In our analysis I was interested in the gene duplications, with focus on in-paralogs. In-paralogs are gene duplicates which arose after species split. Here I analysed the in-paralogs quantitatively, as well as qualitatively. For quantitative analysis genomes of 21 species were taken. Most of them have vastly different lifestyles with maximum evolutionary distance between them 1100 million years. Species included mammals, fish, insects and worm, plus some other chordates. All the species were pairwised analysed by the Inparanoid software, and in-paralogs matrix were built representing number of in-paralogs in all vs. all manner. Based on the in-paralogs matrix I tried to reconstruct the evolutionary tree using in-paralog numbers as evolutionary distance. If all 21 species were used the resulting tree was very far from real one: a lot of species were misplaced. However if the number was reduced to 12, all of the species were placed correctly with only difference being wrong insect and fish clusters switched. Then to in-paralogs matrix the neighbour-net algorithm was applied. The resulting "net" tree showed the species with fast or slow duplications rates compared to the others. We could identify species with very high or very low duplications frequencies and it correlates with known occurrences of the whole genome duplications. As the next step I built the graphs for every single species showing the correlation between their in-paralogs number and evolutionary distance. As we have 21 species, graph for every species is built using 20 points. Coordinates of the points are set using the evolutionary distance to that particular species and in-paralogs number. In mammals with increasing the distance from speciation the in-paralogs number also increased, however not in linear fashion. In fish and insects the graph close to zero is just the same in mammals' case. However, after reaching the evolutionary distances more than 800 million years the number of inparalogs is beginning to decrease. We also made a simulation of gene duplications for all 21 species and all the splits according to the fossil and molecular clock data from literature. In our simulation duplication frequency was minimal closer to the past and maximum in the near-present time. Resulting curves had the same shape the experimental data ones. In case of fish and insect for simulation the duplication rate coefficient even had to be set negative in order to repeat experimental curve shape. To the duplication rate coefficient in our simulation contribute 2 criteria: gene duplications and gene losses. As gene duplication is stochastical process it should always be a constant. So the changing in the coefficient should be solely explained by the increasing gene loss of old genes. The processes are explained by the evolution model with high gene duplication and loss ratio. The drop in number of in-paralogs is probably due to the BLAST algorithm. It is observed in comparing highly divergent species and BLAST cannot find the orthologs so precisely anymore. In the second part of my work I concentrated more on the specific function of inparalogs. Because such analysis is time-consuming it could be done on the limited number species. Here I used three insects: Drosophila melanogaster (fruit y), Anopheles gambiae (mosquito) and Apis mellifera (honeybee). After Inparnoid analyses and I listed the cluster of orthologs. Functional analyses of all listed genes were done using GO annotations and also KEGG PATHWAY database. We found, that the gene duplication pattern is unique for each species and that this uniqueness is rejected through the differences in functional classes of duplicated genes. The preferences for some classes reject the evolutionary trends of the last 350 million years and allow assumptions on the role of those genes duplications in the lifestyle of species. Furthermore, the observed gene duplications allowed me to find connections between genomic changes and their phenotypic manifestations. For example I found duplications within carbohydrate metabolism rejecting feed pattern adaptation, within photo- and olfactory-receptors indicating sensing adaptation and within troponin indicating adaptations in the development. Despite these species specific differences, found high correlations between the independently duplicated genes between the species. This might hint for a "pool" of genes preferentially duplicated. Taken together, the observed duplication patterns reject the adaptational process and provide us another link to the field of genomic zoology. / In unserer Analyse untersuchten wir Genduplikationen mit besonderem Fokus auf "Inparalogen". In-paraloge sind Genduplikationen die