La sénescence réplicative est le phénomène associé à un arrêt de croissance permanent causé par le raccourcissement progressif des télomères à chaque division. Lorsqu’ils atteignent une longueur critique, les télomères perdent leur structure terminale protectrice en t-loop, ce qui révèle l’extrémité du chromosome et déclenche une Réponse aux dommages à l’ADN (RDA) p53-dépendante. Le nombre de télomères ouverts nécessaire à la mise en place de la sénescence n’est pas connu, mais plusieurs évidences suggèrent que la cellule pourrait en tolérer un certain nombre avant de s’arrêter définitivement. Dans ce projet, nous utilisons un dominant négatif de Tin2 (Tin2DN), un membre du complexe nucléo-protéique nommé le télosome qui stabilise la t-loop, pour démontrer que la dysfonction chromatinienne télomérique seule ne suffit pas à déclencher un arrêt de croissance permanent. Lorsqu’il est exprimé, Tin2DN induit la formation de foyers de dommages de 53BP1, la RDA ainsi qu’un arrêt de croissance transitoire. De façon surprenante, nous observons que les cellules qui ont subi ce premier arrêt de croissance ré-entrent dans le cycle cellulaire et se divisent, et ce malgré la présence de foci télomériques. Cette réentrée cause l’apparition de cassures secondaires ainsi qu’une accumulation d’instabilités génomiques, telles que des ponts chromosomiques ou des micro-noyaux. Cet échappement des points de blocages du cycle cellulaire pourrait être expliqué par notre observation que la dysfonction télomérique induite par Tin2DN n’active que très faiblement p53 et p21, et pratiquement pas la kinase chkChk2. Néanmoins, en inhibant directement l’activité de p53, nous n’observons plus aucun arrêt de croissance mais une accumulation de foci et d’instabilités génomiques, avec une forte occurrence de catastrophes mitotiques. L’ensemble de ces résultats propose un nouveau modèle d’entrée en sénescence réplicative : l’ouverture des télomères induits une faible RDA menant à un premier arrêt de prolifération transitoire p53-dépendant. Les cellules échappent à cet arrêt et se divisent, mais l’ouverture des télomères ayant causé des fusions chromosomiques, la division crée alors de nouvelles cassures doubles brins dans le génome qui déclencheront une forte RDA et un nouvel arrêt de croissance permanent, la sénescence réplicative. / Replicative senescence is the physiological permanent growth arrest caused by telomeres shortening, at each round of replication. Once they have reach a critical length, the telomeres lose their t-loop structure, revealing the chromosome extremity that triggers a p53-dependant DNA damage response (DDR) and leads to proliferation arrest. The number of shortened telomeres that are necessary to onset senescence is not known, but accumulating evidences suggest that the cell is able to tolerate a certain level of telomere uncapping before stopping its divisions. Here, we used an inducible dominant negative form of Tin2 (Tin2DN), a member of the shelterin complex that stabilizes the t-loop, to show that telomeres uncapping alone is not sufficient to induce a stable growth arrest. When expressed, Tin2DN leads to the openingverture of the t-loop, creating a DDR with the formation of 53BP1 DNA damage foci (DDF) and a transient growth arrest. Indeed, we observed that the cells were re-entering the cell cycle and dividing, despite their uncapped DDF harbouring telomeres. As telomere uncapping creates chromosome fusions, such division leads to the apparition of secondary DNA breaks, with an accumulation of genomic instabilities, such as chromosomes bridges or micronuclei. We observed that Tin2 DN-induced telomere uncapping leads to a very weak activation of p53 and p21, with almost no phosphorylation of chkChk2. Nevertheless, when we infected our cells with a shp53, the primary growth arrest did not occur, leading to an amplification of the damages, with strong signs of instability and mitotic catastrophe. Altogether, these results propose a new model for replicative senescence: telomere uncapping induces a weak DDR that leads to a transitory growth arrest. The cells divide with fused chromosomes, creating new randomly distributed double strand breaks that trigger a stronger DDR and a permanent growth arrest. In that model, replicative senescence is not directly induced by telomere uncapping, but by an amplification of DNA damages through mitotic catastrophe.

