La protéine FUR (Ferric Uptake Regulator) est un régulateur global ubiquitaire chez les bactéries Gram-négatives. Sa liaison au Fe2+, in vivo, entraîne la répression de l'expression des gènes qu'elle contrôle. Ce travail est une étude structurale par RMN de la forme dimérique non activée de FUR d'Escherichia coli, un dimère de 2*17 kDa contenant un ion zinc par monomère. Une forme monomérique oxydée, capable de dimériser en présence de réducteur et de zinc, a également été isolée et étudiée. Le dichroïsme circulaire et la RMN montrent que la dimérisation entraîne une structuration du domaine C-terminal lors de l'incorporation du zinc. Les structures secondaires du domaine N-terminal du monomère et du dimère sont très proches. Seuls les premiers résidus sont structurés en hélice Α dans le monomère et déstructurés dans le dimère non activé. Cette hélice, observée dans le dimère activé de FUR de P. aeruginosa, pourrait jouer un rôle dans le mécanisme de régulation. Une protéine tronquée (FUR1-82) a été construite, purifiée, cristallisée. Sa structure est superposable à celle du domaine N-terminal de FUR de P. aeruginosa et le spectre 1H-15N-HSQC est superposable aux signaux du domaine N-terminal de FUR monomère. L'étude, par anisotropie de fluorescence, de la liaison du monomère et du dimère à l'ADN montre qu'ils se lient spécifiquement à l'ADN en présence de métal, contrairement à la forme tronquée. L'affinité du monomère pour l'ADN est 5 fois plus faible que celle du dimère en excès de métal. L'ensemble de ces données nous a permis de proposer un mécanisme de dimérisation de FUR d'E. coli ainsi qu'un mécanisme d'activation mettant en jeu cette hélice Α N-terminale.

L'objectif principal de cette thèse est l'étude spectroscopique de molécules ou de complexes portant plusieurs centres chiraux en phase gazeuse, pour comprendre les effets de la stéréochimie sur leurs propriétés structurales. Des alcaloïdes dérivés de la Cinchonine ont été introduits intacts en phase gazeuse par ablation laser. Ils ont été étudiés en combinant un jet supersonique avec de la spectroscopie laser. Les deux pseudo-énantiomères Quinine et Quinidine ont montré des spectres électroniques et vibrationnels similaires, en accord avec leur structure similaire. Leurs propriétés en solution diffèrent davantage, comme le montrent les expériences de dichroïsme circulaire vibrationnel (VCD). Cette différence est encore plus marquée dans l'Hydroquinine et l'Hydroquinidine. Enfin la reconnaissance chirale a été étudiée dans des complexes ioniques dans un piège à ions. La stabilité des complexes formés entre S-camphre et les R et S-Alanine protonées indique une préférence homochirale. Cependant, l'énergie d'interaction calculée ainsi que les spectres IRMPD dans la région des empreintes digitales sont identiques. Le rôle des conformères plus hauts en énergie dans la reconnaissance chirale a été discuté.

Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) est une protéine cytosolique dont le rôle est de réguler la concentration de fer intracellulaire chez les métazoaires par un mécanisme post-transcriptionnel. Elle interagit avec certains ARN messagers au niveau de motifs spécifiques appelés IRE (Iron Responsive Element) situés dans leurs régions non traduites et modifie la synthèse des protéines correspondantes. En présence de fer, IRP1 perd cette capacité de fixation, intègre un agrégat [4Fe-4S] et acquiert une activité aconitase. La régulation s'effectue donc par un processus d'assemblage et de désassemblage du centre fer-soufre.<br />La réactivité de la protéine recombinante IRP1 humaine, purifiée sous sa forme aconitase [4Fe-4S], a été étudiée vis à vis d'autres effecteurs que le fer capables de modifier l'activité des IRP. Ainsi des excès assez modestes de diverses espèces réactives de l'oxygène ne peuvent former que l'espèce [3Fe-4S] de la protéine. La doxorubicine, un composé cytostatique utilisé comme anti-cancéreux, a une action sur IRP1, mais elle dépend des conditions d'application et implique certainement des mécanismes multiples. In vitro, IRP1 est complètement activée pour la fixation d'ARN par un fort excès de 2-mercaptoéthanol. Parmi les diverses causes possibles de cet effet, les propriétés de solvant de ce produit (comme de l'éthanol) en sont responsables.<br />La recherche d'éventuels partenaires physiologiques de la protéine IRP1 a été entreprise par une étude double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae, mais les constructions utilisées n'ont pas permis de déterminer de candidats potentiels. L'utilisation d'autres constructions ainsi que d'autres systèmes double hybride est envisagée pour la poursuite de cette étude.<br />Une nouvelle méthode de dosage de l'activité de fixation au motif IRE a été envisagée par l'utilisation d'un substrat fluorescent et de l'électrophorèse capillaire. Les résultats préliminaires obtenus n'ont pas encore abouti, mais ils contribuent à donner des orientations pour le développement de cette méthode présentant de nombreux avantages.<br />Des changements de conformation entre les deux formes actives de IRP1 ont été analysés par deux méthodes structurales en solution. La formation de certains éléments de structure secondaire d'IRP1 dépend de l'état d'activité de la protéine et ils sont sensibles à la fixation des substrats. Les propriétés hydrodynamiques d'IRP1 varient aussi lors de ces différents changements. Faute de structure à haute résolution, ces informations permettent toutefois de se représenter le comportement structural d'IRP1 dans son rôle de régulateur.

Ce travail de thèse porte sur l'étude de la dynamique du retournement de l'aimantation de multicouches magnétiques par des effets magnéto-optiques : l'effet Kerr et le dichroïsme magnétique circulaire des rayons X (XMCD). Une partie de ce travail a porté sur l'étude de multicouches (Pt/Co) à anisotropie perpendiculaire couplées par échange à un antiferromagnétique. Des mesures de microscopie Kerr résolues en temps ont permis de montrer que les processus de retournement de l'aimantation dépendent fortement de la force du couplage d'échange. La présence de frustrations magnétiques à l'interface induit une augmentation de la densité de domaines inverses. De plus la densité de nucléation est plus importante lorsque le champ appliqué s'oppose au champ d'échange, cet effet est attribué à l'inhomogénéité du couplage. La seconde partie de ce travail consiste en l'étude du renversement de l'aimantation de jonctions tunnel magnétiques Co/Al2O3/FeNi déposées sur des substrat à accumulation de marches. L'évolution temporelle de la structure en domaines magnétiques est étudiée avec une technique originale, la microscopie à électrons photo-émis couplée au XMCD. Dans ces systèmes, nous avons démontré que la topographie de la tricouche joue un rôle important sur le renversement de l'aimantation. Grâce à la sélectivité chimique du XMCD, l'effet du champ de fuite des parois de domaine dans la couche de cobalt sur l'aimantation de la couche de permalloy a aussi été étudié. Nous avons montré que ce champ de fuite est suffisant pour générer des quasi-parois dans la couche de permalloy, ce qui permet un retournement de l'aimantation localement plus rapide.

La spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) est une des techniques fondamentales en biologie structurale qui permet la détermination du contenu en structures secondaires d'une protéine. Le rayonnement synchrotron a considérablement augmenté l’utilité de la méthode, car il permet de travailler avec une gamme spectrale étendue et à meilleure intensité. Le développement de modèles permettant d’établir une relation entre la structure d’une protéine et son spectre CD d’une manière efficace n’a pourtant pas suivi l’évolution technique et l’analyse de spectres CD de protéines entières reste un défi sur le plan théorique. Dans ce contexte, nous avons développé un modèle "minimaliste" pour la spectroscopie CD des protéines, où chaque atome C-alpha de la chaîne principale porte un oscillateur de Lorentz classique, i.e. une charge mobile qui est tenue par un potentiel quadratique. Les oscillateurs sont couplés par un potentiel coulombien et leurs déplacements suivent les tangentes locales respectives de la courbe spatiale décrite par les atomes C-alpha. Le système d'oscillateurs est couplé à une onde électromagnétique plane décrivant la source de lumière et le phénomène d'absorption est modélisé par des forces de friction. Nous montrons que le modèle reproduit correctement le phénomène CD d'une chaîne polypeptidique hélicoïdale et en particulier son signe en fonction de l'orientation de la chaîne. Comme première application, nous présentons l'ajustement du modèle au spectre CD d'un polypeptide composé de 15 résidus qui se plie sous forme d'une hélice alpha. La transférabilité de ces paramètres est ensuite évaluée pour la myoglobine, une protéine de 153 résidus contenant 8 hélices alpha. / Circular dichroism (CD) spectroscopy is one of the fundamental techniques in structural biology that allows us to investigate the secondary structure of proteins. Synchrotron radiation has considerably increased the usefulness of the method because it allows to work with a wider range of spectrum and much greater signal-to-noise ratios. The development of a theoretical model to establish a relationship between the structure of a protein and its CD spectra in an efficient manner proved to be a complex task. The calculation of the CD spectra of large molecules, such as protein, remains a challenge, due to the size and flexibility of the molecules. In this context, we have developed a “minimal” model to explain the CD spectroscopy of proteins, which associates each C-alpha position on the protein backbone with a classical Lorentz oscillator i.e. a mobile charge attaches to a corresponding atom by a quadratic potential. The coupling between charges is through the Coulomb potential and their displacements follow the direction of the respective local tangents to the Calpha space curve. This system is coupled to a planar electromagnetic wave describing the light source and the absorption phenomenon is modeled by frictional forces. We show that the model correctly reproduces the CD phenomenon of a helical polypeptide chain and in particular its sign depending on the orientation of the chain. At first, we have fitted a model to CD spectra of a polypeptide chain of 15 residues folded into alpha helix. The transferability of these parameters is then evaluated with myoglobin, a protein of 153 residues containing eight alpha helices.

Les cryptophanes constituent une famille de molécules chirales qui comportent une cavité dans laquelle elles peuvent accueillir des espèces invitées de taille et de nature variables (halogénométhanes, xénon, cations). Nous nous sommes intéressés aux propriétés d’encapsulation présentées par trois espèces solubles dans l’eau : le cryptophane-A hexa-hydroxyle, le cryptophane-A penta-hydroxyle et le cryptophane-A hexa-acide carboxylique. La chiralité de ces systèmes a été utilisée pour en étudier les propriétés de complexation au moyen de techniques chiroptiques : la polarimétrie, le dichroïsme circulaire électronique (ECD) et le dichroïsme circulaire vibrationnel (VCD), cette dernière technique étant associée à des calculs de chimie théorique. Les effets de différents paramètres, tels que le pH de la solution et la nature des contre-ions, sur la complexation de molécules invitées ont été analysés. Les modifications conformationnelles induites sur les cryptophanes lors de l'encapsulation ont également été déterminées. De plus, des propriétés d'énantiodiscrimination de ces cryptophanes hydrosolubles énantiopurs vis-à-vis de petites molécules invitées chirales ont été mises en évidence. Enfin, ces cryptophanes ont montré une affinité exceptionnelle pour le cation césium Cs+ en solution aqueuse. Ces deux derniers résultats permettent d’envisager des applications intéressantes de ces systèmes en chromatographie chirale d’une part, et en chimie de l’environnement pour la détection de césium radioactif d’autre part. / Cryptophanes derivatives are a family of chiral molecules containing a cavity which enables them to encapsulate guest species with variable size and nature (halogenomethanes, xenon, cations). We have been interested in the encapsulation properties of three different water soluble cryptophanes: hexa-hydroxyl cryptophane-A, penta-hydroxyl cryptophane-A and hexa-carboxylic acid cryptophane-A. The chirality of these systems have been exploited to study their complexation properties using chiroptical techniques: polarimetry, electronic circular dichroism (ECD) and vibrational circular dichroism (VCD), the latter being associated with theoretical calculations. The effects of different parameters such as the pH of the solution and the nature of the counter-ions on the complexation of guest molecules have been analyzed. The conformational changes induced on the cryptophanes upon encapsulation have been also determined. In addition, enantiodiscrimination properties of these enantiopure water soluble cryptophanes toward small chiral guest molecules have been evidenced. Finally, these cryptophanes have shown an exceptional affinity for the cesium cation Cs+ in aqueous solution. These last two results allow to consider interesting applications of these systems in chiral chromatography and environmental chemistry, in particular for the detection of radioactive cesium, respectively.

