O estágio larval do Echinococcus granulosus é o agente etiológico da hidatidose. O antígeno B (AgB) é um dos principais componentes antigênicos do liquído hidático do metacestódeo e foi caracterizado como uma lipoproteína imunogêncica de 120-160 kDa. Na presença de agentes redutores, dissocia-se em 8, 16, 24 e 32 kDa, sugerindo que é composto de multímeros de subunidades de 8 kDa. Embora a função biológica do AgB ainda não seja totalmente clara, muitos estudos demonstraram sua atuação junto à processos importantes na relação parasito-hospedeiro, por exemplo, a evasão da resposta imune do hospedeiro. Nosso laboratório já clonou e expressou em Escherichia coli cinco cDNAs que codificam subunidades do AgB, EgB8/1, EgB8/2 e EgB8/3, EgB8/4 e EgB8/5. Um trabalho recente realizado em nosso laboratório demonstrou que as subunidades recombinantes do AgB, rAgB8/1, rAgB8/2 e rAgB8/3, são capazes de autoassociarem em solução formando homo-oligômeros com características estruturais semelhantes ao AgB nativo. Entretanto, neste trabalho não foi testada a heterooligomerização das subunidades recombinantes do AgB, visto que as proteínas recombinantes purificadas foram obtidas já sob a forma de homo-oligômeros, não sendo possível a mistura destas subunidades para este fim. Este trabalho tem como objetivo investigar a possível hetero-oligomerização das subunidades recombinantes do AgB através de experimentos de co-expressão. As sequências codificadoras do AgB (EgB8/2) e (EgB8/3) de E. granulosus foram amplificadas por PCR e os produtos de PCR de ambas as sequências foram clonados no vetor de expressão (pCDF-Duet), o qual possui duas regiões com múltiplos sítios de clonagem (MCS). A fidelidade das sequências clondadas foi confirmada por sequenciamento de DNA. As proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli e pela copurificação em coluna de níquel, foi possível verificar experimentalmente que as subunidades rAgB8/2 e rAgB8/3 estão interagindo entre si. A interação entre as subunidades foi confirmada pela análise por imunoblot e espectrometria de massas. Nossos resultados demostram a hetero-oligomerização das subunidades recombinantes rAgB8/2 e rAgB8/3 de E. granulosus e os dados podem fornecer um possível mecanismo de regulação na oligomerização destas subunidades. É necessário um melhor entendimento da estrutura e dos mecanismos de oligomerização do AgB para usá-lo como um importante alvo na elaboração de novas estratégias de prevenção, controle e tratamento de cestodíases. / The larval stage of Echinococcus granulosus is the etiologic agent of hydatidosis. Antigen B (AgB) is a major protein component of the metacestode hydatid fluid and was characterized as a immunogenic lipoprotein of 120-160 kDa. In presence of reducing agents, dissociates into 8, 16, 24 and 32 kDa, suggesting that their consists of multimers of 8kDa subunits. Although the biological function of AgB is still not entirely clear, numerous studies have demonstrated it engagement in important processes in the host-parasite relationship such as evasion of host immune response. Our laboratory has already cloned and expressed five cDNA encode EgB8/1, EgB8/2 e EgB8/3, EgB8/4 e EgB8/5 antigen B subunits in E. coli. Previous studies from our group demonstrated that recombinant AgB subunits are able to self-associate in solution to form homo-oligomers, presenting similar properties to native AgB. However the hetero-oligomerization of the recombinant AgB subunits were not investigated. Since purified recombinant proteins were already obtained in the form of homo-oligomers and, it was not possible to combine these subunits for this purpose. In this work we aim to investigate the possible hetero-oligomerization of the AgB subunits through co-expression experiments. The cDNA sequences enconding E. granulosus EgAgB8/2 and EgAgB8/3 by PCR and the PCR products of both sequences have been cloned in the expression vector (pCDF-Duet), which has two multiple cloning site (MCS). The fidelity of the cloned sequences was confirmed by DNA sequencing. Afterwards the recombinant proteins rAgB8/2 and rAgB8/3 expressed in Escherichia coli. By co-purification in the nickel column, it was possible to verify experimentally that the two subunits rAgB8/2 and rAgB8/3 are interacting one each other. The interaction between the subunits was confirmed by immunoblotting and mass spectrometry. Our results demonstrated the heterooligomerization of recombinant subunits rAgB8/2 and rAgB8/3 of E. granulosus and these data may help to elucidate a possible mechanism for regulation of the subunits oligomerization process. A better understanding of the structure and mechanisms of oligomerization is necessary since that the AgB as an important target in the development of new strategies for prevention, control and treatment of cestodiasis.

