La validité analytique et clinique des analyses de diagnostic moléculaire est régulièrement remise en doute. Parmi les modalités d’analyse d’acides nucléiques les plus répandues en laboratoire clinique, le génotypage par PCR allèle-spécifique et le séquençage massivement parallèle pour la détection prénatale non-invasive d’aneuploïdies (DPNI) représentent deux des applications les plus importantes en termes de volume. La perte allélique (« allele drop-out »), d’une part, ainsi que l’identification des variables déterminant la performance diagnostique, la disponibilité de matériel de référence et l’estimation de la fraction d’ADN fœtal, d’autre part, sont autant d’enjeux de validité analytique et clinique dont l’impact et la prise en compte dans la translation clinique demeurent à évaluer pour chacune de ces applications respectivement. Des cas représentatifs de ces deux applications furent donc sélectionnés afin d’étudier certains aspects pertinents à chacun de ces enjeux. En accord avec les doutes soulevés par plusieurs auteurs, des lacunes de validité analytique et clinique furent notées pour tous les aspects examinés. En particulier, la plupart des erreurs diagnostiques causées par les événements de perte allélique étaient dues à des phénomènes stochastiques ne pouvant être prévenus par un design d’amorces méticuleux, et les niveaux de précision de la PCR limitent la validité analytique et clinique de la DPNI par séquençage, bien que ce paramètre ne soit pas toujours quantifié et rapporté de façon rigoureuse dans la littérature. Malgré des impacts cliniques potentiels relativement faibles lorsqu’évalués au niveau populationnel, des impacts significatifs peuvent néanmoins affecter les patients au niveau individuel. Des solutions sont disponibles afin de corriger certaines des lacunes identifiées, alors que d’autres posent des défis plus importants. Les causes possibles de ces lacunes de validité affectant le domaine du diagnostic moléculaire sont en partie communes aux causes impliquées dans le problème de reproductibilité des résultats scientifiques en général et en partie le résultat de la complexité technique, relative nouveauté et de la nature historiquement qualitative des méthodes de génétique moléculaire. Une intégration des standards cliniques en amont du processus de découverte pourrait contribuer à améliorer la validité analytique et clinique des tests de diagnostic moléculaire et iii possiblement augmenter le rendement translationnel de la recherche vers la clinique. / The analytical and clinical validity of molecular diagnostic assays are regularly questioned. Among the most commonly used nuclei acid analysis modalities in clinical laboratories, genotyping by allele-specific PCR and non-invasive prenatal aneuploidy testing (NIPT) by massively parallel sequencing, represent two of the most important applications in terms of volume. Allele drop-out on the one hand, as well as identification of variables determining diagnostic performances, reference material availability and fetal fraction estimation on the other, are all examples of analytical and clinical validity issues for which both the impact, and how well they are taken into account, remain to be evaluated for each of these applications respectively. Representative cases of both applications were therefore selected in order to study certain aspects relevant to each of these issues. In accordance with the doubts raised by several authors, lack of analytical and clinical validity was noted for all aspects examined. In particular, most diagnostic errors caused by allele dropout events were due to stochastic phenomena that cannot be prevented by careful primer design, and PCR precision levels were a limiting factor for analytical and clinical validity of NIPT assays, even though this parameter is seldomly adequately quantified and reported in the literature. Although potential clinical impacts were likely modest at the population level, at the individual level, some of the impacts may nevertheless be significant. Solutions to correct some of these problems are available, while others raise more difficult challenges. The possible causes of this lack of validity affecting molecular diagnostics are partly shared with the general problem of lack of repeatability of scientific results and are partly the result of the technical complexity, relative novelty, and the historically qualitative nature of molecular genetic methods. Integrating clinical standards upstream of the discovery process could contribute to improve analytical and clinical validity of molecular diagnostic tests and possibly to increase “bench-to-bedside” translational yield.

