Diabetische Polyneuropathie ist die häufigste Folgeerkrankung eines Diabetes mellitus. Bei ca. 20 % der betroffenen Patienten tritt eine schmerzhafte Form der Polyneuropathie auf. Eine intakte Blut-Nerven-Barriere hält im Endoneurium ein spezifisches Milieu aufrecht. Die Dichtigkeit der Blut-Nerven-Barriere (BNB) wird durch Tight Junctions im Perineurium und in endoneuralen Kapillaren hergestellt. Eine Öffnung der BNB in Kombination mit einem algetischen Stimulus ist ein wesentlicher Mechanismus neuropathischer Schmerzen in traumatischen Tiermodellen. Über den Stellenwert von Störungen der BNB bei diabetischer Polyneuropathie wird kontrovers diskutiert. Diese Arbeit beleuchtet funktionelle Änderungen der BNB und die Expression wichtiger Tight-Junction-Proteine in einem Modell für schmerzhafte diabetische Polyneuropathie. Nach Genehmigung durch die Regierung von Unterfranken und unter Einhaltung der ARRIVE-Richtlinien wurde eine experimentelle diabetische Polyneuropathie in Wistar-Ratten durch einmalige intravenöse Gabe von Streptozocin (STZ) induziert. Zwei Wochen nach Diabetesinduktion trat eine mechanische Allodynie auf. Nach acht Wochen war eine selektive Öffnung der BNB für die niedermolekulare Verbindung Fluorescein-Natrium (376 Da) in vivo und ex vivo nachweisbar. Für die makromolekulare Testsubstanz Evans blue Albumin (69 kDa) erwies sich die BNB als intakt. Eine verstärkte endoneurale Ansammlung von Makrophagen wurde immunhistochemisch nicht beobachtet. Die Expression wichtiger Tight-Junction-Proteine in ganzem peripherem Nerv, in Spinalganglien und im Rückenmark wies keine signifikanten Änderungen in der quantitativen Echtzeit-PCR auf. Eine selektive Analyse nach Lasermikrodissektion zeigte jedoch eine Minderexpression von Cldn5 in endoneuralen Gefäßen und Cldn1 im Perineurium nach acht Wochen. Bei STZ-induzierter Polyneuropathie tritt somit eine größenselektive Öffnung der BNB auf, die sich zeitlich deutlich nach dem Beginn mechanischer Allodynie manifestiert. Die Öffnung korreliert mit einer Minderexpression von Cldn1 mRNA perineural und von Cldn5 mRNA in endoneuralen Gefäßen. In der multifaktoriellen Pathophysiologie der diabetischen Polyneuropathie kann die Öffnung der BNB als weiterer schädigender Kofaktor betrachtet werden, der zur Aufrechterhaltung neuropathischer Schmerzen beiträgt. / Diabetic polyneuropathy is the most common complication in diabetes mellitus. Quality of life is severely affected if neuropathic pain occurs. An intact blood nerve barrier (BNB) protects nerves and creates an immune-privileged space inside the endoneurium. Build up by tight junction complexes sealing endoneurial endothelial and perineurial cells, the BNB’s most important components are tight junction proteins. An opening of the BNB with a concomitant algetic stimulus is an important mechanism of neuropathic pain. The relevance of vascular changes and BNB derangements in DPN remains a controversial debate. This project aims to further characterize the BNB in a model of painful diabetic neuropathy and evaluate expression levels of important tight junction proteins. All animal experiments were approved by the Regierung von Unterfranken and were conducted according to ARRIVE guidelines. Intravenous injection of STZ in male Wistar rats elicited high blood glucose levels and mechanical allodynia. Using micromolecular sodium fluorescein either intravenously (in vivo) or perineurally (ex vivo) the BNB tightness was decreased at eight weeks resulting in endoneurial accumulation of the tracer. There was no observable change in barrier tightness after application of Evans blue albumin in vivo nor ex vivo. The expression of important sealing tight junction proteins did not differ significantly in whole sciatic nerve, dorsal root ganglion nor spinal cord. Endoneurial macrophage infiltration was not observed. However, laser-assisted microdissection revealed decreased levels of Cldn1 mRNA in perineurium and Cldn5 mRNA in endoneurial vessels after 8 weeks. Differences between the STZ model and traumatic models of neuropathic pain exist regarding the degree of BNB opening and the involvement of immune cells. In STZ-induced neuropathy a size-selective opening of the BNB occurs several weeks after first signs of mechanical allodynia started. Opening of the BNB correlated with an expression decrease of important tight junction proteins. Despite the time lapse an opening of the BNB could be a pathological factor contributing to the upholding of nerve damage and neuropathic pain.