nach Speziazion enstehen. Diese betrachteten wir hier in einer quantitativen als auch qualitativen Messreihe. Die quantitative Analyse umfasste Genome aus insgesamt 21 Spezies. Der Großteil diese hat verschiedene Lebensgewonheiten mit eine maximalen Evolutionsdistanz von 1100 Millionen Jahren. Die Arten bestanden aus Säugetiere, Fischen, Insekten und Würmern, sowie weiteren Chordaten. Alle Arten wurden mittels der Inparanoid Software paarweise "all against all" analysiert und in in-paralog Matrizen gespeichert. Basierend auf der in-paralog Matrix versuchten wir den evolutionären Baum über die Anzahl der In-paraloge als Maß für die evolutionäre Distanz zu rekonstruiren. Bei der Betrachtung alle 21 Arten würde der Baum jedoch sehr unpräzise: viel Arten wurden falsch plaziert. Durch eine Reduktion der Anzahl auf nur 12 Spezies clusterten jedoch alle Arten richtig, nur Insekten und Fische waren vertauscht. Anschließend wurde auf die In-paralog Matrix der Neighbor-net Algorithmus angewandt. Der daraus resultierende "Netz"-Baum repräsentiert die Spezies mit schneller oder langsamer Duplikationsrate im Vergleich zu den Anderen. Wir konnten Spezies mit sehr niedriger oder sehr hoher Rate identifizieren. Dabei korrelieren die Genome mit der höheren Rate zu der Anzahl der auftauchenden Whole Genome Duplikationen. Im nächsten Schritt erstellten wir Graphen für jede einzelne Spezies die das Verhältnis zwischen der Anzahl ihrer In-paraloger zur evolutionäre Distanz anzeigen. Jeder der 21 Graphen enthält insgesamt 20 Punkte. Die Punktkoordianten repräsentiern die evolutionere Distanz auf der X-Achse zu der Anzahl In-paraloger auf der Y-Achse. Bei Säugertieren wächst mit steigender Distanz auch die Anzahl In-paraloger. Das Verhältnis ist jedoch nicht linear. Bei Fischen und Insekten ist der Graph in der Nähe des Nullpunkts gleich dem von Säugetieren. Beim Erreichen einer Distanz von mehr als 800 Millionen Jahren sinkt jedoch die Anzahl der In-paralogen. Wir haben nun zusätzlich eine Simulation der Genduplikationen für alle 21 Spezies und alle dazu gehörigen Splits durchgeführt. Die Splits wurden aus publizierten Fossilien und "Molecular Clock" Daten entnommen. In unsere Simulation stieg die Duplikationsrate mit Annäherung an die heutige Zeit. In Vergleich zu den Experimentellen Daten haben die simulierten Graphen das gleiche Aussehen. Bei Fischen und Insekten musste der Koeffizient der Duplikationsrate negiert werden um die experimentelle Kurve zu erhalten. Der Koeffizient der Duplikationsrate stützt sich dabei auf folgende 2 Kriterien: Gen-Duplikation und Gen-Verlust. Da Genduplikationen einem stochastischen Prozess folgen sollten sie immer konstant sein. Daher sind die erhöhten Genverluste alter Gene verantwortlich für die Veränderunrg dieses Koeffizienten. Die Erklärung für dieses Verhalten basiert auf dem Evolutionsmodel - mit hohem Gen-Verlust und hoher Gen Duplikation. Der Verlust der In-Paralogen enstehet wahrscheinlich durch den BLAST Algorithmus. Man beobachtet dies besonders bei sehr divergenten Arten bei dennen BLAST die Orthologen nicht mehr so präzise findet. Der zweite Teil meiner Arbeit bezieht sich auf die spezifische Funktion von In-paralogen. Da diese Analyse sehr zeitaufwendig ist konnte sie nur an einer begrenzten Anzahl von Spezies durchgeführt werden. Hier habe ich die folgenden drei Insekten verwendet: Drosophila melanogaster (Fruchtfliege), Anopheles gambiae (Moskito) und Apis mellifera (Honigbiene). Alle durch die Inparanoid-Software entstandenen Cluster wurden mit der GO Annotation und der KEGG Pathway Datenbank analyiert. Wir haben herausgefunden, dass das Gen-Duplikationsmuster für jede Spezies einzigartig ist, und dass diese Einzigartigkeit durch Funktionale Unterschiede in duplizierten Genen entsteht. Die Bevorzugung einiger Gene repräsentiert die Evolutionsgeschichte der letzten 350 Millionen Jahre und erlaubt Annahmen über die Auswirkung der Gen Duplikationen im Leben der Spezies zu treffen. Weiterhin fanden wir durch die beobachteten Genduplikationen Zusammenhänge zwischen der Genomveränderung und ihrer phenotypischen Manifestation. Beispielsweise haben wir Duplikationen innerhalb des Karbohydratestoffwechsels für die Anpassung des Essvehaltens, Photo- und Olifaktorisch Rezeptoren - für Seh- und Geruchsvermögen und Troponin - zuständig für die Muskelentwicklung gefunden. Trotz diese speziesspezifischen Unterschiede haben wir starke Korrelation zwischen unabhängig duplizierten Genen erkannt. Dies könnte ein Indikator für einen "Pool" von bevorzugt duplizierten Genen sein. Zusammengefasst stellen die beobachteten Duplikationsmuster den Evolvierungsprozess dar, und liefern eine weitere Verbindung zur genomischen Zoologie.

Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung einer Kopienzahlvariante (CNV) im Erbgut, die zu einer genomischen Duplikation des SLC2A3-Gens führt. Die Auswirkungen der SLC2A3- Duplikation wurden im Zellkulturmodell und durch bildgebende Verfahren untersucht. Für die SLC2A3-Duplikation konnte eine populationsspezifische Assoziation mit ADHS gezeigt werden (Merker et al. 2017). SLC2A3 kodiert für den neuronalen Glukosetransporter GLUT3, der u.a. Prozesse der Neurotransmitterfreisetzung und Synaptogenese vermittelt und daher wichtig für die Hirnreifung ist. Mögliche Endpunkte für Endophänotypen, die auf einem alterierten Glukosemetabolismus basieren, sind dysfunktionale Hungerregulationsmechanismen ebenso wie eine veränderte neurale Reaktivität gegenüber emotionalen Stimuli und Belohnungsreizen. In zwei peripheren Zellmodellen konnte gezeigt werden, dass die SLC2A3-Duplikation Gen-Dosis-abhängig zu einer Steigerung der basalen SLC2A3-mRNA Expression führt. Ein Expressionsunterschied auf Proteinebene konnte jedoch nicht gefunden werden. Metabolischer Zellstress durch Aushungern der Zellkulturen und eine niedrige Glukosekonzentration im Zellkulturmedium führten zu einer signifikanten Erhöhung des schon unter basalen Bedingungen vorhandenen SLC2A3-Expressionsunterschiedes zwischen Duplikations- und Kontrollzelllinien. Dies deutet darauf hin, dass die SLC2A3-Duplikation bei verminderter zellulärer Energiezufuhr zu einer Überkompensation der Glukoseaufnahme führt. In einer fMRT-Untersuchung wurden erwachsene ADHS-Patienten mit SLC2A3- Duplikation mit ADHS-Patienten und gesunden Kontrollen mit jeweils 2 Genkopien hinsichtlich ereigniskorrelierter neuraler Aktivität als Antwort auf emotionale Stimuli und Essensreize verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die SLC2A3-Duplikation zu einer veränderten Reaktivität gegenüber hochkalorischen Essensreizen führt, was sich in einem durch maschinelles Lernen identifizierten multivariaten neuralen Antwortmuster und einer relativen Unterschätzung des Kaloriengehaltes hochkalorischer Nahrung zeigt. Bei der univariaten Gesamthirn-Analyse der Bilddaten wurden keine signifikanten Gruppenunterschiede gefunden, was darauf hinweist, dass unter den gewählten Versuchsbedingungen keine fokal umschriebenen Gruppenunterschiede der Hirnaktivierung bestehen. Diese Arbeit zeigt, dass die SLC2A3-Duplikation zu einer Erhöhung der SLC2A3- Genexpression mit bisher unbekannten Auswirkungen auf nachgeschaltete Stoffwechselwege und zu einem komplex veränderten neuralen Antwortmuster führt, das durch einen linearen Zusammenhang nicht zu beschreiben ist. Weitere Untersuchungen auf Zellebene und eine Erweiterung der bildgebenden Verfahren könnten zu einer besseren Einordnung der SLC2A3- Duplikation bezüglich ihres Anteils an der endophänotypischen Varianz der ADHS führen. / This thesis is dedicated to the investigation of a genomic copy number variant (CNV) which leads to a duplication of the SLC2A3 gene. The effects of the SLC2A3 duplication were examined in cell culture models and by imaging genetics. The SLC2A3 duplication is associated with ADHD on a population level (Merker et al. 2017). SLC2A3 encodes the neuronal glucose transporter GLUT3 which mediates processes of neurotransmitter release and synaptogenesis and therefore is crucial for brain development. Dysfunctional mechanisms of hunger regulation and an altered neural reactivity towards emotional and reward associated stimuli are possible endophenotypic end points based on an altered glucose metabolism. In two peripheral cell models the SLC2A3 duplication could be shown to lead to a significant increase in basal SLC2A3 mRNA expression levels. On protein level, however, the expression did not differ. Metabolic cell stress induced by cell starving and low glucose concentrations in cell culture media led to a significant increase of SLC2A3 expression