Malgré des années de recherche, la mammite est encore la maladie qui engendre le plus de pertes pour les producteurs agricoles du secteur laitier. Il est possible que ce fait puisse s'expliquer en partie par l'effort important investi au niveau de l'amélioration génétique des vaches laitières de manière à favoriser des phénotypes permettant une production supérieure. Cette pression génétique s'est effectuée au détriment de la santé de celles-ci. Afin de corriger cette erreur, des technologies plus récentes sont donc appelées à être mises à contribution. L'identification et la caractérisation des différents microorganismes responsables de cette maladie sont des bonnes étapes vers la possibilité de mieux traiter les animaux atteints et de diminuer l'incidence des infections. L'utilisation de méthodes de détection moléculaires de ces pathogènes amène d'ores et déjà une capacité de diagnostic et un débit d'obtention de résultats difficilement atteignable à l'aide des méthodes d'identification microbiologiques seules, et ce, dans plusieurs domaines. Le secteur agroalimentaire n'y échappe pas et des méthodes de détection moléculaires des pathogènes causant des infections intramammaires menant à la mammite sont disponibles. Toutefois, il est important d'analyser les forces et les faiblesses des systèmes proposés actuellement de manière à évaluer leur utilité dans un cadre pratique pour l'industrie laitière. Le but du travail présenté est de proposer une méthode de détection des pathogènes causant des infections intramammaires en utilisant une approche moléculaire. De plus, celle-ci devait respecter plusieurs critères pré-établis qui sont, selon notre avis, nécessaires pour mettre au point un système qui puisse être vraiment utilisé dans un cadre appliqué. Ainsi, l'approche proposée permet d'identifier tous les pathogènes majeurs responsables de cas de mammite au Canada tout en ayant un coût d'opération raisonnable, une capacité de travail à haut débit automatisé et une sensibilité suffisamment élevée pour être utilisée avec des échantillons de lait. La méthode ainsi développée pour respecter ces critères a permis l'analyse de 273 échantillons de lait provenant de cas de mammite en utilisant une amplification PCR avec amorces fluorescentes suivie d'une électrophorèse capillaire et d'une analyse de fragments assistée par laser. Afin d'évaluer sa validité, les mêmes échantillons ont été analysés préalablement par les méthodes de microbiologie préconisées par le « National Mastitis Council », et ce, dans deux laboratoires indépendants. La méthode fut également validée à l'aide d'échantillons de lait contaminés artificiellement avec une quantité connue de chacun des microorganismes ciblés dans cette étude. Les résultats ont permis de déterminer les paramètres de sensibilité et de spécificité en comparant les résultats moléculaires avec ceux obtenus par les méthodes microbiologiques. Ces paramètres, bien qu'étant essentiels pour juger de la performance d'un outil de diagnostic moléculaire, sont trop souvent ignorés dans les études présentant de telles méthodes. Les travaux présentés sont donc à la fois prometteurs pour le diagnostic rapide de la mammite que pour la possibilité de mettre au point des marqueurs génétiques de résistance à la mammite dans le futur.

Une partie de ce travail de thèse a consisté à appliquer les méthodes de FISH pour l’étude de trois bactéries pathogènes intracellulaires. La viabilité de Bartonella henselae a été évaluée à partir de ganglions de patients atteints de la maladie des griffes du chat (CSD). Le faible taux d’ARN détecté par biologie moléculaire, la stérilité des cultures, l'absence de détection par analyses histologiques et FISH confirment que B. henselae n'est pas ou rarement viable dans les ganglions de patients atteints de CSD. Tropheryma whipplei, l’agent de la maladie de Whipple, a été identifié et localisé par FISH, dans les macrophages d’un ganglion et d’une biopsie pulmonaire, confirmant le diagnostic infectieux. Deux méthodes de FISH ont été testées pour détecter Coxiella burnetii dans des cas d’endocardites et d’infections vasculaires en utilisant des sondes oligonucléotidiques et des sondes PNA. Les résultats ont confirmé une meilleure efficacité des sondes PNA et démontré que les techniques de FISH sont plus sensibles que l’immunohistochimie pour le diagnostic des endocardites et des infections vasculaires à C. burnetii. Nous avons également évalué les stratégies moléculaires mises en place pour le diagnostic syndromique. Bien que la PCR conventionnelle à large spectre permette l'identification de micro-organismes fastidieux et anaérobies, la PCR spécifique en temps réel révèle une supériorité significative dans le diagnostic syndromique. En conclusion, ce travail a permis de démontrer l’efficacité et l’applicabilité de la FISH pour la détection bactérienne. Cette méthode peut être utilisée comme un outil complémentaire afin d'améliorer le diagnostic de microbiologie clinique. / We