In this study I investigate the role of Schwann cell and axon-derived trophic signals as modifiers of axonal integrity and sprouting in motoneuron disease and diabetic neuropathy (DNP). The first part of this thesis focuses on the role of the Schwann-cell-derived ciliary neurotrophic factor (CNTF) for compensatory sprouting in a mouse model for mild spinal muscular atrophy (SMA). In the second part, the role of the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and its binding protein 5 (IGFBP-5) is examined in the peripheral nerves of patients with DNP and in two corresponding mouse models. Proximal SMA is caused by homozygous loss or mutation of the SMN1 gene on human chromosome 5. The different forms of SMA can be divided into four groups, depending on the levels of SMN protein produced from a second SMN gene (SMN2) and the severity of the disease. Patients with milder forms of the disease, type III and type IV SMA, normally reach adulthood and regularly show enlargement of motor units, signifying the reinnervation of denervated muscle fibers. However, the underlying mechanisms are not understood. Smn+/- mice, a model of type III/IV SMA, are phenotypically normal, but they reveal progressive loss of motor neurons and denervation of motor endplates starting at 4 weeks of age. The progressive loss of spinal motor neurons reaches 50% at 12 months but muscle strength is not reduced. The first evidence for axonal sprouting as a compensatory mechanism in these animals was the more than 2-fold increase in amplitude of single motor unit action potentials (SMUAP) in the gastrocnemius muscle. Confocal analysis confirmed pronounced sprouting of innervating motor axons. As CNTF is highly expressed in Schwann cells and known to be involved in sprouting, its role for this compensatory sprouting response and the maintenance of muscle strength in Smn+/- mice was investigated. Deletion of CNTF in this mouse model results in reduced sprouting and decline of muscle strength in Smn+/- Cntf-/- mice. These findings indicate that CNTF is necessary for a sprouting response and thus enhances the size of motor units in skeletal muscles of Smn+/- mice. DNP afflicting motor and sensory nerve fibers is a major complication in diabetes mellitus. The underlying cellular mechanisms of motor axon degeneration are poorly understood. IGFBP-5, an inhibitory binding protein for IGF-1, is highly upregulated in peripheral nerves in patients with DNP. The study investigates the pathogenic relevance of this finding in transgenic mice overexpressing IGFBP-5 in motor axons. These mice develop motor axonopathy similar to that seen in DNP. Motor axon degeneration is also observed in mice in which the IGF-1 receptor (IGF-1R) was conditionally depleted in motoneurons, indicating that reduced activity of IGF-1 on IGF-1R in motoneurons is responsible for the observed effect. These data provide evidence that elevated expression of IGFBP-5 in diabetic nerves reduces the availability of IGF-1 for IGF-1R on motor axons leading to progressive neurodegeneration, and thus offers novel treatment strategies. / In dieser Arbeit habe ich die Rolle der neurotrophen Faktoren Ciliary neurotrophic factor (CNTF) und Insulin-like-growth factor 1 (IGF-1), die in Schwannzellen gebildet werden, als Modulatoren der axonalen Integrität bei