Tesis por compendio / [EN] Carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1), a 1462-residue mitochondrial enzyme, catalyzes the entry of ammonia into the urea cycle, which converts ammonia, the neurotoxic waste product of protein catabolism, into barely toxic urea. The urea cycle inborn error and rare disease CPS1 deficiency (CPS1D) is inherited with mendelian autosomal recessive inheritance, being due to CPS1 gene mutations (>200 mutations reported), and causing life-threatening hyperammonemia. We have produced recombinantly human CPS1 (hCPS1) in a baculovirus/insect cell expression system, isolating the enzyme in active and highly purified form, in massive amounts. This has allowed enzyme crystallization for structural studies by X-ray diffraction (an off-shoot of the present studies). This hCPS1 production system allows site-directed mutagenesis and enzyme characterization as catalyst (activity, kinetics) and as protein (stability, aggregation state, domain composition). We have revealed previously unexplored traits of hCPS1 such as its domain composition, the ability of glycerol to replace the natural and essential CPS1 activator N-acetyl-L-glutamate (NAG), and the hCPS1 protection (chemical chaperoning) by NAG and by its pharmacological analog N-carbamyl-L-glutamate (NCG). We have exploited this system to explore the effects on the activity, kinetic parameters and stability/folding of the enzyme, and to test the disease-causing nature, of mutations identified in patients with CPS1 deficiency (CPS1D). These results, supplemented with those obtained with other non-clinical mutations, have provided novel information on the functions of three non-catalytic domains of CPS1. We have introduced three CPS1D-associated mutations and one trivial polymorphism in the glutaminase-like domain of CPS1, supporting a stabilizing and an activity-enhancing function of this non-catalytic domain. Two mutations introduced into the bicarbonate phosphorylation domain have shed light on bicarbonate binding and have directly confirmed the importance of this domain for NAG binding to the distant (in the sequence) C-terminal CPS1 domain. The introduction of 18 CPS1D-associated missense mutations mapping in a clinically highly eloquent central non-catalytic domain have proven the disease-causing nature of most of these mutations while showing that in most of the cases they trigger enzyme misfolding and/or destabilization. These results, by proving an important role of this domain in the structural integration of the multidomain CPS1 protein, have led us to call this domain the Integrating Domain. Finally, we have examined the effects of eight CPS1D-associated mutations, of one trivial polymorphism and of five non-clinical mutations, all of them mapping in the C-terminal domain of the enzyme where NAG binds, whereas we have re-analyzed prior results with another four clinical and five non-clinical mutations affecting this domain. We have largely confirmed the pathogenic nature of the clinical mutations, predominantly because of decreased activity, in many cases due to hampered NAG binding. A few mutations had substantial negative effects on CPS1 stability/folding. Our analysis reveals that NAG activation begins with a movement of the final part of the ß4-¿4 loop of the NAG site. Transmission of the activating signal to the phosphorylation domains involves helix ¿4 from this domain and is possibly transmitted by the mutually homologous loops 1313-1332 and 778-787 (figures are residue numbers) belonging, respectively, to the carbamate and bicarbonate phosphorylation domains. These two homologous loops are called from here on Signal Transmission Loops. / [ES] La carbamil fosfato sintetasa 1 (CPS1), una enzima mitocondrial, cataliza la entrada del amonio en el ciclo de la urea, que convierte esta neurotoxina derivada del catabolismo de las proteínas en urea, mucho menos tóxica. El déficit de CPS1 (CPS1D) es un error innato del ciclo de la urea, una enfermedad rara autosómica recesiva, que se debe a mutaciones en el gen CPS1 (>200 mutaciones descritas) y que cursa con hiperamonemia. Hemos producido CPS1 humana recombinante (hCPS1) en un sistema de expresión de células de insecto y baculovirus, y la hemos aislado en forma activa, muy pura y en cantidad elevada. Este sistema de producción de hCPS1 permite la realización de mutagénesis dirigida y la caracterización de la enzima como catalizador (actividad, cinética) y como proteína (estabilidad, estado de agregación y composición de dominios). Hemos revelado características de la hCPS1 antes no exploradas como es la composición de dominios, la