applied FISH methods to the study of three intracellular pathogenic bacteria. The viability of Bartonella henselae was evaluated in a large series of lymph nodes from patients with cat scratch disease (CSD). The results obtained, associated with sterile cultures and negative histological analyzes and FISH, as well as the low level of RNA detected by molecular biology, provide evidence that B. henselae are not or are rarely viable in the lymph nodes of patients with CSD. Tropheryma whipplei has been identified by FISH in macrophages from one lymph node and for the first time in a pulmonary biopsy, confirming the diagnosis of infection. Two methods of FISH have been tested to detect Coxiella burnetii in cases of endocarditis and vascular infections using oligonucleotide and PNA probes. The results attested to the greater efficiency of PNA probes, and demonstrated that FISH were applicable for the diagnosis of C. burnetii endocarditis. We also evaluated the molecular strategies used for syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Although conventional broad-spectrum PCR allows for the identification of fastidious and anaerobic microorganisms, real-time specific PCR reveals a significant superiority in syndrome-driven diagnosis. The addition of specific PCRs in real time PCR would improve our molecular strategies, for example, in the case of the detection of Staphylococcus aureus for the diagnosis of lymphadenopathy. In conclusion, this work demonstrates the effectiveness and applicability of FISH for the identification of intracellular bacteria. This method can be used as an important complementary tool to the improvement of clinical microbiological diagnosis.

La brucellose est une zoonose causée par le genre bactérien Brucella (B.) dont l’incidence mondiale est estimée à 500 000 cas humains par an. Le réservoir est animal, touchant principalement les espèces de rente. Les espèces les plus importantes pour l’Homme sont B. melitensis, B. abortus et B. suis qui partagent plus de 90% d’identité de séquence. Bien qu’elles soient très apparentées sur le plan génétique, elles présentent une diversité de caractéristiques phénotypiques, de préférence d’hôte et de pathogénicité. L’homogénéité génétique de ces espèces peut apparaître comme un atout pour le développement d’outils de diagnostic universels robustes. En revanche, il s’agit d’un challenge pour les distinguer, rendant difficile la caractérisation précise des isolats issus d’un même foyer. Dans le cadre de cette thèse, un outil de diagnostic moléculaire de PCR en temps réel ciblant le genre Brucella a été développé et optimisé. L’outil a été évalué sur des prélèvements de lait de ruminants, ces prélèvements peuvent être une source importante de Brucella et peuvent être utiles au dépistage de la maladie à l’échelle du troupeau. Basée sur la détection de l’élément d’insertion IS711, une séquence présente en plusieurs exemplaires dans le génome, cette méthode affiche des valeurs de sensibilité et de spécificité qui la rendent intéressante pour un schéma global de lutte contre la brucellose. D’autre part, en vue d’améliorer la compréhension de la stabilité génétique de B. melitensis, un panel original de souches isolées dans le cadre d’un foyer et impliquant 4 espèces d’hôtes différentes a été comparé. Ainsi à l’aide de différentes approches complémentaires, leurs séquences génomiques, les caractères phénotypiques ainsi que leurs comportements dans un modèle in vitro ont été comparés. Nos résultats n’ont pas mis en évidence marqueurs qui laisserait à penser que des mutations dans le génome soient indispensables pour s’adapter à un nouvel hôte / Brucellosis is a zoonotic disease caused by the bacterial genus Brucella (B.), whose global incidence is estimated at 500,000 human cases per year. The reservoir is animal, affecting mainly livestock. The most important species for humans are B. melitensis, B. abortus and B. suis, which share more than 90% sequence identity. Although highly genetically related, Brucella spp. exhibit a variety of phenotypic characteristics, host preference and pathogenicity. The genetic homogeneity of these species may appear as an asset for the development of robust universal diagnostic tools. On the other hand, it is a challenge to distinguish them, making it difficult to precisely characterize isolates from the same outbreak. As part of this thesis, a real-time PCR molecular diagnostic tool targeting the genus Brucella was developed and optimized. The method has been evaluated on ruminant milk samples; these samples may be an important source of Brucella and may be useful for herd-scale disease screening. Based on the detection of the IS711 insertion element, a sequence present in several copies within the genome, this method displays sensitivity and specificity values that make it interesting for a global scheme to fight against brucellosis. On the other hand, in order to improve the understanding of the genetic stability of B. melitensis, an original panel of strains isolated in an outbreak and involving four different host species was compared. Thus, using different complementary approaches, their genomic sequences, phenotypic characteristics and their behavior in an in vitro model were compared. Our results did not highlight markers that would suggest that mutations in the genome are essential to adapt to a new host

