a toxina A (TxA), a qual provoca inflamação e destruição tecidual aguda em intestinos de animais experimentais e de pacientes com a doença induzida por esta bactéria. Em locais de injúria tecidual, adenosina é produzida em altas concentrações, onde exerce uma série de efeitos antiinflamatórios, limitados por sua rápida degradação pela enzima adenosina desaminase. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da inibição da enzima adenosina desaminase pelo EHNA (eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil)-adenina) sobre a enterite induzida pela TxA do C. difficile em alça ileal de camundongos. Para isto, injetamos EHNA (90 μmol/kg) ou PBS i.p. 30 minutos antes da administração de TxA (10 a 100 μg) ou PBS na alça ileal isolada. Os animais foram sacrificados 3 horas depois da indução da enterite e as alças foram retiradas para estudo. As razões peso/comprimento da alça e volume de secreção/comprimento da alça foram calculadas e amostras de tecido foram coletadas para histopatologia, dosagem de atividade de mieloperoxidase (MPO), dosagem de TNF-α, IL-1β e IL-10 por ELISA, imunohistoquímica para TNF-α, IL-1β, NOS induzível e PTX3, e PCR para TNF-α, IL-1β e PTX3. A injeção de TxA (10 a 100 μg) nas alças ileais aumentou significativamente (p<0,05) as razões peso/comprimento da alça e volume de secreção/comprimento da alça com resultados consistentes a partir de 50 μg. A TxA promoveu significativa (p<0,05) destruição tecidual, edema, infiltração de células inflamatórias, aumento das citocinas TNF-α e IL-1β, e elevação de iNOS e PTX3. Todos esses parâmetros foram significativamente revertidos com o uso do EHNA (p<0,05). Em adição, a TxA não alterou os níveis de IL-10 em relação ao controle, mas o pré-tratamento com EHNA promoveu uma elevação nos níveis desta citocina. Assim, concluímos que na enterite induzida pela TxA em camundongos o EHNA demonstrou um potente efeito antiinflamatório, reduzindo consideravelmente a lesão tecidual, a migração neutrofílica, a expressão e os níveis de citocinas próinflamatórias (TNF-α, IL-1β) e produzindo um aumento nos níveis de IL-10. Além disso, a administração de TxA induziu um aumento na expressão da proteína PTX3 e no número de células imunomarcadas para iNOS no tecido ileal, ambos revertidos pelo EHNA.
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Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral no Brasil de 2001 a 2011, no estado do Ceará de 2007 a 2011 e perfil da adenosina desaminase em pacientes acometidos pela doençaCavalcante, Ítalo José Mesquita January 2014 (has links)
CAVALCANTE, Í. J. M. Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral no Brasil de 2001 a 2011, no estado do Ceará de 2007 a 2011 e perfil da adenosina desaminase em pacientes acometidos pela doença. 2014. 187 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-11-19T13:51:36Z
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Previous issue date: 2014 / Introduction: Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by protozoa of the genus Leishmania and transmitted by sandflies. Brazil is one of the most important endemic areas for the disease, being necessary monitoring of the occurrence of the disease through active epidemiological surveillance. Adenosine deaminase (ADA) is an enzyme that catalyzes the deamination of adenosine to produce inosine and ammonia. In humans, it is present as two isoenzymes and three isoforms (ADA1, ADA2 and ADA1-CD26) and is pivotal to immune system function, since ADA1’s genetic deficiency causes a severe combined immunodeficiency (SCID), as well as HIV is able to promote a decrease in the count of T lymphocytes via interaction with ADA1-CD26. Objectives: To describe the epidemiology of VL in Brazil (2001-2011) and Ceará (2007-2011); and the ADA activity in patients suffering from VL. Methods: We conducted an observational descriptive study of VL in Brazil and in the state of Ceará using secondary data provided by SINAN/MS, being categorized the transmission areas, age, sex and education of cases, incidence, prevalence and evolution of disease, co-infection HIV-VL and cases among pregnant women. The ADA and its isoenzymes were determined in plasma of patients suffering from