capacidad que tiene el glicerol para reemplazar al activador natural y esencial de la CPS1, N-acetil-L-glutamato (NAG), y la protección de la hCPS1 por NAG y por su análogo farmacológico N-carbamil-L-glutamato (NCG) (chaperonas químicas). Hemos utilizado este sistema para explorar los efectos en actividad, parámetros cinéticos y estabilidad/plegamiento de la enzima, y para comprobar la naturaleza patogénica de mutaciones identificadas en pacientes con CPS1D. Estos resultados, junto con los obtenidos con otras mutaciones no clínicas, han aportado información novedosa sobre tres de los dominios no catalíticos de CPS1. Las observaciones realizadas tras introducir en el dominio de tipo glutaminasa de la enzima tres mutaciones asociadas a CPS1D y un polimorfismo trivial, apoyan la contribución de este dominio no catalítico a la estabilidad y a aumentar la actividad de la enzima. Dos mutaciones introducidas en el dominio de fosforilación de bicarbonato han arrojado luz sobre el modo de unión del bicarbonato (un sustrato). Los resultados de estas mutaciones también han confirmado la contribución de este dominio para la unión de NAG, cuyo sitio de unión se encuentra en el dominio C-terminal de CPS1, bastante alejado (en la secuencia) del dominio de fosforilación de bicarbonato. Además, hemos introducido 18 mutaciones de cambio de sentido asociadas a CPS1D, las cuales están localizadas en un dominio no catalítico, central y de elevada elocuencia clínica. Estos resultados han demostrado la naturaleza patogénica de estas mutaciones, ya que en la mayoría de los casos estas mutaciones producen un mal plegamiento o/y desestabilización de la enzima. Debido a que estos resultados han puesto de manifiesto el importante papel de este dominio en la integración estructural de la proteína multidominio CPS1, lo hemos llamado Dominio Integrador. Finalmente, hemos examinado los efectos de 8 mutaciones asociadas a CPS1D, de un polimorfismo trivial y de 5 mutaciones no clínicas, todas localizadas en el dominio C-terminal de la enzima, donde se une NAG. Además, hemos reanalizado resultados anteriores con otras 4 mutaciones clínicas y 5 no clínicas afectando a este dominio. Hemos confirmado el carácter patogénico de las mutaciones clínicas, las cuales predominantemente causan una disminución en la actividad enzimática, en muchos casos debida a que la unión de NAG se encuentra obstaculizada. Unas pocas mutaciones mostraron efectos negativos en la estabilidad/plegamiento de CPS1. Nuestros análisis revelan que la activación por el NAG empieza con un movimiento de la parte final del bucle ß4-¿4 del sitio de NAG. La transmisión de la señal activadora a los dominios de fosforilación implica a la hélice ¿4 de este dominio y posiblemente se transmite a través de los bucles homólogos 1313-1332 y 778-787 (numeración de residuos) pertenecientes, respectivamente, a los dominios de fosforilación de carbamato y bicarbonato. Por ello, hemos llamado a ambos bucles Bucles de / [CA] La carbamil fosfat sintetasa 1 (CPS1), un enzim mitocondrial, catalitza l'entrada d'amoni en el cicle de la urea, que convertix l'amoni, producte neurotòxic del catabolisme de les proteïnes, en urea, una molècula molt poc tòxica. El dèficit de CPS1 (CPS1D) és un error innat del cicle de la urea, una malaltia rara autosòmica recessiva, que es deu a mutacions en el gen CPS1 (>200 mutacions descrites) i que cursa amb hiperamonièmia. Hem produït CPS1 humana recombinant (hCPS1) en un sistema d'expressió de cèl·lules d'insecte i baculovirus, i l'hem aïllada en forma activa, molt pura i en gran quantitat. Això ha permés la cristal·lització de l'enzim per a estudis estructurals amb difracció de raios-X (treball no inclòs en esta tesi Aquest sistema de producció de hCPS1 permet la realització de mutagènesi dirigida i la caracterització de l'enzim com a catalitzador (activitat, cinètica) i com a proteïna (estabilitat, estat d'agregació i composició de dominis). Hem revelat característiques de la hCPS1 no explorades abans com és la composició de dominis, la capacitat que té el glicerol per a reemplaçar l'activador natural i essencial de CPS1, N-acetil-L-glutamat (NAG), i la protecció de la hCPS1 per NAG i pel seu anàleg farmacològic N-carbamil-L-glutamat (NCG) (xaperones químiques) . Hem utilitzat aquest sistema per a explorar els efectes en l'activitat, els paràmetres cinètics i l'estabilitat/plegament de l'enzim, i per a comprovar la naturalesa patogènica de mutacions identificades en pacients amb CPS1D. Aquestos resultats, junt amb els obtinguts amb altres mutacions no clíniques, han aportat informació nova sobre tres dels dominis no catalítics de la