Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-18T20:17:52Z No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-18T20:17:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina, afetando mais de 15 milhões de pessoas. Como seu tratamento apresenta eficácia limitada e considerável toxicidade novas drogas são necessárias. Neste contexto, com a colaboração de grupos de química medicinal, nosso objetivo é a investigação da atividade tripanocida, seletividade, alvos celulares e mecanismos de ação de diamidinas aromáticas (DAs) e análogos. Inicialmente avaliamos o efeito tripanocida de onze DAs sobre as formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares, assim como sua toxicidade para células de mamíferos e localização intracelular no parasito. Entre estes onze compostos, 2, 5 e 7 foram os mais ativos, com valores de IC50 na faixa micromolar e um alto índice de seletividade sobre as duas formas de T. cruzi. Através de microscopia de fluorescência (MF) foi possível localizar todos os compostos em organelas ricas em DNA, núcleo e mitocôndria (kDNA) e a análise ultraestrutural utilizando os compostos 5 e 7 revelou que estes compostos levam a danos mitocondriais, incluindo desorganização do kDNA em formas tripomastigotas. O acúmulo das diamidinas foi maior no kDNA do que no núcleo, porém tal acúmulo não está correlacionado a uma maior atividade tripanocida. A seguir, visando um melhor entendimento do mecanismo de ação de diamidinas e análogos, investigamos uma possível correlação entre as propriedades de ligação ao kDNA de treze compostos com a atividade tripanocida, através de estudos de desnaturação térmica (Tm) e dicroísmo circular (DiC). Nossos resultados mostram tanto com kDNA purificado de epimastigotas como com uma sequência conservada de 22-mer presente em minicírculos de T. cruzi, que a forte interação de amidinas ao kDNA não é o fator determinante para desencadear sua atividade tripanocida. Nosso próximo passo foi a avaliação de alterações topológicas induzidas por dez compostos aromáticos sobre o kDNA de T. cruzi através de alteração da mobilidade em gel e MF. Os estudos eletroforéticos foram conduzidos pela incubação de fragmentos de kDNA, obtidos pela digestão com as endonucleases EcoRI e CvQI, com os compostos por análise em gel de poliacrilamida. As diamidinas DB889 e DB185 induziram consideráveis alterações na mobilidade dos fragmentos. Além disso, incubando a rede intacta e purificada de kDNA com a DB75 e monitorando o efeito por MF, obervarmos a capacidade desta DA de induzir um grande aumento da área da rede. Em resumo, nossos resultados revelam que diamidinas e congêneres são capazes de induzir profundas alterações na topologia do kDNA do T. cruzi sugerindo que esta estrutura pode ser um dos possíveis alvos destes compostos. Entretanto, a localização preferencial dos compostos no kDNA, assim como sua afinidade à esta estrutura e capacidade de alterar a mobilidade dos fragmentos em géis de poliacrilamida não está correlacionada com sua atividade tripanocida. Estes dados sugerem fortemente que outros fatores podem estar envolvidos no mecanismo de ação destes compostos, operando de modo primário ou secundário a interação composto:kDNA. Outros estudos serão necessários para melhor identificar os mecanismos envolvidos na ação destes compostos, visando contribuir para o desenho racional de compostos líderes para o tratamento da doença de Chagas. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America, affecting more de 15 million people. Due to the limited efficacy and considerable toxicity, the therapy for Chagas disease is far from being considerable ideal and thus alternative drugs are urgently needed. In this context, with the collaborations of medicinal chemistry groups, our aim was to investigate the trypanocidal activity, selectivity, cellular targets and mechanisms of action of aromatic diamidines (ADs) and analogues. First, we tested the trypanocidal effect of eleven ADs upon intracellular amastigotes and trypomastigotes, their toxicity towards mammalian cells and their sub-cellular localization. Compounds 2, 5 and 7 were the most active, presenting IC50 values on the micromolar range and displaying high selectivity indexes for both T. cruzi forms. Using fluorescence microscopy (FM), all the compounds were localized in organelles rich in DNA, nucleus and mitochondrion (kDNA) and in bloodstream forms treated with the compounds 5 and 7 we observed ultrastructural damages on mitochondrial organelle, including kDNA disorganization. The accumulation of the diamidines was higher in the kDNA than in the nucleus, but such accumulation could not be correlated with a higher trypanocidal activity. Next, aiming to better understand the mechanism of action of diamidines and analogues, we investigated the possible correlation between kDNA binding properties of thirteen compounds with their anti-T. cruzi effect, through thermal denaturation (T m) and circular dichroism (CiD) studies. Our data demonstrated using the purified kDNA of epimastigotes or a conserved synthetic parasite sequence of 22-mer present in T. cruzi minicircles, that the strong interaction of the amidines with the kDNA is not a determinant factor to the triggering of the trypanocidal activity. Our next step was the evaluation of topological changes induced by ten aromatic compounds on T. cruzi kDNA, through gel mobility shifts and FM. The eletrophoretic studies were conducted by the incubation of kDNA fragments obtained by digestion with the endonucleases EcoRI e CvQI with the compounds and analysis by poliacrylamide gel. The diamidines DB889 and DB185 induced substantial mobility shifts in the fragmented bands. Additionally, by FM of whole kDNA network incubated with DB75 we observed the ability of this diamidine to cause a striking expansion of the kDNA network area. Taken together our results suggest that diamidines and related compounds provoke profound alterations in the normal topology of T. cruzi kDNA suggesting that this structure may represent one of the potential targets of these compounds. However, the compound preferential accumulation in kDNA, as well as their affinity and capability of inducing topological changes in that structure is not correlated with their anti-T. cruzi activity. These findings strongly suggest that other molecular mechanisms may be also operating primarily or secondarily to the drug:KDNA interaction. Further studies are needed to better identify the mechanisms involved in the activity of this class of chemical, aiming to contribute to the rational design of lead compounds for the treatment of Chagas disease .

