Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Le suivi de molécules uniques est utile pour comprendre le déroulement d'un processus biologique.<br />Il permet de sonder des propriétés dynamiques inaccessibles pas des mesures d'ensemble.<br />Nous présentons les nanocristaux semiconducteurs et montrons qu'ils permettent de combiner<br />les avantages des autres marqueurs fluorescents avec une grande photostabilité et un très bon rapport<br />signal à bruit.<br />Nous exposons une approche de suivi automatique dédiée à ces nano-objets scintillants. Nous<br />discutons les méthodes spécifiquement adaptées à l'analyse des trajectoires ainsi obtenues.<br />Nous appliquons ces techniques d'imagerie ultrasensible à l'étude de la dynamique membranaire<br />du récepteur de la glycine (RGly) dans les milieux vivants. Nous présentons une étude sur<br />l'implication du cytosquelette dans la régulation du nombre de RGly aux synapses. Nous examinons<br />les interactions entre le RGly et la géphyrine (sa protéine d'ancrage) dans des systèmes cellulaires<br />modèles et caractérisons l'équilibre correspondant.

Les récepteurs AMPA (rAMPA) sont les récepteurs ionotropiques du glutamate responsables de la majeure partie des courants excitateurs rapides dans la transmission synaptique rapide. Lors de la libération de glutamate, le rAMPA passe par 3 états conformationnels majoritaires : pore fermé/agoniste non lié, pore ouvert/agoniste lié et pore fermé/agoniste lié. Le contrôle du nombre et de l’organisation dans la synapse des rAMPA, via une combinaison de diffusion latérale et d’endo/exocytose, est essentiel à la régulation de l’intensité de la transmission synaptique. Les interactions existant entre les protéines de la densité post-synaptique et les protéines partenaires des récepteurs régulent la diffusion des récepteurs, contrôlant leur nombre et leur organisation à la post-synapse. Mon travail de thèse a consisté à étudier l’impact de l’activation des rAMPA sur leur mobilité et leur organisation à la post-synapse. En effet, la fixation de glutamate sur les récepteurs ainsi que leur désensibilisation entraînent des modifications structurales majeures affectant leurs interactions avec les protéines d’échafaudage et les protéines accessoires. L’impact de telles modifications sur les propriétés de diffusion et sur l’organisation sub-synaptique de ces rAMPA était jusqu’à présent inconnu. Mes travaux démontrent une mobilisation des rAMPA synaptiques consécutivement à leur activation par le glutamate. A l’échelle moléculaire, je propose que le passage de l’état activé à l’état désensibilisé des rAMPA entraîne un changement d’affinité de ces derniers pour une de leur protéine partenaire : la Stargazin. Cette régulation glutamate dépendante de la diffusion des rAMPA participe au maintien de la fidélité de la transmission synaptique rapide. / AMPA receptors (AMPAR) are ionotropic glutamate receptors which are responsible for the vast majority of fast excitatory synaptic currents in fast transmission. Upon release of glutamate, AMPAR undergo three main conformational states: pore closed/agonist unbound, pore open/agonist bound and pore closed/agonist bound. Controlling the number of AMPAR and their organization in the synapse, through a combination of lateral diffusion and endo/exocytosis, is essential to regulate the intensity of synaptic transmission. The interactions between proteins of the post-synaptic density and accessory receptor proteins regulate the distribution of receptors, controlling their number and organization in the post-synapse. During my PhD, I studied the impact of AMPAR activation on their mobility and organization in the post-synapse. Indeed, the binding of glutamate to AMPAR and their following desensitization lead to major structural changes on the receptor which impacts on their interactions with scaffolding proteins and accessory proteins. The impact of such modifications on the lateral diffusion and sub-synaptic organization of AMPAR was not known yet. My findings show a mobilization of synaptic AMPAR following their activation by glutamate. At the molecular level, I suggest that the transition from the activated state to the desensitized state of AMPAR leads to a change in affinity of the receptor for their partner protein: Stargazin. This glutamate dependent regulation of AMPAR diffusion participates in maintaining the fidelity of fast synaptic transmission.

La synapse est un assemblage macromoléculaire dynamique : les protéines synaptiques sont constamment et rapidement échangées par un mouvement diffusif entre l'assemblage synaptique et la région extrasynaptique, alors que l'assemblage reste stable. Par ailleurs, dans le compartiment présynaptique, les cycles d'endo- et d'exocytose des vésicules synaptiques imposent une réorgani- sation dynamique de la membrane plasmique. La syntaxin1A est une protéine membranaire impliquée dans l'exocytose. Quelles sont les caractéristiques de la diffusion latérale de la syntaxin et ses implications pour la transmission sy- naptique ? Nous avons étudié la diffusion latérale de la syntaxin à l'échelle de la popu- lation (méthode de retour de fluorescence après photoblanchiment, FRAP) et à l'échelle de la molécule individuelle (suivi de particule unique, SPT). Nous avons montré que la syntaxin diffuse rapidement dans la membrane plasmique et présente des périodes d'immobilisation transitoire, qui reflètent des inter- actions moléculaires impliquées dans la formation du complexe exocytotique. Enfin, nous avons construit un modèle computationnel qui réconcilie les des- criptions de la diffusion latérale de la syntaxin à l'échelle de la population et de la molécule individuelle. Ce modèle a permis de caractériser les cinétiques des interactions entre la syntaxin et ses partenaires, qui conduisent à sa stabilisa- tion à la synapse.

