A integração entre o citoesqueleto celular e a MEC mediada pelas integrinas gera a produção de força mecânica sobre a membrana plasmática. Isto permite às células gerar tração durante sua migração e tensão durante o remodelamento da MEC. Várias proteínas com diferentes funções já foram identificadas como ligantes das subunidades a e b das integrinas. O estudo de proteínas capazes de se ligar e interferir na sinalização via integrina, como as desintegrinas-like e cisteina-rich presentes nos venenos de serpente e proteínas conhecidas como ADAM (A Disintegrin And Metaloprotease), torna-se cada vez mais importante. Assim, o isolamento, a caracterização e a determinação da estrutura de várias desintegrinas oferecem valiosas ferramentas para o desenvolvimento de novos compostos terapêuticos para um vasto número de doenças, sendo excelentes candidatos-protótipo para o desenvolvimento de novos fármacos que interfiram nas funções celulares moduladas por proteínas de adesão. Entretanto, as formas como a integrina e a ADAM interagem ainda não foram bem esclarecidas. Neste contexto, este trabalho visa analisar em escalar molecular a estrutura da integrina alpha6beta1 e do domínio desintegrina-like das ADAMs 2 e 9 humanas, e a forma como estas proteínas interagem, aplicando metodologias de biologia computacional estrutural como modelagem e dinâmica molecular. Com o objetivo de estudar a interação destas proteínas, modelos estruturais foram construídos por homologia a partir das estruturas 3D de proteínas obtidas por cristalografia de raio-X, e realizaram-se simulações de dinâmica molecular com solvente explícito para as proteínas isoladas e em complexo. Através do estudo estrutural e funcional pelo método in silico da integrina alpha6beta1 e ADAMs 2 e 9 humanas, as análises dos resultados das simulações e da flutuação dos resíduos de contato entre as duas proteínas durante a dinâmica molecular, foram desenhados e caracterizados novos candidatos peptídicos para inibição da integrina alpha6beta1. Nas simulações da movimentação angular do domínio bA/Hybrid, visando a possível ativação da integrina alpha6beta1 através da interação com o domínio desintegrina-like de ADAM9 e ligantes peptídicos, obtivemos resultados positivos para os peptídeos A9b e A9d. Este estudo aponta para o desenvolvimento de inibidores protéicos viáveis da integrina alpha6beta1 com base nestas estruturas. Nossos resultados ainda comprovam pelas metodologias in silico a eficácia dos modelos construídos, conseguindo reproduzir o comportamento das proteínas em estudo. / The production of mechanical force on plasma membrane is mediated by integrins, connecting ECM components and cell cytoskeleton. This allows cells to generate traction during migration and tension during ECM remodeling. Integrins are membrane-spaning adhesion receptors that mediate dynamic linkages between intracellular actin cytoskeleton and the extracelullar adhesive matrix, outside-in/inside-out signaling, migration and detachment. Several proteins with diferent functions have already been identified as integrin ligands, and some important candidates as disintegrin-like and cystein-rich domains present in the snake venon metalloproteinases and ADAM (A Disintegrin and Metaloprotease) become important as they interfere in cell signaling pathways mediated by these transmembrane receptors. Thus, the isolation, characterization and structure determination of disintegrin-like domains o_er valuable tools for the development of new therapeutic compounds for a wide range of diseases. These compounds may provide new treatments for diseases such as cancer and inflammation pathologies. However, the mechanisms of ADAM-Integrin interaction have not been well clarified, yet. In this perspective, this study aims to analyze the molecular structure of the alfa6beta1 integrin and the disintegrin-like domain of human ADAM2 and ADAM9. Computational biology methods such as homology modeling and molecular dynamics were used in order to study the dynamics of the interaction of these proteins. Using in silico experimentation, detailed models of human alfa6beta1 and human ADAM 2 and 9 were obtained. Based on these models, the molecular basis of alfa6beta1-ADAMdsld interactions was assessed, and the most important structural components in ligand recognition/discrimination were identified. Using the collected structural information, we designed different small peptide based inhibitors, based on the structure of the interaction loop of human ADAM 9 disintegrin-like domain. Here proposed A9a inhibitor was testedin vitro, showing satisfactory results in blocking cell adhesion on specific substrates by alfa6beta1- laminin affnity inhibition in nanomolar concentrations. Our results also show the effcacy of the constructed models, the power of computational biology tools in new drug-design technologies, and clearly suggest that here presented alfa6beta1 inhibitors are good candidates for further development of new therapeutic agents against inflammation pathologies.