LV using the method of Giusti, EHNA and electrophoresis. The cutoff values for the ADA were determined using the ROC curve. Results: VL is endemic in Brazil and is present in 26 of 27 states, with an annual average of ~ 3,600 cases, incidence of ~1.79 cases/100.000 inhabitants and prevalence of ~1.96 cases/100.000 inhabitants. In Ceará, it is present in ~88 % of the municipalities, with an annual average of ~ 600 cases, incidence of 6.1 cases/100.000 inhabitants and prevalence of 7.1 cases/100.000 inhabitants. The ADA activity is significantly increased in LV, with an average activity of 106.8 ± 4.5 U / L (vs. control 21.1 ± 0.6 U / L). This increase occurs with both isoenzymes, but the ADA2 is the major isoenzyme present in patients suffering from LV, with a cutoff value of 47.6 U / L for total ADA activity and 29.6 U/L for ADA2 activity, using adenosine. Conclusion: LV is an endemic disease present in all Brazilian states, with the exception of Acre. The states of Ceará, Maranhão and Minas Gerais had the highest number of cases and the state of Tocantins a higher incidence and prevalence. Ceará is an endemic area for VL and the city of Fortaleza is the municipality that the highest number of cases in the country. ADA can be used as a marker of the inflammatory response in VL, and the determination of isoenzyme ADA2 can be used to evaluate the activation or participation of monocytes and macrophages in the infectious process. / Introdução: A leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada por protozoários do gênero Leishmania e transmitida por insetos flebotomíneos. O Brasil é uma das mais importantes áreas endêmicas para a doença, sendo necessário o acompanhamento da ocorrência dos casos através de uma vigilância epidemiológica ativa. A adenosina desaminase (ADA) é uma enzima que catalisa a desaminação da adenosina produzindo inosina e amônia. Em humanos, está presente como duas isoenzimas e três isoformas (ADA1, ADA1-CD26 e ADA2), sendo fundamental para o funcionamento do sistema imunológico, uma vez que a deficiência genética da ADA1 provoca uma imunodeficiência severa e combinada (SCID), bem como o vírus HIV é capaz de promover uma diminuição na contagem dos linfócitos T via interação com a ADA1-CD26. Objetivos: Descrever o perfil epidemiológico da LV no Brasil (de 2001 a 2011) e no Ceará (de 2007 a 2011), bem como a atividade de ADA em pacientes acometidos pela LV. Metodologia: Realizou-se um estudo observacional descritivo da LV no Brasil e no estado do Ceará utilizando os dados secundários disponibilizados pelo SINAN/MS, sendo categorizadas as áreas de transmissão; faixa etária, sexo e escolaridade dos casos; incidência, prevalência e evolução da doença; co-infecção HIV-LV e casos em gestantes. A ADA e suas isoenzimas foram determinadas em plasma de pacientes acometidos por LV utilizando o método de Giusti, EHNA e por eletroforese. Os valores de cutoff para a ADA foram determinados utilizando a curva ROC. Resultados: A LV é endêmica no Brasil, presente em 26 dos 27 estados, com uma média anual de ~3.600 casos, incidência de ~1,79 casos/100.000hab e prevalência de ~1,96 casos/100.000hab. No Ceará, está presente em ~88% dos municípios, com média anual de ~600 casos, incidência de 6,1casos/100.000hab e prevalência de 7,1casos/100.000hab. A ADA está significativamente aumentada na LV, com uma atividade média de 106,8±4,5U/L (vs controle 21,1±0,6U/L). Este aumento ocorre com ambas isoenzimas, contudo a ADA2 é a principal isoenzima presente em pacientes acometidos por LV, com um valor de cutoff de 47,6 U/L para ADA total e 29,6U/L para a ADA2, utilizando adenosina. Conclusão: A LV é uma doença endêmica presente em todos os estados brasileiros, a exceção do Acre. Os estados do Ceará, Maranhão e Minas Gerais apresentaram a maior quantidade de casos e o estado de Tocantins a maior incidência e prevalência. O Ceará é uma área endêmica para a LV e a cidade de Fortaleza é o município que registrou a maior quantidade de casos no país. A ADA pode ser utilizada como um marcador da resposta inflamatória na LV, e a determinação da isoenzima ADA2 pode ser utilizada para avaliar a ativação ou participação de monócitos e macrófagos no processo infeccioso.
