Abstract The evaluation of the effects and levels of contaminants in wildlife is an essential part of assessing risks for chemical exposure in the environment. Although the circumstances are not as controlled as in laboratory, wildlife studies offer the concept of environmental exposure in its entirety, with all the natural variation. In the present study, two wild vole species, bank vole (Myodes glareolus) and field vole (Microtus agrestis), were used in assessing environmental levels of dioxins. The effects of dioxin exposure on tooth and bone development were studied in order to determine whether they could be used as biomarkers for environmental exposure. Xenobiotic metabolism activity after dioxin exposure – both natural and experimental – was studied by quantifying selected cytochrome P-450 (CYP) enzymes. The results confirmed the fact that dioxins are ubiquitous in the environment, also in areas far from contaminant sources and human activity. The development of the third molar in bank vole was found to be a sensitive biomarker for dioxin exposure. The two vole species under study do not respond similarly to environmental concentrations of dioxins; there were significant differences in body burdens and activity levels of xenobiotic metabolizing enzymes. / Tiivistelmä Haitallisten kemikaalien tason ja vaikutusten arviointi ympäristössä on olennainen osa kemikaalien riskin arviointia. Vaikka laboratoriossa olosuhteita kontrolloidaan ja tutkimukseen vaikuttava variaatio on paremmin hallittavissa, luonnonvaraisten lajien tutkiminen luo kokonaisvaltaisen ja todenmukaisen kuvan ympäristön kemikaalialtistuksesta kaikkine todellisine vaihteluineen. Tässä väitöskirjassa tarkastellaan kahden luonnonvaraisen pikkunisäkkään, metsämyyrän (Myodes glareolus) ja peltomyyrän (Microtus agrestis), käyttöä ympäristön kemikaalitason arvioinnissa. Pääpaino on dioksiinien kaltaisissa yhdisteissä. Työssä tutkitaan yhdisteiden kertymistä myyriin kahdessa ympäristössä: voimakkaasti dioksiineilla saastuneella maa-alueella sekä kaukana ihmistoiminnasta sijaitsevassa erämaassa. Herkiksi tiedettyjä vasteita – hampaiden ja luiden kehitystä – käytetään dioksiinialtistuksen indikaattoreina. Vierasainemetaboliasta vastaavien entsyymien (sytokromi P450 eli CYP) aktiivisuutta kartoitetaan molemmilla myyrälajeilla, jotta saadaan tietoa entsyymien indusoinnista luonnonvaraisilla myyrillä yleensä ja selvitetään havaittuja lajien välisiä eroja dioksiinivasteissa. Tulokset vahvistavat, että dioksiinit ovat laajalle levinneitä yhdisteitä, joita löytyy paitsi läheltä päästölähdettä myös kaukana ihmistoiminnasta olevilta alueilta. Metsämyyrällä kolmannen poskihampaan kehitys osoittautuu herkäksi dioksiinialtistuksen biomarkkeriksi. Samasta elinympäristöstä huolimatta tutkituista myyrälajeista mitatut dioksiinipitoisuudet eroavat huomattavasti toisistaan, samoin kuin vierasainemetaboliasta vastaavien entsyymien aktiivisuus ja niiden induktio TCDD-altistuksen jälkeen.