La question se pose de l'existence de domaines membranaires permettant de regrouper les différentes protéines nécessaires à la transmission du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous avons donc analysé l'organisation dynamique du récepteur mu opioïde humain (hMOR) en relation avec ses paramètres pharmacologiques et les contraintes de son environnement. Après avoir vérifié la fonctionnalité de T7-EGFP-hMOR dans les SH-SY5Y, sa dynamique latérale a été étudiée par retour de fluorescence après photoblanchiment à rayon variable (FRAPrv) et par suivi de particule unique (SPT). A 22°C ces analyses ont révélé une double compartimentation des récepteurs : dans des domaines perméables de près de 1 µm de rayon et dans des domaines de rayon inférieur à 200 nm. De plus, près d'un tiers des récepteurs présente une diffusion dirigée. Les effets de la variation de température, de la déstabilisation du cytosquelette d'actine et du blocage de l'interaction protéine G/récepteur ont été observés afin de mieux comprendre l'origine de ces domaines. Bien que tous les paramètres qui y participent ne soient pas encore déterminés, les résultats indiquent que les protéines G ainsi que le cytosquelette influencent l'organisation membranaire de hMOR. La fixation d'antagonistes ne modifie pas la diffusion du récepteur. Au contraire celle des agonistes entraînent une diminution de la taille des domaines et un ralentissement des récepteurs en lien avec la transmission du signal et l'internalisation. Nos résultats soulignent l'importance de plusieurs paramètres sur l'organisation dynamique de hMOR et confortent l'intérêt de l'utilisation conjointe du FRAP et du SPT.

Des progrès récents dans la détection et la manipulation des molécules individuelles offrent de nouveaux outils pour étudier les molécules biologiques et leurs assemblages en conditions physiologiques. Ces outils permettent d'observer la dynamique, les états<br />conformationnels, et l'activité de molécules biologiques individuelles, non masqués par une moyenne d'ensemble. Dans ce cadre, je présente trois études que j'ai réalisées de 1998 à 2006.<br />La première concerne l'étude d'une protéine du cytosquelette, la spectrine. A l'aide d'un microscope à force atomique, nous suivons les états et les transitions de dépliement de protéines polymériques constituées de domaines identiques de la spectrine et montrons que le dépliement d'un domaine de spectrine peut se produire par étapes pendant son étirement.<br />Le second sujet porte sur l'organisation et la dynamique des membranes des cellules vivantes. Nous exposons une méthode fondée sur la spectroscopie de corrélation de fluorescence permettant de détecter des domaines membranaires. Nous revisitons les questions controversées dʹorganisation membranaire en étudiant une grande variété de marqueurs membranaires. Nous<br />montrons que les analogues fluorescents des sphingolipides et les protéines ancrées par un<br />glycosylphosphatidylinositol sont seulement confinés par des microdomaines dʹorigine lipidique.<br />En revanche, le récepteur à la transferrine est compartimenté à la fois par lʹorganisation lipidique et<br />le réseau du cytosquelette. Nous confirmons ainsi lʹexistence dʹune micro‐architecture dʹorigine<br />lipidique par des mesures sur cellules vivantes.<br />Pour améliorer la détection de molécules fluorescentes individuelles et réduire les volumes d'observation sous la limite de diffraction optique, nous utilisons des structures photoniques tels que des miroirs diélectriques ou des trous de taille sub‐longueur d'onde percés dans des films métalliques. A l'aide de ces structures, nous examinons la diffusion membranaire à l'échelle<br />nanométrique et en inférons la structure fine des membranes.<br />Enfin, je présente un projet de recherche sur la géométrie et la mécanique de l'épithélium<br />de l'embryon de drosophile lors de la morphogenèse. Ce projet vise en particulier à développer des<br />méthodes spécifiques pour mesurer et déterminer le rôle des forces de tension corticale du réseau<br />dʹacto‐myosine dans le remodelage des interfaces cellulaires.

Ce travail de thèse a été consacré à l'élaboration d'un nouveau type de membranes de nanofiltration efficaces avec des propriétés améliorées (flux élevé et rétention élevée, et de bonnes propriétés mécaniques) en déposant un revêtement assemblé couche-par-couche (LbL) sur des supports poreux. Après avoir systématiquement étudié le mécanisme de croissance des films assemblés couche par couche des polyélectrolytes choisis et la relation entre les structures de ces films et les performances des membranes résultant, nous avons identifié avec succès les meilleures structures multicouches pour la construction de membranes de nanofiltration de référence avec des performances optimales. En outre, en prenant avantage de la technique LbL, nous avons introduit une couche de diffusion latérale assemblée soit de nanofibrilles de cellulose ou de nanotubes de carbone, qui permet d’augmenter le flux de 30% tout en conservant la même rétention par rapport à la membrane de référence. En plus, les films assemblés à base de chitosan et nanofibrils de cellulose ont montré une forte résistance à la traction allant jusqu’à 450 MPa et un module d’Young jusqu’à 50 GPa. / This thesis work was devoted to the development of a novel and efficient nanofiltration membrane with improved properties (high flux and high retention, good mechanical strength) by coating Layer-by-Layer (LbL) assembled films onto porous membrane support. After having systematically studied the growth mechanism of LbL-assembled films of chosen polyelectrolytes and the relationship between the structures of these films and the membrane performance of the resulting NF membranes, we successfully identified the best multilayer structures for constructing nanofiltration membranes (NF) of reference with optimal membrane performance. Furthermore, taking advantages of the LbL-assembly, we successfully introduced LbL-assembled lateral diffusion layer that is made of either cellulose nanofibrils or carbon nanotubes, which in turn led to membranes with 30% higher flux. In addition, the LbL-assembled films of chitosan and cellulose nanofibrils showed surprisingly strong tensile strength of up to 450 MPa and a high Young modulus of up to 50 GPa.