Le domaine du diagnostic moléculaire connait un essor impressionnant depuis plusieurs dizaines d’années. Différents outils d’analyse d’interactions moléculaires sont présents sur le marché. La plupart d’entre eux sont basés sur des tests immunologiques utilisant la fluorescence comme technique de lecture. Or, l’utilisation de techniques de détection avec marquage comme la fluorescence augmente le coût d’une analyse et peut dénaturer un échantillon. Dans cette perspective, une technique de lecture optique sans marquage, qui est une alternative à la fluorescence, a été développée. Le principe de lecture est basé sur le suivi des modifications du spectre de diffraction de réseaux périodiques, composés de molécules sondes, lors d’interactions avec différentes solutions à analyser. Cette thèse CIFRE est le fruit d'une collaboration entre le LAAS CNRS et la société Innopsys, spécialisée dans la commercialisation d'outils de lecture optique. Elle porte sur le développement d’une plateforme dédiée à l’analyse biomoléculaire (ADN, protéines) au travers de l’utilisation de biopuces multiplexées et d’un instrument de lecture optique sans marquage automatisée. Nous montrons que cette technologie de biodétection sans marquage nécessite le développement d’une chimie de surface permettant l’organisation de molécules sondes en réseaux de lignes périodiques, tout en minimisant l’adsorption non-spécifique entre les lignes. Nous présentons l’optimisation d’un procédé de bi-fonctionnalisation de surface, qui met en jeu un dépôt multiplexé par microcontact printing sur des couches de polymères passivantes. Ces surfaces structurées à l’échelle moléculaire ont permis la détection d’interactions protéines/protéines sans marquage et le concept semble également transférable pour la détection d’hybridation de courtes séquences d’ADN / Development of bioassays has become the matter of intense research in the field of molecular diagnostic. Biodetection techniques have been drastically used in laboratory since the past 20 years and tend now to reach the in-vitro diagnostic industry. Most commercially available biosensing methods rely on immunoassays and use fluorescence as reading technique. However, the use of labeling methods such as fluorescence increases the cost of a single bioassay and may interfere with the biological functions of molecules. In this perspective, we have developed an optical label-free technique of microarray reading, which is an alternative to fluorescence. In this work, we use a label free biosensing method based on the diffraction of light by molecular gratings. Molecular gratings are employed as diffractive probe arrays for protein interaction analysis, as the diffraction efficiency changes in response to analyte binding. This Ph.D is supported by the French company Innopsys, which provides optical solutions for microarray reading and the Nanobiosystems group at the LAAS-CNRS. This work deals with the development of a detection platform for biomolecular interactions analysis, through the use of multiplexed biochips and the validation of an optical scanner. We present a special surface chemistry, based on blocking layers to reduce the non-specific protein adsorption and consequently decrease the limit of detection. Thanks to bi-functionalized biochips and this label free instrument, we have detected proteins interactions involving low molecular weight molecules

Le phénomène de multirésistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram positif causant des infections sévères du sang est un problème mondial grandissant. La détection du niveau de sensibilité aux antibiotiques avec des tests phénotypiques requière un minimum de 48 h avant l'obtention des résultats. Il est donc nécessaire de développer des tests de diagnostic rapides, sensibles, spécifiques et ubiquitaires pour améliorer le traitement des septicémies. Ce mémoire de maîtrise présente le développement d'un test de diagnostic moléculaire permettant la détection rapide des gènes de résistance aux antibiotiques cliniquement importants associés aux bactéries à Gram positif causant des septicémies. Ce test comprend 4 essais PCR multiplex combinés à une hybridation microfluidique sur puces à ADN intégrées à un disque compact. Les corrélations obtenues entre les résultats génotypiques et phénotypiques étaient de 98% pour les P-lactamines et de 100% pour la vancomycine, la clindamycine et la gentamicine. Cette approche moléculaire pourrait éventuellement être utilisée pour le diagnostic clinique afin de guider l'antibiothérapie des patients atteints d'une septicémie.