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Monika.pdf: 24724342 bytes, checksum: a8d2da36e8294d281f856fd1f9f4fca1 (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / The production of mechanical force on plasma membrane is mediated by integrins, connecting ECM components and cell cytoskeleton. This allows cells to generate traction during migration and tension during ECM remodeling. Integrins are membrane-spaning adhesion receptors that mediate dynamic linkages between intracellular actin cytoskeleton and the extracelullar adhesive matrix, outside-in/inside-out signaling, migration and detachment. Several proteins with diferent functions have already been identified as integrin ligands, and some important candidates as disintegrin-like and cystein-rich domains present in the snake venon metalloproteinases and ADAM (A Disintegrin and Metaloprotease) become important as they interfere in cell signaling pathways mediated by these transmembrane receptors. Thus, the isolation, characterization and structure determination of disintegrin-like domains o_er valuable tools for the development of new therapeutic compounds for a wide range of diseases. These compounds may provide new treatments for diseases such as cancer and inflammation pathologies. However, the mechanisms of ADAM-Integrin interaction have not been well clarified, yet. In this perspective, this study aims to analyze the molecular structure of the alfa6beta1 integrin and the disintegrin-like domain of human ADAM2 and ADAM9. Computational biology methods such as homology modeling and molecular dynamics were used in order to study the dynamics of the interaction of these proteins. Using in silico experimentation, detailed models of human alfa6beta1 and human ADAM 2 and 9 were obtained. Based on these models, the molecular basis of alfa6beta1-ADAMdsld interactions was assessed, and the most important structural components in ligand recognition/discrimination were identified. Using the collected structural information, we designed different small peptide based inhibitors, based on the structure of the interaction loop of human ADAM 9 disintegrin-like domain. Here proposed A9a inhibitor was tested in vitro , showing satisfactory results in blocking cell adhesion on specific substrates by alfa6beta1- laminin affnity inhibition in nanomolar concentrations. Our results also show the effcacy of the constructed models, the power of computational biology tools in new drug-design technologies, and clearly suggest that here presented alfa6beta1 inhibitors are good candidates for further development of new therapeutic agents against inflammation pathologies. / A integração entre o citoesqueleto celular e a MEC mediada pelas integrinas gera a produção de força mecânica sobre a membrana plasmática. Isto permite às células gerar tração durante sua migração e tensão durante o remodelamento da MEC. Várias proteínas com diferentes funções já foram identificadas como ligantes das subunidades a e b das integrinas. O estudo de proteínas capazes de se ligar e interferir na sinalização via integrina, como as desintegrinas-like e cisteina-rich presentes nos venenos de serpente e proteínas conhecidas como ADAM (A Disintegrin And Metaloprotease), torna-se cada vez mais importante. Assim, o isolamento, a caracterização e a determinação da estrutura de várias desintegrinas oferecem valiosas ferramentas para o desenvolvimento de novos compostos terapêuticos para um vasto número de doenças, sendo excelentes candidatos-protótipo para o desenvolvimento de novos fármacos que interfiram nas funções celulares moduladas por proteínas de adesão. Entretanto, as formas como a integrina e a ADAM interagem ainda não foram bem esclarecidas. Neste contexto, este trabalho visa analisar em escalar molecular a estrutura da integrina alpha6beta1 e do domínio desintegrina-like das ADAMs 2 e 9 humanas, e a forma como estas proteínas interagem, aplicando metodologias de biologia computacional estrutural como modelagem e dinâmica molecular. Com o objetivo de estudar a interação destas proteínas, modelos estruturais foram construídos por homologia a partir das estruturas 3D de proteínas obtidas por