einer degenerativen Motoneuronenerkrankung und bei diabetischer Neuropathie (DNP) untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wird gezeigt, dass CNTF für ein kompensatorisches Sprouting von motorischen Axonen in einem Mausmodell für spinale Muskelatrophie (SMA) verantwortlich ist. Im zweiten Teil wird die Rolle von IGF-1 und dessen Bindeprotein, IGFBP-5, in Axonen motorischer Nerven bei Patienten mit DNP und zwei korrespondieren Mausmodellen gezeigt. Die proximale SMA wird durch einen homozygoten Verlust oder Mutation des SMN1 Gens auf dem Chromosom 5 verursacht. Bei der spinalen Muskelatrophie unterscheidet man verschiedene Schweregrade, abhängig von der Menge an SMN Protein, das vom zweiten SMN Gen (SMN2) produziert werden kann. Patienten mit einer milderen Form von SMA (Typ III und IV) erreichen das Erwachsenenalter und zeigen oft vergrößerte motorische Einheiten, im Gegensatz zu Patienten mit den schweren kindlichen Formen der Erkrankung. Smn+/- Mäuse, ein Modell für die leichten SMA Formen Typ II und IV, zeigen denervierte Endplatten bereits 4 Wochen nach der Geburt und einen fortschreitenden Verlust von Motoneuronen, der nach 12 Monaten mehr als 50% beträgt, ohne dass sich die Muskelkraft der Tiere verringert. Die Amplitude der Summenpotenziale von einzelnen motorischen Einheiten (Single motor unit action potential, SMUAP) im Wadenmuskel ist mehr als 2-fach erhöht. Konfokale Aufnahmen bestätigen ausgeprägtes Sprouting der noch innervierenden Axone. Smn+/- Mäuse ohne CNTF, das normalerweise stark in Schwann-Zellen exprimiert ist, zeigen reduziertes Sprouting und verringerte Muskelkraft. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass CNTF für das Sprouting und die vergrößerten motorischen Einheiten in Smn+/- Mäusen verantwortlich ist. Dieser kompensatorische Mechanismus könnte neue Behandlungs-möglichkeiten für Motoneuronerkrankungen eröffnen. Die Diabetische Neuropathie (DNP), eine der Hauptkomplikationen bei Diabetes Mellitus, betrifft sowohl motorische als auch sensorische Nervenfasern. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen, die zur Degeneration motorischer Axone in Spätstadien der Erkrankung führen, sind größtenteils noch ungeklärt. IGFBP-5, ein IGF-1 hemmendes Bindeprotein, ist in peripheren Nervbiopsien von DNP Patienten stark überexprimiert. Diese potenzielle pathogene Relevanz wurde bei IGFBP-5 überexprimierenden transgenen Mäusen untersucht. Diese Mäuse entwickeln ähnlich wie die DNP Patienten eine motorische Axonopathie. Diese Axondegeneration zeigen auch Mäuse, bei denen der IGF-1 Rezeptor (IGF-1R) neuronenspezifisch ausgeschaltet wurde. Das bedeutet, dass reduzierte Wirkung von IGF-1 am IGF-1R auf Axonen von Motoneuronen für die beobachtete Axonopathie verantwortlich ist. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass erhöhtes IGFBP-5 in diabetischen Nerven die Verfügbarkeit von IGF-1 für den IGF-1R reduziert und zu progressiver Neurodegeneration führt. Diese Erkenntnis könnte neue Behandlungsstrategien für Patienten mit DNP eröffnen.