CPS1. Les observacions, després d'introduir tres mutacions associades a CPS1D i un polimorfisme trivial en el domini tipus glutaminasa de CPS1, recolzen la contribució d'aquest domini no catalític a l'estabilitat i a l'optimització de l'activitat enzimàtica. Dues mutacions introduïdes en el domini de fosforilació de bicarbonat han esclarit el mode d'unió de bicarbonat. Els resultats d'aquestes mutacions també han confirmat la contribució d'aquest domini per a la unió de NAG, el lloc d'unió de la qual es troba en el domini C-terminal de CPS1, prou allunyat (en la seqüència) del domini de fosforilació de bicarbonat. A més, hem introduït 18 mutacions de canvi de sentit associades a CPS1D, les quals estan localitzades en un domini no catalític, central i d'elevada eloqüència clínica. Aquestos resultats han demostrat la naturalesa patogènica d'aquestes mutacions, ja que, en la majoria dels casos produïxen un mal plegament o/i desestabilització de l'enzim. Pel fet que aquestos resultats han posat de manifest l'important paper d'aquest domini en la integració estructural de la proteïna multidomini CPS1, l'hem anomenat Domini Integrador. Finalment, hem examinat els efectes de huit mutacions associades a CPS1D, un polimorfisme trivial i cinc mutacions no clíniques, totes elles localitzades en el domini C-terminal de l'enzim, on s'unix NAG. A més, hem reanalitzat resultats anteriors amb altres quatre mutacions clíniques i cinc no clíniques que afecten aquest domini. Hem confirmat el caràcter patogènic de les mutacions clíniques, les quals predominantment causen una disminució en l'activitat enzimàtica, en molts casos pel fet que la unió de NAG es troba obstaculitzada. Unes poques mutacions van mostrar efectes negatius substancials en l'estabilitat/plegament de CPS1. Les nostres anàlisis revelen que l'activació de NAG comença amb un moviment de la part final del bucle ß4-¿4 del lloc de NAG. La transmissió del senyal activadora als dominis de fosforilació involucra l'hèlix ¿4 d'aquest domini i es transmet, possiblement, a través dels bucles homòlegs 1313-1332 i 778-787 (numeració dels residus), pertanyents, respectivament, als dominis de fosforilació de carbamato i bicarbonat. Per això, hem anomenat a ambd / Díez Fernández, C. (2015). USING RECOMBINANT HUMAN CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE 1 (CPS1) FOR STUDYING THIS ENZYME'S FUNCTION, REGULATION, PATHOLOGY AND STRUCTURE [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/52855 / Compendio

[ES] Entre los grandes desafíos actuales de las aplicaciones Web podemos citar la portabilidad, adaptabilidad y evolución. Estos desafíos se dan tanto en el ambiente en que operan así como en su desarrollo, ya que a menudo requieren de diferentes lenguajes, frameworks, herramientas, entornos, plataformas, etc. El Desarrollo Dirigido por Modelos (MDD) y en particular, la Arquitectura Dirigida por Modelos (MDA) contemplan estos desafíos proponiendo distintos niveles de abstracción para las diferentes fases de modelado, partiendo de modelos más orientados al problema, que no deberían contemplar aspectos de implementación (CIM, PIM), hasta llegar a los modelos más orientados a la solución planteada (PSM, ISM). Sin embargo, encarar adecuadamente este tema puede depender del grado de independencia que adquieren los modelos. Este trabajo de Tesis presenta un método que considera el problema de la evolución y portabilidad hacia diferentes entornos o arquitecturas en el diseño y desarrollo de aplicaciones Web. La propuesta se denomina MoWebA (del inglés, Model Oriented Web Approach). Durante el desarrollo de la tesis, hemos identificado una serie de aspectos que podrían tener un impacto positivo sobre los problemas de portabilidad y adaptabilidad que son: i) incorporación de un modelo específico de la arquitectura ASM (del inglés, Architecture Specific Model), que permita la portabilidad de los PIMs con respecto a la arquitectura (por ejemplo, RIA, SOA, Mobile); ii) clara separación de la capa de presentación con respecto a las capas navegacionales y de comportamiento; iii) definición de la estructura navegacional de acuerdo a un mecanismo orientado al comportamiento, que prevenga la modificación del diseño navegacional causada por cambios en la implementación; iv) uso de estándares para facilitar la independencia de las herramientas. Se ha llevado a cabo una revisión del estado de la literatura teniendo en cuenta los fundamentos de la Ingeniería Dirigida por Modelos MDE (Model Driven Engineering), las propuestas metodológicas para el desarrollo de Aplicaciones Web, las tendencias actuales, analizando en forma especial de qué manera