differences between duplication and control cell lines. It was concluded that in states of decreased cellular energy supply the SLC2A3 duplication triggers an overcompensation of glucose uptake. Adult ADHD patients with SLC2A3 duplication were compared to ADHD patients and healthy controls each with 2 gene copies of SLC2A3 by means of fMRI regarding event related neural activity towards emotional stimuli and food cues. It could be shown, that the SLC2A3 duplication leads to an altered reactivity towards high caloric food cues which was indicated by a multivariate neural response pattern and relative underestimation of calories of high caloric food. The whole brain univariate standard analysis showed no significant group differences. Therefore, it was concluded that under the experimental conditions the SLC2A3 duplication does not induce alterations in focal brain activity. This work shows that the SLC2A3 duplication is associated with an increase in SLC2A3 gene expression with so far unknown consequences on downstream metabolic pathways. Furthermore the SLC2A3 duplication leads to a complex change in neural response that can not be described by a linear association. Further investigation on cellular level and extension of the imaging studies might elucidate the contribution of the SLC2A3 duplication to the endophenotypic variance in ADHD.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Konstanz, Univ., Diss., 2005.

Konstanz, Univ., Diss., 2004.

Thesis (doctoral)--Swedish University of Agricultural Sciences, 2000. / Thesis based on 4 papers, which are included in the volume. Includes bibliographical references.

Neuropsychiatric disorders, such as attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD), represent a burden which deeply impair the patient’s life. Neurobiological research has therefore increasingly focused on the examination of brain neurotransmitter systems, such as the serotonin (5-HT) system, since a dysfunction has been repeatedly implicated in the pathology of these diseases. However, investigation of functional human neurons in vitro has been restricted by technical limitations for a long time until the discovery of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) revolutionized the field of experimental disease models. Since the pathogenesis of neuropsychiatric disorders involves a complex genetic component, genome-wide association studies (GWAS) revealed numerous risk genes that are associated with an increased risk for ADHD. For instance, the novel ADHD candidate gene SLC2A3 which encodes the glucose transporter-3 (GLUT3), facilitates the transport of glucose across plasma membranes and is essential for the high energy demand of several cell types, such as stem cells and neurons. Specifically, copy number variants (CNVs) of SLC2A3 might therefore impact cerebral glucose metabolism as well as the assembly of synaptic proteins in human neurons which might contribute to the pathogenesis of ADHD. We hypothesized that an altered SLC2A3 gene dosage in human neurons can exert diverse protective or detrimental effects on neurodevelopmental processes as well as the coping of glucometabolic stress events, such as hypo- and hyperglycaemic conditions. The generation of specific iPSC lines from ADHD patients and healthy probands served as basis to efficiently differentiate stem cells into 5-HT specific neurons. Using this neuronal culture, we were able to examine effects of SLC2A3 CNVs on the basal expression of SCL2A3 and GLUT3 in human neurons. Furthermore, the focus was on potentially altered coping of the cells with glucose deprivation and the treatment with specific high- and low glycaemic media. High-resolution fluorescence imaging in combination with electrophysiological and molecular biological techniques showed that: 1) The generated human iPSCs are fully reprogrammed human stem cells showing typical characteristics of embryonic stem cell-like morphology, growth behaviour, the ability to differentiate into different cell types of the human body and the expression of pluripotency-specific markers. 