Diabetes mellitus und seine Folgeerkrankungen haben aufgrund der hohen Prävalenz in der Bevölkerung eine starke medizinsche Relevanz. Dabei stellen die durch eine diabetische Neuropathie ausgelösten Schmerzen ein Herausforderung in der Schmerztherapie dar. Die Behandlung dieser Schmerzen mit TENS ist eine oft angewendete Therapieoption, welche jedoch in ihrer Wirksamkeit nicht ausreichend evidenzbasiert gesichert ist, da es methodenbedingt bei klinischen Studien zur Wirksamkeit der TENS-Therapie oft Zweifel an einer ausreichenden Verblindung gibt. Die vorliegende Studie untersuchte deshalb Mikro-TENS als Therapiealternative zur TENS-Behandlung im Rahmen einer einfach verblindeten, placebokontrollierten, klinischen Studie mit 41 Patienten. Die Placebokontrolle ist bei der Anwendung von Mikroreizstrom möglich, weil dieser unterhalb der Wahrnehmungsschwelle für sensible Nervenfasern liegt. Damit können die Patienten nicht zwischen MENS-Therapie und Placebo-Therapie unterscheiden. Die Diabetespatienten wurden über 4 Wochen in insgesamt 12 Sitzungen à 30 Minuten mit Mikro-TENS am distalen Fuß beidseits behandelt. Als Messgrößen dienten der PDI, der NPS, der ADS und die durchschnittliche Schmerzintensität auf einer numerischen Ratingskala von 0 bis 10. Diese Variablen wurden jeweils zu Beginn der Studie, direkt am letzten Behandlungstag und einen Monat nach der letzten Behandlung erhoben. Der PDI Score zeigte nach vierwöchiger Therapie eine durchschnittliche absolute Reduktion von 4,27 \\pm 4,17 in der Verum- und 3,79 \\pm 7,71 in der Placebogruppe. Eine mindestens 30 %ige Verbesserung des NPS- und PDI-Scores wurde als Ansprechen auf die Therapie gewertet. Insgesamt konnte bei circa 30 % der 40 Studienteilnehmer eine Therapieresponse festgestellt werden. Laut NPS sprachen nach vier Wochen Reizstromtherapie 6 von 22 Patienten in der Verumgruppe und 10 von 19 Patienten in der Placebogruppe auf die Therapie an. Die Unterschiede zwischen den Studiengruppen waren statistisch nicht signifikant. Letztlich konnte die Wirksamkeit von Mikroreizstromtherapie bei diabetischer Polyneuropathie nicht bestätigt werden. Mit einer größeren Fallzahl und damit größerer statistischer Power könnte möglicherweise ein geringer Unterschied im Therapieerfolg zwischen Placebo- und Verumbehandlung statistisch signifikant werden. Dieser Therapieeffekt wäre aber möglicherweise schmerztherapeutisch als nicht relevant einzuschätzen, da es sich mit 80 %iger Wahrscheinlichkeit (Power der vorliegenden Studie) um eine Reduktion von weniger als 15 Punkten im PDI handelt. Daher kann die Mikroreizstromtherapie zur symptomatischen Therapie bei schmerzhafter diabetischer Neuropathie (dPNP) nicht empfohlen werden. Auf die Wirksamkeit von TENS mit höheren Stromstärken zur Behandlung der dPNP kann anhand der vorliegenden Studie kein Rückschluß gezogen werden. Es profitieren dennoch circa 30 % der insgesamt 40 Studienteilnehmer von der Intervention. Da in der Schmerztherapie Ansprechraten auf eine Placebotherapie von 7 bis 49 % möglich sind, stellt TENS eine Möglichkeit dar, diesen Effekt zusätzlich mit relativ geringem Aufwand auszuschöpfen. Vorteile in der Therapie mit Reizstrom sind außerdem geringe Kosten, nahezu keine unerwünschten Nebenwirkungen und fast kein Vorliegen von Kontraindikationen. Damit ist diese zusätzliche Therapieoptionen der dPNP neben einer optimale Einstellung des Blutzuckers und einer medikamentösen Schmerztherapie nicht außer Acht zu lassen und die Wirksamkeit komplexer Therapieprogramme mit Langzeitreizstromtherapie sollte in weiteren kontrollierten klinischen Studien eruiert werden.