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Estudo do efeito de um novo agonista do receptor A2A de adenosina, ATL313, sobre a enterite induzida pela toxina a do clostridium difficile em alça ileal isolada de camundongos / Study of a new adenosine receptor A2A agonist, ATL313, on Clostridium difficile toxin A-induced enteritis in ileal pouch isolated of miceCavalcante, Ingrid Chaves January 2005 (has links)
CAVALCANTE, Ingrid Chaves. Estudo do efeito de um novo agonista do receptor A2A de adenosina, ATL313, sobre a enterite induzida pela toxina A do clostridium difficile em alça ileal isolada de camundongos. 2005. 107 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-04-04T13:08:00Z
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Previous issue date: 2005 / C. difficile toxin A (TxA) plays an important pathogenic role in antibiotic-induced diarrhea and pseudomembranous colitis, a condition characterized by intense mucosal inflammation and secretion. Agonist activity at A2A adenosine receptors (A2A ARs) attenuates inflammation and damage in many tissues. This study evaluated the effect of a new selective A2A AR agonist (4-{3-[6-amino-9-(5-cyclopropylcarbamoyl-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-9H-purin-2-yl]prop-2-ynyl}piperidine-1-carboxylic acid methyl ester; ATL313) on TxA-induced enteritis in murine ileal loops. ATL313 (0.05-5 nM) and/or the A2A AR antagonist (ZM241385; 5 nM) or PBS were injected inside ileal loops immediately prior to challenge with TxA (1-10 mg/loop) or PBS. Intestinal fluid volume/length and weight/length ratios were calculated 3 h later. Ileal tissue samples were collected for measurement of myeloperoxidase (MPO) content, evaluation of ADA activity, for histopathology and apoptotic immunohistochemistry (ApopTagâ) and for assessment of TNF-α levels by ELISA. TxA (1-10 µg/loop) significantly (p<0.05) increased volume/length and weight/length, reaching maximum values at 5µg/loop dosage. ATL313 (5 nM) treatment significantly (p<0.05) reduced TxA-induced volume/length and weight/length, as well as prevented mucosal disruption and TxA-induced apoptosis. These protective effects were reversed by ZM241385 (5 nM), the A2A AR antagonist. ATL313 (5 nM) also reduced neutrophil infiltration, as measured by MPO content; reduced the toxin A-induced increase in ADA activity. Prior to the challenge with TxA, a systemic injection of fucoidin, but not PBS, also reduced tissue destruction and toxin A-induced increase in ADA activity. In conclusion, the A2A AR agonist ATL313 has a great antiinflammatory effect in TxA-induced mice enteritis, significantly reducing tissue destruction and ADA activity. In addition, our data suggested that TxA-induced increase in ADA activity and tissue damage in murine ileal loops are related to the neutrophil infiltration induced by this toxin. / A toxina A do Clostridium difficile (TxA) desempenha um importante papel na patogênese da diarréia induzida por antibióticos e na colite pseudomembranosa, uma condição caracterizada por intensa secreção e inflamação da mucosa. A estimulação de receptores A2A da adenosina reduz a inflamação e o dano tecidual. Neste estudo, avaliou-se o efeito de um novo agonista seletivo para receptores A2A da adenosina (metil éster do ácido 4-{3-[6-amino-9-(5-ciclopropilcarbamoil-3,4- dihidroxitetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-2-il]prop-2-inil}piperidina-1-carboxílico; ATL313) na enterite induzida pela TxA em alças ileais de camundongos. O ATL313 (0,05-5 nM) e/ou o antagonista dos receptores A2A da adenosina (ZM241385; 5 nM) ou PBS foram injetados em alças ileais imediatamente antes da injeção de TxA (1-10 µg/alça) ou PBS. As razões volume de secreção/comprimento da alça e peso/comprimento da alça foram calculadas 3h depois. Amostras de tecido foram coletadas para dosagem de atividade de mieloperoxidade (MPO), atividade de ADA, histopatologia, imunohistoquímica para apoptose (ApopTag_) e dosagem de TNF-a_ por ELISA. A injeção de TxA (1-10 µg) nas alças ileais aumentou significativamente (p<0,05) as razões volume de secreção/comprimento da alça e peso/comprimento da alça com pico em 5µg. O tratamento das alças com ATL313 (5 nM) reduziu