La mésentéricine Y105 est une bactériocine de sous-classe IIa produite par Leuconostoc mesenteroides Y105. Pour comprendre le mécanisme de l'activité anti-Listeria de ce peptide et plus généralement des bactériocines de classe IIa, l'étude des relations existant entre la structure et la fonction de ce peptide a été envisagée. Dans ce but, une collection de mésentéricines Y105 modifiées au niveau d'un résidu a été produite. Afin d'obtenir ces dérivés de bactériocine, une méthode de mutagenèse aléatoire par PCR a été mise en place pour générer des séquences d'ADN, codant la bactériocine mature, modifiées sur un seul codon. Dans un deuxième temps, une méthode de production hétérologue de ces peptides mutés a été développée en utilisant d'une part un vecteur portant les gènes de structure des bactériocines, et d'autre part, un vecteur permettant l'expression de l'immunité et du transport de ces peptides. Un outil de production universelle de peptide a été élaboré. L'étude de l'impact des mutations sur l'activité antagoniste, la structure secondaire (analysée par dichroïsme circulaire en présence de trifluoroéthanol ou de micelles de lysophosphatidylcholine), la structure tridimensionnelle (prédite) et l'interaction de la mésentéricine Y105 avec des environnements mimant les membranes cibles (méthode d'extinction de la fluorescence intrinsèque du tryptophane) a été réalisée. Enfin, une analyse par résonance magnétique nucléaire (RMN) a été effectuée sur la bactériocine sauvage pour déterminer sa structure tridimensionnelle. De l'ensemble de ces données, un modèle d'action est proposé pour la mésentéricine Y105, ce modèle peut être étendu aux bactériocines de structure proche.

Certaines protéines, appelées protéines amphitropiques, sont solubles en milieux aqueux et capables de se lier aux membranes pour leurs activités biologiques. Ces protéines apparaissent comme d'excellents modèles pour la compréhension des principes généraux de stabilité et de repliement des protéines membranaires intrinsèques. L'α-lactalbumine et l'apo-myoglobine ont été choisies comme modèles de protéines amphitropiques. Nous proposons une étude exhaustive des facteurs qui influencent la liaison aux membranes de ces deux protéines telles que le pH, la présence de cofacteurs, la force ionique, la charge et la courbure des membranes. Une description macroscopique des mécanismes de liaison a été entreprise par des expériences de centrifugation et de fluorescence. Enfin, la structure et la stabilité des états liés aux membranes ont été sondées par des expériences d'échanges hydrogène/deutérium (H/D).<br />L'état conformationnel de l'α-lactalbumine liée aux membranes s'est révélé très dépendant de la courbure membranaire. Nous avons identifié deux hélices amphiphiles qui sont directement impliquées dans les interactions α-lactalbumine-lipides. D'autre part, nos expériences d'échanges H/D permettent une description thermodynamique de la liaison à la membrane. Dans le cas de l'apo-myoglobine, nos résultats suggèrent un mécanisme commun d'insertion membranaire pour les protéines qui possèdent une topologie de type globine. Par ailleurs, la liaison de l'apo-myoglobine aux membranes ne semble pas nécessaire pour la fonction biologique de cette protéine. Une description des structures membranaires de l'apo-myoglobine a été entreprise par des expériences d'échanges H/D suivies par spectrométrie de masse.