Abstract Persistent organic pollutants (POPs), especially dioxin-like chemicals, have been shown to have adverse effects on skeleton and these effects are likely to be mediated via the aryl hydrocarbon receptor (AHR). In spite of the extensive research, the characteristics of developmental effects of POPs are poorly known and the role of AHR in POP bone toxicity and skeletal development in general. In this project changes in bone morphology and strength as well as tissue matrix mechanics are studied by applying state of the art biomedical engineering methods. This allows understanding of the effects of dioxins exposure and AHR activity on the development and maturation of extracellular matrix in musculoskeletal tissues from a completely new perspective, and thereby improving the health risk assessment of POPs. In the present study skeletal properties of rats exposed maternally to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), Northern Contaminant Mixture (NCM) and Aroclor1254 (A1254) were studied for cross-sectional morphometric and biomechanical properties, and data were analysed with benchmark dose modelling. In addition, extracellular matrix properties were analysed using nanoindentation. Similar measurements were performed for adult wild-type and AHR-null mice after TCDD exposure. The same animals were also analysed for microstructural changes using micro-computed tomography and their bone cell activity was estimated from serum markers and gene expression. Analyses show decreased bone length and cross-sectional properties with consequently decreased bone strength. On the other hand, an increased trabecular BMD in response to NCM and A1254 was observed. In addition, bone matrix properties indicated delayed maturation or early senescence after maternal or adult exposure, respectively. The AHR is mainly responsible for bone toxicity of dioxin-like compounds and plays a role in bone development. This is likely due to disturbed bone remodeling as indicated by altered serum markers and gene expression. Overall these results indicate that POPs decrease bone strength, but the interpretation is difficult as there is more trabecular bone within cortical bone with compromised quality and increased porosity. / Tiivistelmä Altistumisen pysyville orgaanisille ympäristökemikaaleille on todettu heikentävän luustoa. Dioksiinien ja dioksiininkaltaisten yhdisteiden vaikutusten on havaittu välittyvän aryylihiilivetyreseptorin (AHR) välityksellä. Huolimatta pitkään kestäneestä tutkimuksesta POP-yhdisteiden sikiönkehityksen aikaisen altistuksen vaikutukset ja etenkin niiden mekanismit ovat edelleen huonosti tunnettuja, samoin kuin AHR:n osuus POP-yhdisteiden luutoksisuudessa ja luuston kehityksessä ylipäätään. Tässä työssä tutkittiin luuston rakenteellisia ja mekaanisia ominaisuuksia niin perinteisillä kuin uusimmilla biolääketieteen tekniikan menetelmillä. Tutkimuksen tavoitteena on saada uutta tietoa POP-altistuksen ja AHR-aktiivisuuden vaikutuksista luuston kehitykseen ja luukudoksen ikääntymisprosesseihin, mikä edesauttaa kyseisten yhdisteiden riskinarviointia. Tutkimuksissa altistettiin kantavia rottaemoja 2,3,7,8-tetraklooridibenzo-p-dioksiinille (TCDD), pohjoiselle saasteseokselle ja kaupalliselle Arokloori 1254 PCB-seokselle. Sikiönkehityksen aikana altistuneiden jälkeläisten luuston poikkileikkausen morfologia ja biomekaaniset ominaisuudet mitattiin ja tulokset mallinnettiin vertailuannoksen määrittämiseksi. Lisäksi TCDD-altistettujen rottien luustomatriisin ominaisuuksia selvitettiin nanoindentaatiomenetelmällä. Samaa menetelmää käytettiin myös aikuisiässä TCDD:lle altistettujen villityypin hiirten ja AHR-poistogeenisiten hiirten tutkimiseen. Näiden hiirten luuston hienorakennetta mitattiin myös korkean resoluution mikro-tietokonetomografialla ja niiden luusolujen aktiivisuutta tutkittiin seerumin biomarkkerien ja luun muodostumiseen osallistuvien geenien ekspressiotasojen avulla. Sikiönkehityksen aikainen altistuminen pohjoiselle saasteseokselle ja Arokloori 1254:lle hidasti luiden pituuskasvua. Lisäksi luiden poikkileikkauspinta-alat olivat pienentyneet ja mekaaniset ominaisuudet heikentyneet. Toisaalta hohkaluun määrä oli lisääntynyt altistumisen seurauksena. Myös sikiönkehityksen aikainen altistuminen TCDD:lle hidasti luukudoksen kypsymistä ja johti aikuisiällä luukudoksen ennenaikaiseen vanhenemiseen. AHR:llä oli päärooli ainakin aikuisiän vaikutusten ilmenemiselle ja reseptorilla vaikutti olevan rooli luuston kehityksessä ylipäätään. Seerumin biomarkkereiden ja geeniekspression muutosten perusteella nämä vaikutukset johtuvat todennäköisesti luuston uusiutumisen häiriöistä. Yhteenvetona voidaan todeta, että POP-yhdisteet heikentävät luustoa, mutta tämän ilmiön diagnosoiminen on hankalaa, koska huonolaatuisen kuoriluun sisällä hohkaluun määrä on lisääntynyt.