2) The neuronal subtype derived from our stem cells display typical characteristics of 5-HT specific median and dorsal neurons and forms synapses reflected by the expression of pre- and postsynaptic proteins. 3) Even if SLC2A3 CNVs influence SLC2A3 and GLUT3 basal expression, no significant alterations in gene and protein expression caused by hyper- and hypoglycaemic conditions, nor in the assembly of proteins associated with synapse formation could be observed in human iPSC-derived neurons. / Neuropsychiatrische Erkrankungen, wie das Aufmerksamkeits-Defizit/Hyperaktivitäts-Syndrom (ADHS), stellen eine Belastung dar, die das Leben des Patienten schwerwiegend beeinträchtigen. Die neurobiologische Forschung hat sich deshalb zunehmend auf die Untersuchung der Neurotransmittersysteme des Gehirns, wie das serotonerge (5-HT) System fokussiert, da eine Dysfunktion wiederholt in Zusammenhang mit der Pathogenese solcher Erkrankungen gebracht wurde. Die in vitro-Untersuchung funktioneller humaner Neurone war jedoch lange Zeit durch technische Limitierungen eingeschränkt, bis die Entdeckung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) das Feld der experimentellen Krankheitsmodelle revolutionierte. Da die Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen eine komplexe genetische Komponente einschließt, haben genomweite Assoziationsstudien zahlreiche Risikogene aufgedeckt, die mit einem erhöhten Risiko für ADHS assoziiert werden. Das Kandidatengen SLC2A3, das den Glukosetransporter-3 (GLUT3) codiert, ermöglicht beispielsweise den Transport von Glukose über Plasmamembranen und ist somit essenziell für die hohe Energieanforderung verschiedenster Zelltypen, wie etwa Stammzellen und Neurone. Im Besonderen könnten die Kopienzahlvarianten (CNVs) des Gens SLC2A3 daher den cerebralen Glukosemetabolismus, sowie die Ansammlung synaptischer Proteine beeinflussen und so zur Pathogenese des ADHS beitragen. Wir nahmen an, dass eine veränderte SLC2A3-Gendosis in humanen Neuronen diverse protektive oder schädliche Effekte auf Neuroentwicklungsprozesse, sowie den Umgang mit glukometabolischen Stress-Ereignissen, wie etwa hypo- und hyperglykämische Bedingungen haben könnte. Die Generierung spezieller iPSC-Linien von ADHS-Patienten und gesunden Probanden diente als Basis, um Stammzellen effizient in 5-HT spezifische Neurone zu differenzieren. Diese neuronale Kultur ermöglichte uns die Untersuchung der Effekte der SLC2A3 CNVs auf die Basalexpression von SLC2A3 und GLUT3 in humanen Neuronen. Des Weiteren war der Focus auf einen potenziell veränderten Umgang der Zellen mit Glukoseentzug und der Behandlung mit speziellen hoch- und niederglykämischen Medien. Hochauflösende Fluoreszenzaufnahmen in Kombination mit elektrophysiologischen und molekularbiologischen Techniken zeigten, dass: 1) Die generierten human iPSCs vollständig reprogrammierte humane Stammzellen sind, die die typischen Merkmale der embryonalen Stammzell-Morphologie, des Wachstumsverhaltes, der Fähigkeit in verschiedenste Zelltypen des menschlichen Körpers zu differenzieren und der Expression Pluripotenz-assoziierter Marker aufweisen. 2) Der neuronale Subtyp, der aus unseren Stammzellen generiert wurde, die typischen Charakteristiken medianer und dorsaler 5-HT Neurone aufweist und Synapsen formt, verdeutlicht durch die Expression prä- und postsynaptischer Proteine. 3) Selbst wenn die SLC2A3 CNVs einen Einfluss auf die basale Gen- und Proteinexpression haben, zeigte sich jedoch in humanen iPSC-erzeugten Neuronen keine signifikante Veränderung der Gen- und Proteinexpression aufgrund hyper- und hypoglykämischer Konditionen, noch der Ansammlung der Proteine, die mit der Formation der Synapsen assoziiert sind.