cristalografia de raio-X, e realizaram-se simulações de dinâmica molecular com solvente explícito para as proteínas isoladas e em complexo. Através do estudo estrutural e funcional pelo método in silico da integrina alpha6beta1 e ADAMs 2 e 9 humanas, as análises dos resultados das simulações e da flutuação dos resíduos de contato entre as duas proteínas durante a dinâmica molecular, foram desenhados e caracterizados novos candidatos peptídicos para inibição da integrina alpha6beta1. Nas simulações da movimentação angular do domínio b A/Hybrid, visando a possível ativação da integrina alpha6beta1 através da interação com o domínio desintegrina-like de ADAM9 e ligantes peptídicos, obtivemos resultados positivos para os peptídeos A9b e A9d. Este estudo aponta para o desenvolvimento de inibidores protéicos viáveis da integrina alpha6beta1 com base nestas estruturas. Nossos resultados ainda comprovam pelas metodologias in silico a eficácia dos modelos construídos, conseguindo reproduzir o comportamento das proteínas em estudo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5684.pdf: 2471155 bytes, checksum: f035dbceafb88325d3cb0d3fb8280603 (MD5) Previous issue date: 2013-12-10 / Financiadora de Estudos e Projetos / Matrix metalloproteinases (MMPs) are key factors in tumor progression that allow tumor cells to modify the extracellular matrix (ECM) and to release cytokines, growth factors being activated by cell surface molecules such as the integrins. Integrins are major adhesion receptors of cell surface that connect the cells to the external environment enabling its movement. Integrins activate signaling cascades that influence the adhesion, survival and cell proliferation. Important inhibitors of these molecules were found in snake venoms called disintegrins. Alternagin-C (ALT-C) a disintegrin from Rhinocerophis alternatus snake venom has affinity with α2β1 integrin therfore modulating cell adhesion, migration and proliferation. However, the effect of ALT-C on MMP activity has not been described yet. Here, we have found that, ALT-C increased cell migration in MDA-MB-231 at lower concentration (10 nM) and it decreased cell migration at higher concentrations (40, 100 and 1000 nM). ALT-C was able to inhibit MMP-9 activity in human breast cancer (MDA-MB-231) conditioned medium and MMP-2 activity in fibroblastas and human microvascular endothelial cells (HMEC-1) conditioned medium. ALT-C also modulated the expression of angiogenic genes such as VEGF, c-MYC, MMP-2 and MMP-9 and it was able to inhibit transendothelial migration of MDA-MB-231 cells at all concentrations (10, 40, 100 and 1000 nM). In conclusion, ALT-C affects the extracellular matrix remodeling by modulating the activity of MMPs and expression of angiogenic genes essential for tumor growth as well as decreased cell migration. / As metaloproteinases de matriz (MMPs) são fatores chave na progressão tumoral, pois participam do remodelamento da matriz extracelular (ECM), liberam citocinas, fatores de crescimento e são reguladas por moléculas da superfície celular (integrinas). As integrinas são os principais receptores de adesão da superfície celular. Elas interagem com proteínas presentes na matriz extracelular conectando as células ao meio no qual estão inseridas possibilitando sua locomoção e a participação em cascatas de sinalização que influenciam a adesão, sobrevivência e a proliferação celular. Importantes inibidores dessas moléculas foram encontrados em venenos de serpentes denominados de desintegrinas. Alternagina-C (ALT-C), uma desintegrina de veneno da serpente Rhinocerophis alternatus, tem afinidade para a integrina α2β1, modula a adesão, migração e a proliferação celular mas não há nenhum estudo publicado sobre sua influência na atividade das MMPs. Nesse estudo, a ALT-C foi capaz de aumentar a migração celular em MDA-MB-231 em baixa concentração (10 nM) e diminuir a migração em concentrações mais elevadas (40, 100 e 1000 nM). ALT-C também inibiu a atividade de MMP-9 em meio condicionado de células de carcinoma de mama (MDAMB- 231) e atividade de MMP-2 em meio condicionado de fibroblastos e células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1). A desintegrina também foi capaz de modular a expressão de genes angiogênicos como VEGF, c-MYC, MMP-2 e MMP-9 e inibir a transmigração das células tumorais através das células endoteliais. Conclui-se que a ALT-C atua no remodelamento da matriz extracelular do microambiente tumoral por modular a atividade de MMPs e a expressão de genes angiogênicos essenciais no crescimento tumoral, bem como diminuindo a migração celular.