Abstract In Finland there is a food monitoring program which has found elevated dioxin and polychlorinated biphenyl concentrations in the muscle of semi-domesticated reindeer (Rangifer tarandus tarandus) calves. This led to further research on the concentrations of persistent organic pollutants in reindeer muscle, liver, and other internal organs. The research was further expanded on wild moose (Alces alces) muscle and liver. The main objective of this thesis is to increase knowledge of polychlorinated dibenzo-p-dioxin (PCDD), polychlorinated dibenzofuran (PCDF), polychlorinated biphenyl (PCB), and polybrominated diphenyl ether (PBDE) pollution levels in the Finnish terrestrial environment, and in semi-domesticated reindeer and wild moose in particular. The research gives information of exposure conditions in the reindeer’s food chain, as well as species differences and individual variation in accumulation and distribution of pollutants in reindeer and moose. Local differences between the contaminant concentrations were explored. Toxic equivalencies (TEQs) set by the World Health Organization (WHO) of PCDD/Fs and PCBs were calculated in order to assess the validity of selling reindeer and moose tissue. It was observed that there is a species-, individual-, and tissue-specific accumulation of dioxins, dioxin-like PCB, and PBDE compounds in reindeer and moose. Varying exposure conditions mainly explain the differences, although taking into account the age of an individual animal, its metabolic patterns have a role, too. Reindeer placenta and milk proved to be important factors in the transporting of compounds from hind to calf. The highest PCDD/F and PCB concentrations (as WHO-TEQs) were observed in reindeer calves in the study area in which animals are fed in natural pastures only. Despite the findings, it was concluded that it is safe to eat reindeer and moose meat since the concentrations of dioxins and dioxin-like PCBs in the muscle are relatively low, and because of the low fat content in these animals. Reindeer liver, for its part, had quite a lot of dioxin-like compounds that may compromise its safety as food, at least on a regular basis. The study shows that Finnish semi-domesticated reindeer and wild moose are good indicator species of POP contamination in a terrestrial environment, reindeer describing the situation in northern parts of the country especially. / Tiivistelmä Suomalaisessa ruokamonitorointitutkimuksessa löydettiin kohonneita dioksiinien ja polykloorattujen bifenyylien pitoisuuksia puolivillin poron vasojen lihaksista. Se johti lisätutkimuksiin pysyvien orgaanisten yhdisteiden pitoisuuksista poron lihaksessa, maksassa ja muissa sisäelimissä. Tutkimus laajeni koskemaan myös hirven (Alces alces) lihasta ja maksaa. Väitöskirjatyö lisää tietämystä polykloorattujen dibentso-p-dioksiinien (PCDD), polykloorattujen dibentsofuraanien (PCDF), polykloorattujen bifenyylien (PCB) ja polybromattujen difenyylieettereiden (PBDE) pitoisuuksista suomalaisessa maaympäristössä ja erityisesti porossa ja hirvessä. Tutkimus antaa tietoa yhdisteille altistumisesta sekä viitteitä lajien- ja yksilöiden välisistä eroavai¬suuksista yhdisteiden kertymisessä ja niiden jakaantumisessa eri kudosten välillä. Alueellista vaihtelua yhdisteiden pitoisuuksissa selvitettiin myös. Maailman terveysjärjestön (WHO) asettamia PCDD/F- ja PCB-yhdisteiden toksisuusekvivalenttiarvoja (TEQ) tarkasteltaessa pystyttiin arvioimaan kemiallista elintarvikekelpoisuutta suhteessa EU:n antamiin sallittuihin pitoisuuksiin. Työssä havaittiin laji-, yksilö-, ikä- ja kudosspesifistä dioksiinien, dioksiinienkaltaisten PCB- ja PBDE-yhdisteiden kerääntymistä porossa ja hirvessä. Tämä on todennäköisimmin seurausta vaihtelevasta altistumisesta yhdisteille, mutta myös lajien metabolisissa toiminnoissa yksilön eri ikäkausina voi olla eroavaisuuksia. Poron istukan ja maidon havaittiin olevan tärkeitä yhdisteiden kulkeutumisessa emolta sikiölle ja vasalle. Korkeimmat dioksiinien ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden konsentraatiot (WHO-TEQ-pitoisuuksina) havaittiin poron vasoilla tutkimusalueella, jossa eläimet olivat laiduntaneet ainoastaan luonnonlaitumilla. Huolimatta havaituista haitta-ainepitoisuuksista todettiin, että sekä luonnostaan vähärasvaisen poron että hirvenlihan syönti on turvallista suhteellisen alhaisten dioksiinien ja dioksiininkaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien perusteella. Poron maksa puolestaan sisälsi melko korkeita dioksiinien kaltaisten yhdisteiden pitoisuuksia, mikä voi vaikuttaa sen turvalliseen käyttöön elintarvikkeena ainakin usein syötynä. Suomalainen puolivilli poro ja villi hirvi sopivat hyvin POP-kontaminoitumisen indikaattoreiksi maaympäristössä; poron erityisesti kuvaten tilannetta maan pohjoisosissa.