Le but de notre travail est de développer une imagerie des déclins de fluorescence et d'en démontrer les potentialités pour l'étude de la dynamique macromoléculaire et des interactions entre macromolécules en cellules vivantes. Notre approche repose sur la mesure de la corrélation temporelle de photons uniques de fluorescence (TCSPC) simultanément à la détermination de la localisation spatiale (le long d'une ligne) de la région d'émission. Des images monodirectionnelles de déclins de fluorescence ont ainsi été obtenues représentant la cinétique de fluorescence en différentes régions subcellulaires. Nous avons également mis au point la mesure de déclins d'anisotropie de fluorescence provenant d'un petit volume subcellulaire (1 µm3) sous microscope en mode confocal. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent l'intérêt de cette approche technologique pour des problématiques de biologie cellulaire. Le marquage fluorescent endogène de protéines a été réalisé en les fusionant à la GFP ou un de ses variants spectraux. Les interactions protéine-protéine ont été étudiées soit par hétéroFRET en mesurant la diminution de la durée de vie de fluorescence du chromophore donneur, soit par homoFRET en mesurant la cinétique de dépolarisation de la fluorescence. Nous avons mis en évidence (i) la formation d'hétérodimères de p45 du facteur de transcription NF-E2 avec deux partenaires dans différents compartiments subcellulaires par hétéroFRET, et (ii) l'homodimérisation de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex type 1 de façon plus concluante par homoFRET que par hétéroFRET. Par ailleurs, la mesure des déclins d'anisotropie de fluorescence de l'éthidium comme sonde de la dynamique torsionnelle de l'ADN a révélé l'existence d'une très forte restriction de cette dynamique dans la chromatine non perturbée. Les développements supplémentaires de notre système pour une imagerie bi-dimensionnelle puis tri-dimensionnelle sont prometteurs.

Les performances de la microscopie biphotonique sont fortement corrélées au développement de marqueurs fluorescents spécifiques. Dans le cadre d'un précédent travail, les dérivés triphénylamines (TP) substitués par des groupements cationiques vinyl-pyridinium, se sont révélés être des candidats particulièrement intéressants : bonne solubilité dans l'eau, taille réduite, photostabilité élevée, forte brillance moléculaire, exaltation de fluorescence en présence d'ADN, émission dans le rouge... L'objectif du travail présenté a consisté à la fois à mieux comprendre l'origine de ces propriétés assez rarement réunies et à explorer les voies d'optimisation potentielles. Dans ce but, nous avons mis en place un banc de microscopie de fluorescence à deux photons résolue en temps. Différents dérivés ont été étudiés de façon à établir des corrélations entre leurs structures et leurs propriétés. De même, différents environnements ont été considérés (tampon, ADN naturel et de synthèse). Nous avons pu mettre en évidence que les dérivés TP interagissent spécifiquement avec l'ADN, vraisemblablement via une insertion dans le petit sillon du double brin d'ADN. Cette insertion entraine une très forte restriction des mouvements intramoléculaires ainsi qu'un changement d'environnement du fluorophore (passage d'un environnement aqueux propice à des effets dits de " quenching" à un environnement organique) : il en résulte, à la fois, une réduction du taux de relaxation non radiative et une augmentation du taux de relaxation radiative. Afin de pouvoir caractériser ces interactions fluorophore-ADN à l'échelle nanométrique, des études complémentaires de microscopie à effet tunnel (STM) sous UHV ont également été entreprises sur ces dérivés. Nous avons par ailleurs essayé de tirer parti des interactions spécifiques TP-ADN pour immobiliser l'ADN sur des substrats d'or atomiquement plans.