In mono- und eudikotylen Pflanzen kodiert eine Genfamilie (RpoT, RNA-Polymerase des T3/T7-Typs) mitochondriale und plastidäre RNA-Polymerasen (RNAP), die den ungeraden T-Phagen-Polymerasen ähneln. RpoT-Gene von Angiospermen sind gut charakterisiert, während aus tiefer abzweigenden Pflanzenspecies bisher lediglich die Gene aus dem Moos Physcomitrella beschrieben wurden. Um einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Evolution der RpoT-Polymerasen im Pflanzenreich zu liefern und um Erkenntnisse über die potentielle Bedeutung von multiplen Phagen-Typ (RNAP) in Pflanzen zu gewinnen, wurden die RpoT-Gene aus dem Lycophyten Selaginella moellendorffii und aus dem basalen Angiosperm Nuphar advena identifiziert und charakterisiert. Selaginella moellendorffii (Moosfarn)-Trace-Sequenzdaten mit hoher Ähnlichkeit zu RpoT-Sequenzen von Angiospermen wurden benutzt, um das full-length SmRpoT-Gen und die entsprechende cDNA zu isolieren. Die SmRpoT-mRNA ist 3542 nt lang und weist einen offenen Leserahmen von 3006 nt auf, der für ein putatives Protein aus 1002 Aminosäuren mit einer molekularen Masse von 113 kDa kodiert. Das SmRpoT-Gen besteht aus 19 Exons und 18 Introns, die in ihren Positionen mit denen aus den Angiosperm- und Physcomitrella-Genen konserviert sind. Mittels Southernblot-Analyse wurde nachgewiesen, dass S. moellendorffii ein single-copy RpoT-Gen kodiert. Für das N-terminale Transitpeptid von SmRpoT konnte gezeigt werden, dass es bei transienter Expression in Arabidopsis- und Selaginella-Protoplasten den Transport von GFP (green fluorescent protein) exclusiv in Mitochondrien vermittelt. In N. advena wurden mittels Screening einer BAC-Bibliothek drei RpoT-Gene identifiziert. Sowohl die genomischen als auch die cDNA-Sequenzen wurden aufgeklärt. Die NaRpoT-mRNAs kodieren putative Polypeptide von 996, 990 und 985 Aminosären. Alle drei Gene besitzen 19 Exons und 18 Introns, die in ihren Positionen mit denen der RpoT-Gene aus Selaginella und allen anderen Landpflanzen konserviert sind. Die kodierten Proteine weisen auf Aminosäureebene einen hohen Konservierungsgrad auf, einschließlich aller essentiellen Regionen und Aminosäurereste, die für die T7-RNAP bekannt sind. Die N-terminalen Transitpeptide zweier der kodierten RNAP, NaRpoTm1 und NaRpoTm2, vermittelten den Import von GFP exclusiv in Mitochondrien, während die dritte Polymerase, NaRpoTp, in Chloroplasten importiert wurde. Interessanterweise muß die Translation der NaRpoTp-mRNA an einem CUG-Codon initiiert werden, um ein funktionelles Protein mit plastidärem Transitpeptid zu erhalten. Die N. advena RpoTp-RNAP ist somit neben AGAMOUS aus Arabidopsis und der RpoTp-RNAP aus Nicotiana, ein weiteres Beispiel für jene selten vorkommenden pflanzlichen mRNAs, deren Translation exclusiv an nicht-AUG-Codons initiiert wird. Die Rekonstruktion von phylogenetischen Bäumen resultierte in unterschiedlichen Positionen für die Selaginella- und Nuphar-Polymerasen: Im Gegensatz zu der RpoT-Polymerase aus S. moellendorffii und denen aus Physcomitrella, die in den phylogenetischen Analysen Schwesterpositionen zu allen anderen Phagentyp-RNAP der Angiospermen einnehmen, clusterten die Nuphar-RpoTs zusammen mit den deutlich separierten mitochondrialen (NaRpoTm1 und NaRpoTm2) und plastidären (NaRpoTp) Polymerasen. Selaginella kodiert eine einzige mitochondriale RNAP, während Nuphar zwei mitochondriale und eine plastidäre RNAP besitzt. Die Identifizierung einer Plastiden-lokalisierten Phagentyp-RNAP in diesem basalen Eudikotylen, die ortholog zu allen anderen RpoT-Enzymen der Blütenpflanzen ist, läßt darauf schließen, daß die Acquisition einer nukleär kodierten plastidären RNAP, die noch in den Lycopoden fehlt, nach der Trennung der Leucopoden von allen anderen Tracheophyten erfolgte. Eine “dual-targeting” RNAP (mitochondrial und plastidär lokalisiert), wie sie in Eudikotylen, nicht jedoch in Monokotylen vorkommt, wurde weder in