Problématique : De nombreuses recherches sont actuellement menées afin de découvrir des biomarqueurs pour aider les pathologistes à poser des diagnostics et pour éclairer les cliniciens dans le choix du meilleur traitement pour le cancer du sein. Ces biomarqueurs sont de diverses natures et plusieurs sont issus des caractéristiques de la tumeur. Mon projet de recherche visait à déterminer la valeur pronostique de marqueurs de méthylation de gènes candidats (PLAU (plasminogen activator, urokinase), RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs) et TIMP3 (TIMP metallopeptidase inhibitor 3)) principalement impliqués dans le processus d’angiogenèse. Approches méthodologiques et résultats: Nous avons étudié une population de 254 patientes diagnostiquées d’un cancer du sein entre 1983 et 1993, pour lesquelles les spécimens tumoraux ont été fixés au Bouin et congelés. Les informations clinicopathologiques sont disponibles pour ces patientes (âge, indice de masse corporelle, ER, PgR, taille de la tumeur, grade histologique, statut des métastases ganglionnaires, type histologique et densité des microvaisseaux). Préalablement à l’analyse des spécimens de la population à l’étude, nous avons développé une approche quantitative afin d’évaluer le statut de méthylation des gènes candidats. Une fois l’ADN isolé par microdissection à partir des spécimens tumoraux congelés, celui-ci a été traité avec une enzyme de restriction spécifique aux sites méthylés et soumis à des réactions spécifiques de polymérisation en chaîne (PCR). La spécificité, la linéarité et la reproductibilité de cette approche ont été clairement démontrées par comparaison avec des échantillons standardisés ainsi que sur des lignées cellulaires. En parallèle, une approche immunohistochimique automatisée a été développée pour évaluer l’expression de marqueurs tumoraux du sein. Nous avons démontré qu’il est possible d’obtenir des résultats semblables soit en faisant des marquages immunohistochimiques sur des coupes histologiques de tissus fixés au Bouin et enrobés dans la paraffine en utilisant une technique validée soit en faisant des immunohistochimies sur des coupes histologiques de spécimens fixés dans le formol tamponné neutre. Cette étape était nécessaire afin d’évaluer l’expression de gènes (ER, PgR, HER2, CK5/6, EGFR, P63, ECAD) reconnus pour la classification et la caractérisation des carcinomes mammaires. Enfin, l’étude du statut de méthylation de 3 gènes candidats a été effectuée sur les spécimens de la population à l’étude en utilisant les approches citées ci-haut. Une première observation révèle une association significative entre le statut de méthylation, du gène RECK et la survie spécifique au cancer du sein en analyse univariée (régression de Cox : rapport de risque (Hasard Ratio (HR) = 0.72; 95 % intervalle de confiance (IC), 0,53 to 0,98; P = 0,037) mais non significative en analyse multivariée (RR = 0,75; 95 % IC, 0,54 to 1,03; P = 0,075). Alors que l’atteinte ganglionnaire est un facteur de mauvais pronostic (RR = 6,07; 95 % IC, 4,30 to 8,55; P < 0,001), nous avons observé une interaction significative entre le statut des ganglions lymphatiques et celui du gène RECK (Pinteraction = 0,0011). En analyses multivariées, chez les patientes sans envahissement ganglionnaire, une association significative est observée entre la présence de méthylation du gène RECK et une augmentation de la survie (HR = 0,30; 95 % IC, 0,14 to 0,64; P = 0,002). Cependant, chez les patientes avec métastases ganglionnaires, la présence de méthylation du gène RECK est associée à une diminution de la survie (HR = 1,51; 95 % IC, 1,00 to 2,3; P = 0,05). Une association entre la présence de méthylation du gène TIMP3 et une meilleure survie a été observée mais celle-ci est non significative. Le marqueur de méthylation