las propuestas Web las contemplan, y las evidencias empíricas tanto en la academia como en la Industria. Presentamos así la propuesta MoWebA a partir de una serie de consideraciones sobre las aplicaciones Web que han sido identificadas durante el proceso de revisión del estado del arte. Posteriormente, detallamos cada una de las etapas del proceso de modelado, incluyendo los diagramas y notaciones propuestos, sus definiciones a través de sus metamodelos y ejemplos de uso. Seguidamente, presentamos el proceso de transformación adoptado por MoWebA, con los mecanismos de transformación Modelo-A-Modelo y Modelo-A-Código. Hemos dedicado un importante esfuerzo en la validación de la propuesta. Se realizó una primera validación, adoptando los modelos de MoWebA y en algunos casos generando aplicaciones para diferentes dominios. Con estas primeras experiencias de validación hemos podido identificar fortalezas y debilidades de la propuesta PIM de MoWebA, además de determinar en qué grado la misma cubre las necesidades de diferentes dominios. Como segunda experiencia, hemos realizado una validación preliminar con un grupo de estudiantes de último año de la carrera de Ingeniería Informática de la Universidad Católica "Nuestra Señora de la Asunción" (Paraguay), que consistió en la definición de ASM para tres arquitecturas diferentes. Finalmente, como tercera experiencia de validación, hemos llevado a cabo un Caso de Estudio que consistió en la definición de tres extensiones para MoWebA. Dicha validación fue desarrollada como parte de un proyecto de investigación liderado por la Universidad Católica "Nuestra Señora de la Asunción". La experiencia ha permitido analizar el grado de adaptabilidad de MoWebA y automatización en las transformacinoes PIM-ASM, así como el grado de independiencia del PIM. / [CA] Entre els grans desafiaments actuals de les aplicacions Web podem citar la portabilitat, adaptabilitat i evolució. El Desenvolupament Dirigit per Models (MDD) contemple aquests desafiaments proposant diferents nivells d'abstracció per a les diferents fases de modelatge. No obstant això, encarar adequadament aquest tema pot dependre del grau d'independència que adquireixen els models. Aquest treball de Tesi presenta un mètode que considera el problema de l'evolució i la portabilitat, en diferents entorns o arquitectures, per al disseny i desenvolupament d'aplicacions Web. La proposta s'anomena MoWebA (Model Oriented Web Approach). Durant el desenvolupament de la tesi hem identificat una sèrie d'aspectes que podrien tenir un impacte positiu sobre els problemes de portabilitat i adaptabilitat. Aquestos són: i) la incorporació d'un model específic d'arquitectura ASM (Architecture Specific Model), que permet la portabilitat dels models PIM respecte a l'arquitectura (per exemple, RIA, SOA, Mobile); ii) la clara separació de la capa de presentació respecte a les capes navegacionals i de comportament; iii) la definició de l'estructura navegacional d'acord amb un mecanisme orientat al comportament, que restringisca la modificació del disseny navegacional causada per canvis en la implementació; i per últim, iv) l'ús d'estàndards per tal de facilitar la independència de les eines. S'ha realitzat una revisió de l'estat de la literatura considerant els fonaments de l'Enginyeria Dirigida per Models MDE (Model Driven Engineering), les propostes metodològiques per al desenvolupament d'Aplicacions Web, les tendències actuals (analitzant de forma especial la manera en que les propostes Web les consideren), i les evidències empíriques tant en l'acadèmia com en la Indústria. Presentem així la proposta MoWebA a partir d'una sèrie de consideracions sobre les aplicacions Web que són identificades durant el procés de revisió de l'estat de l'art. Posteriorment, detallem cadascuna de les etapes del procés de modelatge, incloent els diagrames i les notacions proposades, les seues definicions (a través dels seus metamodels), i alguns exemples d'ús. Seguidament, presentem el procés de transformació adoptat per MoWebA, emprant mecanismes de transformació Model-a-Model i Model-a-Codi. Hem dedicat un esforç considerable en la validació de la proposta. Es realitzà una primera validació adoptant els models de MoWebA, i en alguns casos es generaren aplicacions per a diferents dominis. Aquestes experiències van ser realitzades per modeladors amb poca experiència, així com també per modeladors i desenvolupadors experimentats. Les experiències van ser desenvolupades en ambients tant acadèmics com industrials. Amb aquestes primeres experiències de validació s'identificaren fortaleses i febleses de la proposta PIM de MoWebA. També