significativamente (p<0,05) a secreção e o edema, preveniu a destruição da mucosa e a apoptose induzidos por TxA. Tais efeitos protetores foram revertidos pelo antagonista dos receptores A2A de adenosina, o ZM241385 (5 nM). O tratamento com ATL313 (5 nM), reduziu ainda a infiltração neutrofílica, avaliada pela dosagem de MPO, e reduziu o aumento da atividade de ADA induzidos pela TxA, bem como a dosagem de TNF-a no tecido das alças ileais. O pré-tratamento sistêmico com fucoidina, mas não com PBS, também reduziu o dano na mucosa e atividade de ADA no tecido das alças ileais tratadas com TxA. Assim, conclui-se que na enterite induzida pela TxA em camundongos, o agonista dos receptores A2A da adenosina (ATL313) possui um potente efeito antiinflamatório, reduzindo consideravelmente a lesão tecidual e a atividade de ADA. Nossos resultados também indicam que o aumento da atividade de ADA e o dano tecidual induzido pela TxA em alça ileal de camundongos está relacionado com a infiltração neutrofílica induzida por esta toxina.
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Adenosina deaminase no diagnóstico de rejeição aguda após o transplante renal Ana Lúcia LiviLivi, Ana Lúcia January 1999 (has links)
O transplante renal representa atualmente a melhor opção terapêutica e de reabilitação para o paciente com insuficiência renal crônica terminal. As rejeições são as principais causas de perda dos rins transplantados e, entre essas, as rejeições agudas são as que apresentam maior relevância clínica. Desta maneira, a monitorização do transplante renal com vistas ao diagnóstico precoce da rejeição e seu rápido tratamento é de grande relevância no manejo adequado desses pacientes. Como a rejeição celular aguda é mediada predominantemente por linfócitos T e, visto que, a enzima adenosina deaminase (ADA) é encontrada principalmente, a nível de sangue periférico, em linfócitos, objetivou-se com esse estudo, verificar a possível associação entre atividade sérica da ADA e a rejeição aguda do enxerto renal. Buscou-se, também, determinar a sua utilidade como método diagnóstico de rejeição celular aguda. Foram acompanhados até 1 mês de internação 35 pacientes transplantados renais. Dosagens da atividade de ADA sérica foram feitas cinco vezes por semana e sempre que houvesse suspeita clínica de rejeição aguda. O diagnóstico de rejeição aguda foi estabelecido por 2 nefrologistas, aos quais foram omitidos os resultados dos níveis séricos ADA. Estes médicos tinham todas informações clínicas e laboratoriais, incluindo valores séricos de creatinina e ciclosporina, cintilografias, ecografias, citologia aspirativa, punção biópsia renal quando esta era realizada e resposta aos diferentes tratamentos imunossupressores usados. A análise estatística foi feita utilizando-se testes de Mann-Whitney e Qui-quadrado. O nível p menor do que 0,05 foi considerado como significativo. A mediana dos episódios de rejeição celular aguda ficou entre o sexto e sétimo dia pós-transplante, havendo diferença estatisticamente significativa nos valores de ADA no sexto dia de seguimento entre os pacientes com rejeição (60.16), em relação aos que não tiveram rejeição celular aguda (24,55) (p=0,021 MW). Para se avaliar a eficácia da atividade sérica de ADA com método diagnóstico de rejeição aguda, empregou-se pontos de corte de valores de ADA>35,>40,>45, >50 e > que 30% dos valores do período pré-rejeição. Houve associação estatisticamente significativa entre ADA>30% e rejeição celular aguda (p=0.035 MW). Verificou-se, também, aumento significativos da atividade sérica de ADA em pacientes anti-HCV positivos e com necrose tubular aguda, sem interferência sobre os resultados dos episódios de rejeição celular aguda. Usando esses pontos de corte como parâmetros de diagnóstico para rejeição aguda observou-se: sensibilidade = 55,5%, especificidade = 82,3%, valor preditivo positivo = 76,9%, valor preditivo negativo = 63,6% e acurácia = 69,0%. Conclui-se que há um aumento significativo da atividade sérica da ADA durante os episódios de rejeição aguda de enxertos renais humanos, encontrando-se associação significativa entre o aumento de 30% dos valores de ADA pré-rejeição e o diagnóstico de rejeição celular aguda.