uPA testé dans notre étude n’est pas associé à la survie. Conclusion: Nous avons démontré que la méthylation du gène RECK dans le cancer du sein est associée à la survie. Nous avons également observé que cette association varie selon le statut de l’envahissement ganglionnaire. Cette étude mériterait d’être répliquée dans une population indépendante présentant les mêmes caractéristiques. / Purpose: Studies are now conducted to find new biomarkers to help clinicians diagnose and treat breast cancers. The purpose of my research project was to determine the prognostic value of DNA methylation markers of selected genes (PLAU (plasminogen activator, urokinase), RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs) and TIMP3 (TIMP metallopeptidase inhibitor 3)) which are mainly involved in the process of angiogenesis. Methods and results: We studied a population of 254 patients diagnosed with breast cancer between 1983 and 1993, for which a part of the tumor specimens was fixed in Bouin and embedded in paraffin and the other part was frozen. The clinicopathological characteristics were available for these patients (age, body mass index, ER, PgR tumor size, histological grade, lymph node metastasis status, histological type and microvessel density). Prior to the analysis of specimens from the study population, we developed a quantitative approach to assess the methylation status of candidate genes. Once the DNA is isolated by laser-capture microdissection from frozen tumor specimens, it was treated with a methylation sensitive restriction enzyme and subjected to specific polymerase chain reaction (PCR). Specificity, linearity and reproducibility of this approach have been clearly demonstrated by comparison with standard samples and cell lines. In addition, an automated immunohistochemical approach has been successfully evaluated showing that the expression of tumor markers on histological sections of tissues fixed in Bouin and embedded in paraffin, is similar to that of specimens fixed in neutral buffered formalin. This step was necessary to evaluate the expression of genes (ER, PgR, HER2, CK5/6, EGFR, P63, ECAD) recognized for the classification and characterization of breast carcinomas. Finally, the study of methylation status of three candidate genes was performed on specimens in the study population evaluated using the approaches above. A first observation showed a significant association between the methylation status of RECK gene and breast cancer-specific survival in univariate analysis (hazard ratio (HR) = 0.72, 95% confidence interval (CI), 0.53 to 0.98, P = 0.037) but not significant in multivariate analysis (HR = 1.01, 95% CI, 0.72 to 1.41, P = 0.96). While the lymph node is a bad prognostic factor (HR = 6.07, 95% CI, 4.30 to 8.55, P < 0.001), we observed a significant interaction between lymph node status and the RECK gene (Pinteraction = 0.0011). In multivariate analysis, among patients without nodal involvement, a significant association between the presence of methylation of RECK gene and an increase in survival was observed (HR = 0.30, 95% CI, 0.14 to 0.64, P = 0.002). For patients with lymph nodes metastasis, an association between the presence of methylation of RECK gene and a decrease in survival was observed (HR = 1.51, 95% CI, 1.00 to 2.3, P = 0.05). An association between the presence of methylation of TIMP3 gene and a better survival was observed but was not significant. The uPA methylation markers tested in our study are not associated with survival. Conclusion: We observed that the methylation status of RECK gene is associated with survival of patients with breast cancer. We also observed that this association varies with lymph node metastasis status. This study needs to be replicated in an independent population with similar characteristics.