Diabetes mellitus und seine Folgeerkrankungen haben aufgrund der hohen Prävalenz in der Bevölkerung eine starke medizinsche Relevanz. Dabei stellen die durch eine diabetische Neuropathie ausgelösten Schmerzen ein Herausforderung in der Schmerztherapie dar. Die Behandlung dieser Schmerzen mit TENS ist eine oft angewendete Therapieoption, welche jedoch in ihrer Wirksamkeit nicht ausreichend evidenzbasiert gesichert ist, da es methodenbedingt bei klinischen Studien zur Wirksamkeit der TENS-Therapie oft Zweifel an einer ausreichenden Verblindung gibt. Die vorliegende Studie untersuchte deshalb Mikro-TENS als Therapiealternative zur TENS-Behandlung im Rahmen einer einfach verblindeten, placebokontrollierten, klinischen Studie mit 41 Patienten. Die Placebokontrolle ist bei der Anwendung von Mikroreizstrom möglich, weil dieser unterhalb der Wahrnehmungsschwelle für sensible Nervenfasern liegt. Damit können die Patienten nicht zwischen MENS-Therapie und Placebo-Therapie unterscheiden. Die Diabetespatienten wurden über 4 Wochen in insgesamt 12 Sitzungen à 30 Minuten mit Mikro-TENS am distalen Fuß beidseits behandelt. Als Messgrößen dienten der PDI, der NPS, der ADS und die durchschnittliche Schmerzintensität auf einer numerischen Ratingskala von 0 bis 10. Diese Variablen wurden jeweils zu Beginn der Studie, direkt am letzten Behandlungstag und einen Monat nach der letzten Behandlung erhoben. Der PDI Score zeigte nach vierwöchiger Therapie eine durchschnittliche absolute Reduktion von 4,27 \\pm 4,17 in der Verum- und 3,79 \\pm 7,71 in der Placebogruppe. Eine mindestens 30 %ige Verbesserung des NPS- und PDI-Scores wurde als Ansprechen auf die Therapie gewertet. Insgesamt konnte bei circa 30 % der 40 Studienteilnehmer eine Therapieresponse festgestellt werden. Laut NPS sprachen nach vier Wochen Reizstromtherapie 6 von 22 Patienten in der Verumgruppe und 10 von 19 Patienten in der Placebogruppe auf die Therapie an. Die Unterschiede zwischen den Studiengruppen waren statistisch nicht signifikant. Letztlich konnte die Wirksamkeit von Mikroreizstromtherapie bei diabetischer Polyneuropathie nicht bestätigt werden. Mit einer größeren Fallzahl und damit größerer statistischer Power könnte möglicherweise ein geringer Unterschied im Therapieerfolg zwischen Placebo- und Verumbehandlung statistisch signifikant werden. Dieser Therapieeffekt wäre aber möglicherweise schmerztherapeutisch als nicht relevant einzuschätzen, da es sich mit 80 %iger Wahrscheinlichkeit (Power der vorliegenden Studie) um eine Reduktion von weniger als 15 Punkten im PDI handelt. Daher kann die Mikroreizstromtherapie zur symptomatischen Therapie bei schmerzhafter diabetischer Neuropathie (dPNP) nicht empfohlen werden. Auf die Wirksamkeit von TENS mit höheren Stromstärken zur Behandlung der dPNP kann anhand der vorliegenden Studie kein Rückschluß gezogen werden. Es profitieren dennoch circa 30 % der insgesamt 40 Studienteilnehmer von der Intervention. Da in der Schmerztherapie Ansprechraten auf eine Placebotherapie von 7 bis 49 % möglich sind, stellt TENS eine Möglichkeit dar, diesen Effekt zusätzlich mit relativ geringem Aufwand auszuschöpfen. Vorteile in der Therapie mit Reizstrom sind außerdem geringe Kosten, nahezu keine unerwünschten Nebenwirkungen und fast kein Vorliegen von Kontraindikationen. Damit ist diese zusätzliche Therapieoptionen der dPNP neben einer optimale Einstellung des Blutzuckers und einer medikamentösen Schmerztherapie nicht außer Acht zu lassen und die Wirksamkeit komplexer Therapieprogramme mit Langzeitreizstromtherapie sollte in weiteren kontrollierten klinischen Studien eruiert werden.