La plupart des traitements anticancéreux, comme la chimiothérapie ou la radiothérapie, sont cytotoxiques et causent des dommages à l'ADN dans le but d’induire la mort des cellules tumorales. Cependant, l’efficacité d’activité de réparation de l'ADN des tumeurs entraine des résistances intrinsèques et acquises aux traitements. L'une des étapes précoces de la réparation de l’ADN est le recrutement de protéines au niveau du site de dommage. Ce recrutement est coordonné par une cascade de modifications et est contrôlé par des protéines senseurs telles que la protéine kinase ADN dépendante (DNA-PK) et / ou la poly (ADP- ribose) polymérase (PARP). Dans ce manuscrit, nous avons identifié et caractérisé le mécanisme d'action de petites molécules d'ADN (les siDNA), mimant des cassures double brin (appelé Dbait) ou simple brin (appelé Pbait), dans l’inhibition des voies de réparation des cassures simple brin (SSBR/BER). Nous démontrons que les molécules Dbait recrutent et activent à la fois PARP et DNA-PK, contrairement aux molécules Pbait qui ne recrutent que la PARP. L'étude comparative de ces deux molécules permet d'analyser les rôles respectifs des deux voies de signalisation: les deux molécules recrutent les protéines impliquées dans la voie de réparation des cassures simple brin (comme PARP, PCNA et XRCC1) et empêchent leurs recrutements aux niveaux des lésions chromosomiques. Les molécules Dbait inhibent par ailleurs le recrutement des protéines impliquées dans la voie de réparation des cassures double brin (NHEJ et HR). Pbait et Dbait désorganisent la réparation de l’ADN et sensibilisent les cellules tumorales aux traitements. L’inhibition de la réparation des cassures simple brin semble dépendre d’un piégeage des protéines directement sur les siDNA ou indirectement sur les polymères PAR. L’inhibition des voies de réparation des cassures double brin (DSB) semble par contre se faire de façon indirecte ; cette inhibition résulterait plutôt de la phosphorylation des protéines de réparation des DSB de part l’activation de DNA-PK. Les molécules Dbait et Pbait induisent un effet de létalité synthétique des cellules tumorales BRCA mutées. Cependant, la mutation BRCA semble être suffisante mais non nécessaire pour induire la sensibilité des cellules tumorales aux traitements Dbait. En effet, nous avons démontré que les molécules Dbait peuvent aussi sensibiliser les cellules ne présentant pas de mutation BRCA mais ayant toutefois une forte instabilité génétique. Nous avons trouvé une corrélation entre le niveau basal de protéines de réparation de l'ADN (ɣH2AX, PARP et PAR), le taux basal de cassures à l’ADN, la présence de micronoyaux (MN) et la sensibilité des cellules tumorales au traitement Dbait. Nous avons émis l’hypothèse que cette instabilité génétique, déterminé par la quantification de MN dans des biopsies tumorales, pourrait être un biomarqueur prédictif de l’effet du Dbait, non seulement dans les cancers du sein, mais aussi dans les glioblastomes, les mélanomes, les mélanomes uvéaux et les cancers du côlon. / Most conventional cancer treatments, such as chemotherapy or radiotherapy, are cytotoxic and cause DNA damages in the tumoral treated cells, which ultimately lead to their death. However, several intrinsic and acquired resistances of tumors to these treatments are due to the tumor efficient DNA repair activities. One of the major early steps of DNA repair is the recruitment of repair proteins at the damage site and this is coordinated by a cascade of modifications controlled by sensor proteins such as DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) and/or poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). In this manuscript, we identify and characterize the mechanism of action of short interfering DNA molecules (siDNA), mimicking double-strand breaks (called Dbait) or single-strand breaks (called Pbait) in Single Strand Break Repair pathway (SSBR/BER) inhibition. We demonstrate that Dbait bound and induced both PARP and DNA-PK activities, whereas Pbait acts only on PARP. The comparative study of the two molecules allows analysis of the respective roles of the two signaling pathways: both molecules recruit proteins involved in single-strand break repair (such as PARP, XRCC1 and PCNA) and prevent their recruitment at chromosomal damage. Dbait, but not Pbait, also inhibits recruitment of proteins involved in double-strand break (DSB) repair. By these ways, Pbait and Dbait disorganized DNA repair, thereby sensitizing cells to treatments. SSB repair inhibition depends upon a direct trapping of the main proteins on both molecules and an indirect trapping in PAR polymers. DSB repair inhibition may be indirect, resulting from the phosphorylation of DSB repair proteins by activated DNA-PK. The DNA repair inhibition by both molecules is confirmed by their synthetic lethality with BRCA mutations tumoral cell lines. However, BRCA mutation could be sufficient but not necessary to induce breast cancer cell lines and tumors sensitivity to Dbait treatment. In fact, we demonstrate that Dbait molecules could also have a stand-alone effect in BRCA wild type cells with a high genetic instability. We found a correlation between DNA repair proteins basal level (ɣH2AX, PARP and PAR), DNA break basal level, presence of micronucleus (MN) and tumoral cell lines sensitivity to Dbait treatment. We hypothesis that this genetic instability, determined by MN in tumor biopsies, could be a predictive biomarker of Dbait stand-alone effect, not only in breast cancer treatment, but also in glioblastoma, melanoma, uveal melanoma and colon cancer treatment.