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Mapeamento do padrão de expressão tecidual dos genes relacionados à adenosina deaminase e caracterização cinética da atividade de desaminação da adenosina em cérebro de zebrafish (Danio rerio)Rosemberg, Denis Broock January 2008 (has links)
O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.
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Mapeamento do padrão de expressão tecidual dos genes relacionados à adenosina deaminase e caracterização cinética da atividade de desaminação da adenosina em cérebro de zebrafish (Danio rerio)Rosemberg, Denis Broock January 2008 (has links)
O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.
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Adenosina deaminase no diagnóstico de rejeição aguda após o transplante renal Ana Lúcia LiviLivi, Ana Lúcia January 1999 (has links)
O transplante renal representa atualmente a melhor opção terapêutica e de reabilitação para o paciente com insuficiência renal crônica terminal. As rejeições são as principais causas de perda dos rins transplantados e, entre essas, as rejeições agudas são as que apresentam maior relevância clínica. Desta maneira, a monitorização do transplante renal com vistas ao diagnóstico precoce da rejeição e seu rápido tratamento é de grande relevância no manejo adequado desses pacientes. Como a rejeição celular aguda é mediada predominantemente por linfócitos T e, visto que, a enzima adenosina deaminase (ADA) é encontrada principalmente, a nível de sangue periférico, em linfócitos, objetivou-se com esse estudo, verificar a possível associação entre atividade sérica da ADA e a rejeição aguda do enxerto renal. Buscou-se, também, determinar a sua utilidade como método diagnóstico de rejeição celular aguda. Foram acompanhados até 1 mês de internação 35 pacientes transplantados renais. Dosagens da atividade de ADA sérica foram feitas cinco vezes por semana e sempre que houvesse suspeita clínica de rejeição aguda. O diagnóstico de rejeição aguda foi estabelecido por 2 nefrologistas, aos quais foram omitidos os resultados dos níveis séricos ADA. Estes médicos tinham todas informações clínicas e laboratoriais, incluindo valores séricos de creatinina e ciclosporina, cintilografias, ecografias, citologia aspirativa, punção biópsia renal quando esta era realizada e resposta aos diferentes tratamentos imunossupressores usados. A análise estatística foi feita utilizando-se testes de Mann-Whitney e Qui-quadrado. O nível p menor do que 0,05 foi considerado como significativo. A mediana dos episódios de rejeição celular aguda ficou entre o sexto e sétimo dia pós-transplante, havendo diferença estatisticamente significativa nos valores de ADA no sexto dia de seguimento entre os pacientes com rejeição (60.16), em relação aos que não tiveram rejeição celular aguda (24,55) (p=0,021 MW). Para se avaliar a eficácia da atividade sérica de ADA com método diagnóstico de rejeição aguda, empregou-se pontos de corte de valores de ADA>35,>40,>45, >50 e > que 30% dos valores do período pré-rejeição. Houve associação estatisticamente significativa entre ADA>30% e rejeição celular aguda (p=0.035 MW). Verificou-se, também, aumento significativos da atividade sérica de ADA em pacientes anti-HCV positivos e com necrose tubular aguda, sem interferência sobre os resultados dos episódios de rejeição celular aguda. Usando esses pontos de corte como parâmetros de diagnóstico para rejeição aguda observou-se: sensibilidade = 55,5%, especificidade = 82,3%, valor preditivo positivo = 76,9%, valor preditivo negativo = 63,6% e acurácia = 69,0%. Conclui-se que há um aumento significativo da atividade sérica da ADA durante os episódios de rejeição aguda de enxertos renais humanos, encontrando-se associação significativa entre o aumento de 30% dos valores de ADA pré-rejeição e o diagnóstico de rejeição celular aguda.