Selaginella noch in Nuphar nachgewiesen, vermutlich ist sie ein evolutionäres Novum von eudikotylen Pflanzen wie Arabidopsis. / In mono- and eudicot plants, a small nuclear gene family (RpoT, RNA polymerase of the T3/T7 type) encodes mitochondrial as well as chloroplast RNA polymerases homologous to the T-odd bacteriophage enzymes. RpoT genes from angiosperms are well characterized, whereas data from deeper branching plant species until recently were limited to the moss Physcomitrella. To elucidate the molecular evolution of the RpoT polymerases in the plant kingdom and to get more insight into the potential importance of having more than one phage-type RNA polymerase (RNAP) available, we identified and characterized RpoT genes in the lycophyte Selaginella moellendorffii and the basal eudicot Nuphar advena. Selaginella moellendorffii (spikemoss) sequence trace data encoding a polypeptide highly similar to angiosperm and moss phage-type organelle RNA polymerases were used to isolate a BAC clone containing the full-length gene SmRpoT as well as the corresponding cDNA. The SmRpoT mRNA comprises 3452 nt with an open reading frame of 3,006 nt, encoding a putative protein of 1,002 amino acids with a molecular mass of 113 kDa. The SmRpoT gene comprises 19 exons and 18 introns, conserved in their position with those of the angiosperm and Physcomitrella RpoT genes. Using Southern blot analysis, it was shown that S. moellendorffii encodes a single RpoT gene. The N-terminal transit peptide of SmRpoT was shown to confer targeting of green fluorescent protein (GFP) exclusively to mitochondria after transient expression in Arabidopsis and Selaginella protoplasts. In Nuphar advena three RpoT genes were identified by BAC library screening. Both genomic gene sequences and full-length cDNAs were determined. The NaRpoT mRNAs specify putative polypeptides of 996, 990 and 985 amino acids, respectively. All three genes comprise 19 exons and 18 introns, conserved in their positions with those from S. moellendorffii and the RpoT genes of other land plants. The encoded proteins show a high degree of conservation at the amino acid sequence level, including all functional crucial regions and residues known from the phage T7 RNAP. The N-terminal transit peptides of two of the encoded polymerases, NaRpoTm1 and NaRpoTm2, conferred targeting of GFP exclusively to mitochondria, whereas the third polymerase, NaRpoTp, was targeted to chloroplasts. Remarkably, translation of NaRpoTp mRNA has to be initiated at a CUG codon to generate a functional plastid transit peptide. Thus, besides AGAMOUS in Arabidopsis and the Nicotiana RpoTp polymerase, N. advena RpoTp provides another example for a plant mRNA that is exclusively translated from a non-AUG codon. Reconstruction of phylogenetic trees revealed different positions of the RpoTs from the lycophyte Selaginella and the basal eudicot Nuphar. In contrast to the RpoTs of S. moellendorffii and those of the moss Physcomitrella, which are according to the phylogenetic analyses in sister positions to all other phage-type polymerases of angiosperms, the Nuphar RpoTs clustered with the well separated clades of mitochondrial (NaRpoTm1 and NaRpoTm2) and plastid (NaRpoTp) polymerases. Selaginella encodes a single mitochondrial RNAP, whereas Nuphar harbors two mitochondrial and one plastid phage-type polymerases. Identification of a plastid localized phage-type RNAP in this basal eudicot, orthologous to all other RpoTp enzymes of flowering plants, suggests that the acquisition of a nuclear encoded plastid RNA polymerase, not present in lycopods, took place after the split of lycopods from all other tracheophytes. A dual-targeted mitochondrial and plastid RNA polymerase (RpoTmp), as present in eudicots but not monocots, was not detected in Nuphar or Selaginella suggesting that its occurrence is an evolutionary novelty of eudicotyledoneous plants like Arabidopsis.