Ce mémoire présente la mise en place d'un système complet de microscopie de fluorescence basé sur le processus non linéaire d'absorption à deux photons. Cette technique récente de microscopie biphotonique est caractérisée par de nombreux avantages pour l'étude d'échantillons biologiques, notamment en terme de limitation des photodommages. Combinée à des méthodes d'analyse de la dynamique d'émission de fluorescence, elle permet l'étude à la fois spatiale et temporelle de l'émission de fluorescence. Dans ce contexte, nous avons développé deux techniques d'analyse résolue en temps de la fluorescence. Une première technique d'analyse dynamique, la microscopie de corrélation de fluorescence, basée sur des mesures en micro-volume et sur une faible concentration moléculaire, a essentiellement été appliquée à l'étude du processus de diffusion translationnelle. En particulier, la microscopie de corrélation de fluorescence a permis, avec la sensibilité de détection d'une molécule unique, la détermination des coefficients de diffusion de sondes souvent utilisées en biologie : le FITC-dextran, la GFP (Green Fluorescent Protein) et la fluorescéine. Les performances de cette technique pour les études en milieux biologiques ont par ailleurs été validées par une application novatrice et originale à l'étude des mécanismes de la diffusion moléculaire au sein de biofilms de bactéries. Une deuxième technique d'analyse dynamique, l'imagerie des durées de vie fluorescence sous excitation à deux photons a été développée. La durée de vie de fluorescence d'une molécule, ou durée de vie de l'état excité singulet, est un paramètre caractéristique de l'état physico-chimique et de l'environnement d'une sonde fluorescente. Elle renseigne donc sur de nombreuses propriétés moléculaires essentielles à la compréhension des mécanismes intracellulaires. De premières applications concluantes de cette technique sont présentées, notamment des études in vitro de la réactivité de molécules d'intérêt pharmacologique ainsi que de premières mesures réalisées in vivo.

Dans cette thèse, nous associons mesures expérimentales et modélisation des données pour étudier l'émission spontanée d'émetteurs fluorescents en environnement nano-structuré. Le mémoire est organisé en deux parties.Dans la première partie, nous étudions le transfert d'énergie entre émetteurs fluorescents en environnement plasmonique et sur des distances micrométriques. Pour commencer, nous caractérisons le transfert d'énergie entre deux ensembles d'émetteurs situés en champ proche d'une surface d'argent. Nous déterminons ainsi la dépendance en distance du taux de transfert d'énergie sur des distances micrométriques. Nous couplons ensuite une boite quantique et une bille fluorescente à un nano-fil d'argent et nous étudions le transfert d’énergie entre ces deux émetteurs, distants de plusieurs micromètres. Nous démontrons notamment le clignotement corrélé de ces deux émetteurs grâce à l'étude de la fonction de corrélation de leur intensité de fluorescence.Dans la seconde partie, nous sondons les variations spatiales de densité locale d'états électromagnétiques induites par des environnements nano-structurés grâce à différentes techniques de microscopie à super-résolution. A l'aide d'un microscope à balayage, nous réalisons tout d’abord une étude en trois dimensions de l’interaction de champ proche entre une bille fluorescente et différentes antennes en silicium. Nous introduisons ensuite une technique stochastique permettant de déterminer expérimentalement la position et le taux d'amortissement de molécules uniques photo-activées, avec une précision de localisation de l'ordre de 10 nm. Enfin, nous utilisons l'information de Fisher afin d'estimer les bornes inférieures de l'erreur type des estimations de positions et de taux d'amortissement réalisées dans le cadre de mesures sur molécules uniques. / In this thesis, we perform experimental measurements and data modelling to investigate spontaneous emission of fluorescent emitters in nanostructured environments. The manuscript is organised into two main parts.In the first part, we study micrometre-range energy transfer between fluorescent emitters in plasmonic environments. First of all, we characterise plasmon-mediated energy transfer between ensembles of fluorescent emitters located in the near field of a silver film. We thus determine the distance dependence of the energy transfer rate over micrometre distances. We then couple a single quantum dot and a fluorescent nanobead to a silver nanowire and we study evidences of the energy transfer between the two emitters, separated by several micrometres. We notably demonstrate a correlated blinking of the two emitters through the study of the correlation function of their fluorescence intensity.In the second part, we probe sub-wavelength spatial variations of the local density of electromagnetic states induced by nanostructured environments by means of different super-resolution microscopy techniques. To start with, we perform a three-dimensional study of the near-field interaction between a fluorescent nanobead and different silicon nanoantennas using a scanning-probe microscope. We then introduce a stochastic technique to experimentally determine the position and the fluorescence decay rate of single photo-activated molecules, with a localisation precision of the order of 10 nm. Finally, we use the Fisher information to estimate lower bounds on the standard errors on position and decay rate estimates performed in the context of single-molecule microscopy.

Interaction du champ proche optique avec une unique molecule fluorescente. Mise en place d'un formalisme couplant équations de Bloch optiques et susceptibilité du champ permettant de décrire la fluorescence déclenchée en champ proche. Application à l'interprétation d'images obtenus avec des microscopes en champ proche à sonde moléculaire (PSTM et SNOM). En particulier, mise en évidence du rôle de la densité locale d'états photoniques (LDOS) dans la formation des images. Introduction d'un nouveau concept de guide optique sub-longueur d'onde pour l'adressage moléculaire en géométrie coplanaire.