permeteren determinar fins quin grau la proposta respon a les necessitats dels diferents dominis. Com a segona experiència es realitzà una validació preliminar amb un grup d'estudiants d'últim curs de la carrera d'Enginyeria Informàtica de la Universitat Catòlica "Nuestra Señora de la Asunción" (Paraguai), que va consistir en la definició del model d'arquitectura ASM per a tres arquitectures diferents. Amb aquesta segona experiència de validació s'aconseguí valorar com de factible és d'adaptar la proposta a altres arquitectures. Finalment, com a tercera experiència de validació, es dugué a terme un Cas d'Estudi que va consistir en la definició de tres extensions per a MoWebA. L'experiència permeté analitzar el grau d'adaptabilitat i d'automatització en les transformacions PIM-ASM que s'obté amb MoWebA, així com el grau de independència del PIM amb respecte als altres models. Durant aquesta validació, s'han realitzat a més experiències de satisfacció d'usuaris amb un grup de modeladors i desenvolupadors. / [EN] Some of the major challenges facing Web applications today are those of portability, adaptability and evolution, not only in the environment in which they run, but also in the way in which they must be developed, often requiring different languages, frameworks, tools, environments, platforms, etc. MDD and MDA take into account these issues. However, to achieve portability, adaptability and evolution depends to some extent on the degree of independence that the models adopt. This Thesis presents a method that take into account the problem of evolution and portability towards different environments. The approach is called MoWebA (Model Oriented Web Approach). Some key aspects of MoWebA that could have a positive impact in the portability and adaptability are:i) incorporation of an Architecture Specific Model (ASM) as a new modeling layer, in order to keep the portability of the Platform Independent Model (PIM) regarding the different architectures (e.g., RIA, SOA, Mobile); ii) clear separation of the presentation layer with regard to the navigation and behavior layers; iii) definition of the navigational structure according to a function-oriented approach, which prevents the modification of the navigation design caused by implementation changes; iv) and use of standards in order to facilitate the independence from the tools. We justify MoWebA by highlighting a series of concerns for Web applications development. We present an overview of the method including the dimensions and the diagrams that we propose. Subsequently, we present each step in the modeling process, including the diagrams and notation, its definition (metamodels) and examples of use. Afterwards, we present the transformation process adopted by MoWebA, which includes model-to-model and model-to-code transformations. We have devoted special attention to the validation of the approach. As a first validation, MoWebA has been used for modelling and generating different types of applications by both novice and experienced modellers and developers. These experiences were done in academic and industrial contexts. The experiences have allowed to identify strengths and weaknesses of the PIM proposal, and to verify that the proposed notation covers the needs of different domains. Next, we present a preliminary validation of the ASM proposal, considering an experience of different ASM definitions made by a group of computer science students at the Catholic University "Nuestra Señora de la Asunción" (Paraguay). This preliminary validation has allowed us to determine how feasible is to adapt the proposal to other architectures. The analysis of the validation sought to answer the following questions: Can the same PIM model be used for different architectures?; Is it possible to specify clear limits between platform independent models (PIM) and architectural specific models (ASM)?; How does an architectural specific model facilitate the transformation rules definition?. Finally, we present a Case Study to validate the extensions of MoWebA to three different architectures. The experience was structured taking into account the framework of Runeson et al. This experience have allowed to carry out three complete extensions. In such extensions we could analysed the grade of adaptability of MoWebA and of automation PIM-ASM, as well as the grade of independence of the PIM metamodel. We have also conducted some user's satisfaction experiences with modelers and developers. / González Toñánez, M. (2022). A Navigational Role-Centric Model Oriented Web Approach MoWebA [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181470