Les facteurs de transcription NikR et FUR sont impliqués dans l'homéostasie des métaux. Les propriétés de métallation et de liaison à l'ADN de NikR d'E.coli (Ec) et d'H.pylori (Hp) ont été comparées. EcNikR, protéine tétramérique, lie 8 nickels par sous unité dont un nickel dans un site dit de haute affinité ayant un Kd submicromolaire. Les autres sites métalliques, de plus basse affinité, sont impliqués dans le processus l'agrégation Ni- et pH-dépendant. HpNikR, partage des propriétés de métallation avec EcNikR, dont la liaison possible de différents métaux dans son site de haute affinité (Cu(II), Ni(II), Co(II)). Les 4 sites de haute affinité de cette protéine semblent égaux 2 à 2. La métallation des premiers sites faciliterait une « fermeture de la protéine » permettant la métallation des deux derniers sites. La métallation de ces 4 sites semble suffire pour qu'HpNikR puisse lier l'ADN.<br />Cependant cette liaison serait améliorée en présence d'un métal stabilisateur dans d'autres sites. Selon les séquences opératrices, le métal et la technique employée, l‘affinité d'HpNikR métallée pour l'ADN varie. En présence d'un excès de Ni(II), HpNikR se lie à pureA et à pnixA avec un Kd de 2,5 et 1,7 nM mais se lie faiblement à pnikR et pexbB. En présence d'un excès de Ni(II) puis de Mn(II), HpNikR se lie à pnikR et à pexbB avec un Kd de 38 et 24 nM. FUR d'H.pylori (HpFUR), un métallorégulateur Fe dépendant, a aussi été caractérisé dans le but d'étudier sa co-régulation avec HpNikR de la région intergénique nikR-exbB. HpFUR est dimérique et contient au moins deux sites métalliques : un site structural et un site de régulation permettant l'activation pour la liaison à l'ADN.

La chiralité est une propriété essentielle des molécules naturelles, intervenant dans de nombreux mécanismes biologiques du vivant. Elle peut être caractérisée grâce à l’activité chiroptique des molécules chirales, à travers le dichroïsme circulaire, le pouvoir rotatoire, la dispersion rotatoire optique ou encore la luminescence polarisée circulairement. Les molécules biaryles et hélicéniques possèdent des propriétés chiroptiques intenses et sont des molécules de choix pour leurs applications dans de nombreux domaines, de la catalyse à l’optoélectronique.Les travaux réalisés au cours de cette thèse traitent de la synthèse de nouvelles molécules biaryles et hélicénoïdes et de l’étude de leurs propriétés spectroscopiques en interaction avec leur environnement. Dans un premier temps, nous avons effectué la synthèse de différentes familles de molécules à géométrie hélicoïdale possédant des systèmes aromatiques étendus. Afin de cibler des applications biologiques, nous avons également mis au point leur hydrosolubilisation par introduction de chaînes PEG. Dans un deuxième temps, nous nous sommes consacrés à l’étude de leurs propriétés spectroscopiques et en particulier chiroptiques en fonction de leur structure et de la dépendance de ces propriétés en présence de protons, de métaux ou d’acide désoxyribonucléique (ADN). Au cours de cette étude, une réaction photochimique inattendue a permis d’obtenir un produit photogénéré inédit présentant des interactions sélectives avec des ADN G-quadruplexes. Enfin, afin d’exploiter la modularité contrôlée des propriétés chiroptiques, nous avons travaillé sur un projet de conception de nouvelles molécules chirales pouvant détecter sélectivement les sucres en modifiant le squelette de ces molécules avec des acides boroniques. / Chirality is an essential property of natural molecules, involved in many living biological mechanisms. It can be characterized by the chiroptical activity of chiral molecules, through circular dichroism, rotatory power, optical rotatory dispersion or circularly polarized luminescence. Biaryl and helicenic molecules are known for their intense chiroptical properties and they can be used for their applications in many fields, going from catalysis to optoelectronics.The research carried out during this thesis deals with the synthesis of new biaryl and helicenoid molecules and the study of their spectroscopic properties in interaction with their environment. First, different families of helicoidal molecules with extended aromatic systems have been synthesized. In order to target biological applications, their hydrosolubilization was achieved by the addition of PEG chain. Then, we focused on their spectroscopic and especially chiroptical properties and their modulation according to their structures, their interaction with protons, metals or deoxyribonucleix acid (DNA). During these studies, we experienced an unexpected photochemical reaction, which lead to a new photogenerated product revealing selective interactions with DNA G-quadruplexes. Finally, in order to exploit the controlled modularity of chiroptical properties, new chiral molecules that selectively detecting sugars by with boronic acids have been designed.