Chromatin ist ein Makromolekül, dessen Genregulation innerhalb des räumlich eingeschränkten Zellkerns organisiert werden muss. Die Genomorganisation ist eng mit Genaktivierung und Genrepression verknüpft. In den vergangenen Jahren wurde gezeigt, dass die DNA hierarchisch organisiert ist. Die Faltung läuft in aufeinander folgenden Schritten ab, wobei jede Organisationsebene sowohl zur räumlichen Komprimierung, als auch zur Genregulation beiträgt. In dieser Dissertation wurden mit Hilfe von hochauflösender Mikroskopie verschiedene Ebenen der 3D Chromatinorganisation auf Einzelzell-Basis untersucht. Auf der kleinsten Organisationsebene wurde die Struktur zweier, nebeneinander liegender topologischer Domänen (TADs) am Sox9-Lokus erforscht. Mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) in 3D Zellen, sowie Cryoschnitten in embryonalen Stammzellen von Mäusen konnten Interaktionen zwischen den benachbarten TADs festgestellt werden. FISH in Zellen mit genomischen Duplikationen, zeigte das Entstehen von zwei unterschiedlichen, durch die Duplikation entstandenen, Konformationen. Unter Verwendung von FISH wurden long-range Kontakte, die zuvor mit GAM entdeckt wurden, untersucht und es zeigte sich, dass sie häufig zwischen TADs die regulatorischen Domänen enthalten auftreten. Zudem zeigte sich die Bildung von Clustern zwischen mehreren, weit auseinander liegenden, regulatorischen Elementen. Dies lässt unter Umständen auf das Entstehen von regulatorischen Zentren zwischen diesen Enhancer-reichen Regionen schließen. Weitere Untersuchungen zeigten Veränderung der sogenannten Super-Enhancer Cluster in unterschiedlichen Zelltypen. Des Weiteren sind Super-Enhancer TADs sehr dekondensiert und wurden häufig an Splicing-Speckle Regionen vorgefunden. / Chromatin needs to organize gene regulation whilst fitting into the confined space of the nucleus. Chromatin organization is therefore intertwined with gene activation and silencing. In recent years many advances in the field of chromatin architecture have been made showing that chromatin is organized hierarchically. Folding occurs in subsequent units, where each level of organization contributes to the spatial compaction of DNA and gene regulation. In this dissertation different levels of 3D chromatin organization were analysed using single-cell, high-resolution imaging. On the smallest scale, the 3D organization of two neighbouring Topologically Associating Domains (TADs) at the Sox9 locus was investigated. Performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) in 3D and cryosectioned mouse embryonic stem cells, extensive contacts between the two neighbouring TADs across the TAD boundary were detected. Applying FISH in a cell line bearing a genomic duplication within the Sox9 locus, the occurrence of two different conformations that result from the duplication was shown. Recent evidence from GAM showed the formation of long-range, multimer contacts between distal regulatory elements. Investigating the occurrence of long-range contacts between super-enhancer TADs in single cells by FISH, showed that they establish frequent interactions at close spatial distances. Furthermore the formation of clusters containing distal super-enhancer TADs could be demonstrated, indicating the possibility of higher-order regulatory hubs between these enhancer-rich regions. Further investigation showed that super-enhancer regions form different clusters in different cell types. Finally, it was shown that super-enhancers are highly decondensed and preferentially located at splicing speckles.