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Adenosina deaminase no diagnóstico de rejeição aguda após o transplante renal Ana Lúcia LiviLivi, Ana Lúcia January 1999 (has links)
O transplante renal representa atualmente a melhor opção terapêutica e de reabilitação para o paciente com insuficiência renal crônica terminal. As rejeições são as principais causas de perda dos rins transplantados e, entre essas, as rejeições agudas são as que apresentam maior relevância clínica. Desta maneira, a monitorização do transplante renal com vistas ao diagnóstico precoce da rejeição e seu rápido tratamento é de grande relevância no manejo adequado desses pacientes. Como a rejeição celular aguda é mediada predominantemente por linfócitos T e, visto que, a enzima adenosina deaminase (ADA) é encontrada principalmente, a nível de sangue periférico, em linfócitos, objetivou-se com esse estudo, verificar a possível associação entre atividade sérica da ADA e a rejeição aguda do enxerto renal. Buscou-se, também, determinar a sua utilidade como método diagnóstico de rejeição celular aguda. Foram acompanhados até 1 mês de internação 35 pacientes transplantados renais. Dosagens da atividade de ADA sérica foram feitas cinco vezes por semana e sempre que houvesse suspeita clínica de rejeição aguda. O diagnóstico de rejeição aguda foi estabelecido por 2 nefrologistas, aos quais foram omitidos os resultados dos níveis séricos ADA. Estes médicos tinham todas informações clínicas e laboratoriais, incluindo valores séricos de creatinina e ciclosporina, cintilografias, ecografias, citologia aspirativa, punção biópsia renal quando esta era realizada e resposta aos diferentes tratamentos imunossupressores usados. A análise estatística foi feita utilizando-se testes de Mann-Whitney e Qui-quadrado. O nível p menor do que 0,05 foi considerado como significativo. A mediana dos episódios de rejeição celular aguda ficou entre o sexto e sétimo dia pós-transplante, havendo diferença estatisticamente significativa nos valores de ADA no sexto dia de seguimento entre os pacientes com rejeição (60.16), em relação aos que não tiveram rejeição celular aguda (24,55) (p=0,021 MW). Para se avaliar a eficácia da atividade sérica de ADA com método diagnóstico de rejeição aguda, empregou-se pontos de corte de valores de ADA>35,>40,>45, >50 e > que 30% dos valores do período pré-rejeição. Houve associação estatisticamente significativa entre ADA>30% e rejeição celular aguda (p=0.035 MW). Verificou-se, também, aumento significativos da atividade sérica de ADA em pacientes anti-HCV positivos e com necrose tubular aguda, sem interferência sobre os resultados dos episódios de rejeição celular aguda. Usando esses pontos de corte como parâmetros de diagnóstico para rejeição aguda observou-se: sensibilidade = 55,5%, especificidade = 82,3%, valor preditivo positivo = 76,9%, valor preditivo negativo = 63,6% e acurácia = 69,0%. Conclui-se que há um aumento significativo da atividade sérica da ADA durante os episódios de rejeição aguda de enxertos renais humanos, encontrando-se associação significativa entre o aumento de 30% dos valores de ADA pré-rejeição e o diagnóstico de rejeição celular aguda.
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Mapeamento do padrão de expressão tecidual dos genes relacionados à adenosina deaminase e caracterização cinética da atividade de desaminação da adenosina em cérebro de zebrafish (Danio rerio)Rosemberg, Denis Broock January 2008 (has links)
O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.