La technologie des biopuces permettrait une détection rapide et multiparamétrique des microorganismes infectieux et des gènes de résistance aux antibiotiques qui leur sont associés. Deux aspects des biopuces ont été étudiés durant ce projet. Premièrement, dans le but de faciliter la conception des sondes de capture, nous avons évalué l’influence de la position de la cible hybridée par une sonde. Nous avons observé que la longueur des chaînes non-hybridées dépassant de la sonde de capture avait une influence sur le signal d’hybridation obtenu et pouvait être responsable de faux-négatifs. Deuxièmement, afin de contribuer à éliminer la nécessité de l’amplification et du marquage des acides nucléiques cibles, nous avons développé une biopuce composée de sondes APN immobilisées sur une lame de verre. Cette biopuce permettra l’utilisation d’un polymère cationique senseur d’acides nucléiques comme transducteur de l’hybridation. / Biochip technology could allow rapid multiparametric diagnosis of infectious diseases and related antimicrobial resistance genes. Two aspects of biochips were studied during this project. First, to facilitate DNA or PNA capture probes design, we studied the impact on hybridisation signal of the position targeted by the probe. We observed that the length of the target’s non-hybridised overhangs had an influence on obtained hybridisation signal and that it could be responsible for false-negatives. Second, in order to contribute to the elimination of sample nucleic acids amplification and labelling before hybridisation, we developed a biochip made of PNA probes immobilised on a glass slides. This biochip allows detection using a soluble fluorescent cationic polythiophene that acts as hybridisation transducer.

Les maladies fongiques du bois de la vigne que sont le syndrome de l'esca, le Black Dead Arm (BDA) et l'Eutypiose sont particulièrement dommageables à la profession vitivinicole, et sont actuellement en progression. Le temps d'incubation nécessaire à l'expression de ces maladies au champ complique l'évaluation de solutions préventives adaptées en condition contrôlée ainsi qu'en condition de terrain. Ces travaux de thèse ont eu pour objectifs la conception et la validation de tests PCR quantitatifs en temps réel (RtqPCR), permettant la détection et la quantification in planta de cinq champignons associés aux maladies de dépérissement de la vigne, Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum (esca), Diplodia seriata et Neofusicoccum parvum (BDA), et Eutypa lata (Eutypiose). Le développement de tests multiplexes a ensuite été entrepris et ces derniers ont été évalués pour la détection de quatre champignons (2 associés à esca et 2 au BDA) dans le bois de jeunes plants issus de pépinière viticole. Enfin, l'étude de l'interaction in planta de deux champignons associés au syndrome de l'esca de la vigne (P.chlamydospora et P.aleophilum) a été réalisée par RT-qPCR, et complétée par la caractérisation histologique de la réponse de la plante à la blessure dans le bois, en inoculation individuelle et en co-inoculation. / Grapevine trunk diseases, among which esca's syndrome, Black Dead Arm (BDA) and Eutypiosis, represent a real threat for grape and wine industry. Incubation time required before symptoms externalization in field complicates the evaluation of the efficacy of preventive solution in control and field conditions. These thesis's works focused on the design and the validation of Real Time quantitative PCR assays (RT-qPCR), in order to detect and quantify in vine plant five fungi associated with grapevine trunk disease, Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum (esca), Diplodia seriata et Neofusicoccum parvum (BDA), et Eutypa lata (Eutypiosis). The development of multiplex assays was undertaken and these last were evaluated in order to detect four fungi (esca and BDA) in wood sample from young plants in vine nursery. Finally, a study of the interaction between two fungi associated with esca's syndrome has been determined in planta through RT-qPCR, and completed by a histological analysis of plant response to injury of woody tissues.

Ce mémoire de maîtrise présente les travaux liés au développement d’une technologie permettant de faciliter la conceptualisation des nouveaux outils de biologie moléculaire. Cette nouvelle technique est centrée sur la détection d’acides nucléiques et a été développée dans un contexte de diagnostic des maladies infectieuses. Ce mémoire est centré sur deux principales techniques : la PCR en temps réel (rtPCR) et l’hybridation sur biopuce. Notre technologie permet la réalisation de ces deux réactions biochimiques complexes dans une même chambre réactionnelle et dans un seul et même tampon, ceci à l’aide d’un oligonucléotide structuré. Le premier chapitre décrit les différentes techniques de rtPCR et les différents paramètres d’hybridation sur biopuce. Les principes directeurs de la recherche sont présentés dans le deuxième chapitre. Le troisième chapitre comporte le manuscrit démontrant la faisabilité de notre nouvelle technologie. Finalement, le quatrième chapitre discute des perspectives du projet.