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to develop and to evaluate the therapeutic efficacy of liposomes diminazene aceturate and in vitro and by using mice experimentally infected with Trypanosoma evansi. In vitro tests were performed in culture medium at concentrations of 0.25, 0.5, 1, 2 and 3 mg/ml of diminazene aceturate convetional (CDMZ) and liposomal (L-DMZ). A total of 114 rats (Rattus norvegicus) were used of in vivo test. These rats were divided into 6 groups (A, B, C, D, E and F). Group A served as a negative control (uninfected and untreated). Rats in Group B served as a positive control and were infected with T. evansi. Animals in Group C were infected and treated with L-DMZ (single dose, 3.5 mg/kg-1), Group D was composed with infected and treated with C-DMZ animals (single dose, 3.5 mg/kg-1), Group E infected treated with L-DMZ animals for 5 consecutive days (3.5 mg/kg-1/dia) and Group F infected treated with C-DMZ animals for 5 consecutive days (3.5 mg/kg-1/dia). In vitro, a dose-dependent trypanocidal effect of L-DMZ was observed against the parasite. In vivo, the efficacy of L-DMZ and C-DMZ in different therapeutic protocols was similar. The analysis of biochemical and histological parameters on the 7th and 40th post-treatment revealed alterations in liver and kidney enzymes, and histological alterations in the structure of organs, especially in the animals treated with L-DMZ at 5 consecutive days. The results of this study showed that liposomal formulations may be a new alternative for the treatment of tripanosomoses, but future research could be undertaken to improve the conduction of liposomes and direction for greater efficiency. / Este estudo teve como objetivo desenvolver e testar lipossomas de aceturato de diminazeno em testes in vitro e in vivo visando o controle de Trypanosoma evansi. O teste in vitro foi realizado em meio de cultura nas concentrações de 0,25, 0,5, 1, 2 e 3 μg/mL de aceturato de diminazeno convencional (C-DMZ) e lipossomal (L-DMZ). Para os testes in vivo foram utilizados 114 ratos (Rattus norvegicus) divididos em seis grupos (A, B, C, D, E e F) em dois experimentos, um para avaliar a eficácia e outro para analisar os parâmetros bioquímicos e histológicos. O grupo A foi utilizado como controle (animais sadios), B (animais infectados e não tratados), C (animais infectados e tratados com aceturato de diminazeno lipossomal com dose única 3,5 mg/kg-1), D (animais infectados e tratados com aceturato de diminazeno convencional com dose única 3,5 mg/kg-1), E (animais infectados e tratados com aceturato lipossomal por 5 dias consecutivos com a dose de 3,5 mg/kg-1/dia) e grupo F (animais e infectados tratados com aceturato convencional por 5 dias consecutivos com a dose de 3,5 mg/kg-1/dia). O teste in vitro com o lipossoma de aceturato de diminazeno mostrou uma maior mortalidade dose-dependente do T. evansi em meio de cultura se comparado ao medicamento comercial e os parasitos morreram mais rapidamente que nos grupos de aceturato de diminazeno convencional e controle. Nos resultados dos testes in vivo, a eficácia do aceturato de diminazeno lipossomal e convencional nos diferentes protocolos terapêuticos foram similares. A análise dos parâmetros bioquímicos e histológicos realizados no 7º e 40º pós-tratamento revelaram alterações nas enzimas hepáticas e renais, além de modificações na estrutura dos órgãos, principalmente nos animais tratados com lipossomas na maior dosagem. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que as formulações lipossomais podem ser uma nova alternativa para o tratamento das tripanossomoses. Futuras pesquisas poderiam ser realizadas para melhorar o carreamento e a direção dos lipossomas para uma maior eficácia.