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Influência dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) da APOBEC3G na dinâmica populacional da infecção pelo HIV-1 / Influence of single nucleotide polymorphisms of APOBEC3G in the population dynamic in the HIV-1 infectionBizinoto, Maria Clara [UNIFESP] 28 April 2011 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2011-04-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A APOBEC3G (A3G) tem sido descrita como um fator celular que inibe a replicação do HIV-1. Durante a transcrição reversa, a A3G promove a desaminação de citidinas para uracilas nas fitas negativas de DNA viral, induzindo hipermutação de guaninas para adeninas nas fitas positivas. O HIV-1 contra-ataca esse efeito pela atividade da proteína viral Vif, que neutraliza complexos A3G através de um mecanismo de degradação proteassômica. Apesar de alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) terem sido descritos ocorrendo ao longo do gene A3G, seus efeitos sobre a progressão da infecção pelo HIV-1 não são claros. Este estudo tentou estabelecer, na população brasileira, a freqüência de 7 SNPs descritos anteriormente e seu impacto na carga viral e contagem de células T CD4+, em associação com a presença de hipermutação no gene da integrase. Além disso, foi analisada a diversidade genética do gene vif a fim de estabelecer sua associação com o estado clínico e os polimorfismos da A3G. Foram analisadas 400 amostras provenientes de indivíduos infectados pelo HIV-1 que não foram submetidos a tratamento antiretroviral. Os SNPs na A3G foram detectados por resequenciamento. Com o auxílio de ferramentas de bioinformática, foram utilizados modelos baseados em códons para estudar o processo evolutivo do gene vif, a partir de 156 sequências do subtipo B do HIV-1. A hipermutação foi investigada utilizando o corante Bisbenzamida-PEG durante a eletroforese em gel de agarose. Os géis foram analisados utilizando o software Image J e de acordo com a posição das bandas, quando comparados aos controles, as amostras foram categorizadas. Foi verificado que brasileiros e europeus têm freqüências genotípicas similares no gene A3G. A análise também revelou que os polimorfismos na maioria dos loci da A3G não tiveram qualquer influência na carga viral e contagem de células T CD4+. A análise das amostras em gel de agarose com HA-Yellow encontrou 36% de hipermutação. Notavelmente, códons sob o efeito de epistasia no gene vif foram associados com os níveis de células T CD4+. As análises baseadas em filogenia revelaram que os polimorfismos na A3G e a hipermutação tiveram um impacto insignificante na taxa de mutação neutra no gene vif. No entanto, códons sob selecção positiva foram detectados no gene vif entre as regiões MKSLVK e YRHHY, e nas regiões de interação com a BC-Box e Cullin5-Box. Estas regiões são envolvidas na degradação de Vif induzida por complexos A3G. Em conclusão, foi observado que a evolução do vif é parcialmente explicada pela resposta adaptativa otimizada para neutralizar a atividade da A3G, o que demonstra a plasticidade evolutiva do HIV-1 para se adaptar aos genes com função antiviral do hospedeiro. / APOBEC3G (A3G) has been described as a cellular factor that inhibits replication of HIV-1. During reverse transcription, A3G promotes deamination of cytidine to uracil in the minus strand viral DNA, inducing hypermutation of guanines to adenines in plus strand DNA. The HIV-1 counters this effect by the activity of the viral protein Vif, which counteracts A3G complexes through a mechanism of proteasome degradation. Although some single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been described occurring along the A3G gene, its effects on the progression of HIV-1 are unclear. This study attempted to establish, in the Brazilian population, the frequency of seven SNPs previous described and their impact on viral load and CD4 cell count, in association with the presence of hypermutation in the integrase gene. In addition, we analyzed the genetic diversity of the vif gene to establish its association with clinical status and polymorphisms of A3G. We analyzed 400 samples from drug naïve infected HIV-1 patients. SNPs were detected by resequencing. Bioinformatic tools for HIV-1 sequences analyses were used for studying the evolutionary process of gene vif. Hypermutation has been investigated using the dye-PEG Bisbenzimide in agarose gel electrophoresis. The gels were analyzed using Image J software and according to the position of the bands, when compared to controls, the samples were categorized. It was found that Brazilians and Europeans have similar genotype frequencies in the A3G gene. The analysis also revealed that the polymorphisms in most loci of A3G had no impact on viral load and CD4 + T cells counts. Analysis using agarose gels with HA-Yellow found that 36% of all samples ware hypermutated. Notably, the codons under epistasis influence in the vif gene were associated with levels of CD4 + T cells. The phylogenetic-based analysis revealed that A3G polymorphisms and hypermutation had insignificant impact in the rate of neutral mutation in vif gene. However, codons under positive selection were detected between the MKSLVK and YRHHY regions and within the BC-Box and the Cullin5-Box of vif gene. These regions are involved in the degradation of Vif-induced A3G complexes. In conclusion, we observed that the evolution of vif is partly explained by the optimized adaptive response to counteract A3G activity, which demonstrates evolutionary plasticity of HIV-1 to adapt to host genes with antiviral function. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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