No abstract available

Bislang ist ungeklärt, warum PNPs teils schmerzhaft und teils schmerzlos verlaufen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchte Hypothese lautete, dass ein Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen der unterschiedlichen Schmerzausprägung zugrunde liegt.Es wurden 32 Patienten mit schmerzhafter PNP, 20 Patienten mit schmerzloser PNP und 44 Kontrollpersonen auf die Expression und Produktion ausgewählter pro- und anti-inflammatorischer Zytokine untersucht. Zur Messung der Schmerzhaftigkeit wurden etablierte Schmerzfragebögen verwendet. Zusätzlich wurden nahezu alle Patienten mit der Allgemeinen Depressionsskala befragt. Die Diagnose, Ätiologie, Dauer, klinische Manifestation der PNP sowie die Medikation der Patienten wurde auf standardisierten Erhebungsbögen dokumentiert. Zur Messung der Zytokine wurde morgens Blut in EDTA- und Serummonovetten asserviert und entsprechend der Messmethodik weiterverarbeitet. Die relative Genexpression wurde aus Gesamt-RNA mittels reverser Transkription und quantitativer real-time PCR, die Serumproteine mittels enzyme-linked immunosorbant assay gemessen. Die Patienten mit schmerzhafter PNP hatten in der Mehrzahl Neuropathie-typische Plussymptome und mittelstarke Schmerzen, die eine starke bis sehr starke Behinderung darstellten. Die hier untersuchten Zytokinmuster bei Patienten mit schmerzhafter und schmerzloser PNP zeigten eine Verschiebung zu pro-inflammatorischen Zytokinen bei Patienten mit schmerzhafter PNP. Die Zytokinexpression der Patienten mit schmerzhafter PNP war im Vergleich zu Patienten mit schmerzloser PNP und Kontrollen bezüglich der IL-2 und TNF Expression und Produktion signifikant erhöht. Umgekehrt lagen bei Patienten mit schmerzloser PNP die Produktion und die Expression des IL-4 im Vergleich zu Patienten mit schmerzhafter PNP und Kontrollen höher. Die Expression des IL-10 lag bei Patienten mit schmerzloser PNP ebenfalls höher als bei Patienten mit schmerzloser PNP und Kontrollen, unterschied sich aber auf Proteinebene nicht in den drei Gruppen. Die einleitend gestellte Hypothese, dass der schmerzhafte oder schmerzlose Verlauf einer PNP durch unterschiedliche Zytokinprofile bedingt ist, kann durch die vorliegenden Ergebnisse gestützt werden. In Zusammenschau mit den Daten aus der Grundlagenforschung scheint einem pro-inflammatorischen Zytokinmuster eine entscheidende Rolle an der Entstehung und Aufrechterhaltung neuropathischer Schmerzen zuzukommen. Für TNF sind entsprechende pathophysiologische Wirkungen bekannt. Anti-inflammatorische Zytokine, wie IL-4 und IL-10 zeigten analgetische Wirkungen im Tierversuch. Die Mitwirkung des IL-2 an peripheren Opioid-Rezeptoren lässt eine endogene periphere Analgesie vermuten. Hieraus lassen sich Folgerungen für zukünftige Diagnostik und Therapie neuropathischer Schmerzen ziehen. Durch Erkennung von Zytokin-Imbalancen wären schmerzhafte PNPs früher einer adäquaten Therapie zuzuführen. Durch die Modulation von Zytokinprofilen im Rahmen schmerzhafter PNPs könnten sich zusätzlich therapeutische Möglichkeiten eröffnen. / BACKGROUND: Pain is a common symptom in peripheral neuropathies. The factors determining why some peripheral neuropathies are painful and others are not are incompletely understood. Pro-inflammatory cytokines have been implicated to play a crucial role in the generation of pain. OBJECTIVE: To investigate whether cytokine profiles differ between patients with painful or painless neuropathy. METHODS: In this prospective study, we analyzed blood mRNA and protein levels of the pro-inflammatory cytokines interleukin-2 (IL-2) and tumor necrosis factor-alpha (TNF) and the anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-10 in 32 patients with painful neuropathy, 20 patients with painless neuropathy, and 38 healthy control subjects, using quantitative real-time PCR and ELISA. RESULTS: Patients with a painful neuropathy had about twofold higher IL-2 mRNA (p = 0.001) and TNF mRNA (p < 0.0001) and protein levels (p = 0.009) than healthy control subjects and about twofold higher IL-2 and TNF mRNA (p = 0.03; p = 0.001) and protein levels (p = 0.04; p = 0.04) than patients with painless neuropathy. In contrast, mRNA levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10 were about twofold higher in patients with painless neuropathy than in patients with painful neuropathy (p = 0.001) and controls (p = 0.004). IL-4 protein levels were 20-fold higher in patients with painless neuropathy (p < 0.0001) and 17-fold higher in patients with painful neuropathy (p < 0.0001) than in healthy control subjects. CONCLUSIONS: A pro-inflammatory cytokine profile seems to be associated with pain in the setting of a peripheral neuropathy, corroborating findings in animal models with experimental painful neuropathies. This may have implications for future treatment strategies.