Com base na interação especifica entre o fator de iniciação eucariótico 4E (eIF4E) e o 5’ CAP monometilguanosina (MMGcap) do mRNA foi desenvolvido um eficiente sistema para purificação de mRNA usando um mutante da proteína humana eIF4E. Apesar de o MMGcap ser o mais comum nos mRNAs eucarióticos, em nematoides e platelmintos devido ao processo de trans-splicing há também a presença do 5’ CAP trimetilguanosina (TMGcap). Tendo em vista a capacidade única da eIF4E de helmintos em interagir com ambos MMGcap e TMGcap, nesse trabalho foram analisadas as sequências peptídicas das eIF4E de platelmintos e a aplicação da proteína recombinante eIF4E de Echinococcus granulosus como uma ferramenta para o enriquecimento de amostras com mRNAs a partir de RNA total do parasito. As sequências preditas das eIF4E de platelmintos foram obtidas para 18 platelmintos parasitos e apenas uma isoforma da proteína foi encontrada em cada organismo. Na análise filogenética, essas proteínas formaram um ramo único e divergente, inclusive dos platelmintos de vida livre. A sequência codificante da proteína eIF4E de E. granulosus foi clonada por recombinação in vivo e a proteína recombinante (EgReIF4E) em fusão com a glutationa S-transferase (GST) foi expressa em Escherichia coli. A proteína em fusão foi recuperada a partir da fração solúvel por cromatografia de afinidade, sendo obtido o rendimento de 12,8 mg de proteína por 1 L de cultura. No ensaio de captura de mRNAs através do 5’ CAP pela GST-EgReIF4E foi usado RNA total de E. granulosus e de E. ortleppi. A capacidade da EgReIF4E em capturar mRNAs foi avaliada por RT-qPCR de forma comparativa ao RNA total e aos resultados obtidos de um kit comercial de Oligo-dT. Foram avaliados tanto os genes relacionados ao processo de trans-splicing como os genes que não passam por este processo. Também foi avaliado a presença dos rRNAs nas amostras. Nossos dados preliminares indicam que a EgReIF4E foi capaz de purificar os mRNAs e reduzir os níveis dos rRNAs. Porém, houve perdas significativas de mRNAs, que precisam ser corrigidas. Apesar de promissora para platelmintos, a aplicação dessa metodologia precisa ser melhor padronizada visando o aumento do rendimento global do sistema. / Based on the specific interaction between the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) and the mRNA 5 'CAP monometilguanosina (MMGcap), an efficient system for mRNA purification using a mutant of the human protein eIF4E has been developed. Despite of the MMGcap be the most common in eukaryotic mRNAs, in in parasitic nematodes and flatworms due to the trans-splicing process there is also the 5 'CAP trimetilguanosina (TMGcap). Due to this peculiarity and unique ability of the helminthes eIF4E in interacting with both MMGcap and TMGcap, in this work was analyzed the sequences of eIF4E from flatworms and evaluated the using of eIF4E from E. granulosus (Eg-eIF4E) be used as a tool for purification of mRNA derived from total RNA of the parasite. The predicted sequence of the eIF4E flatworms was obtained for 18 parasitic flatworms and only one protein isoform was found for each species. In phylogenetic analysis of these proteins was formed a unique and divergent branch, even when compared with the free-living flatworms. The coding sequence of the E. granulosus eIF4E protein was cloned by in vivo recombination and the recombinant protein (EgReIF4E) fused to glutathione S-transferase (GST) was expressed using Escherichia coli. The fusion protein was recovered from the soluble fraction by affinity chromatography and the yield was 12.8 mg of protein per 1 L of culture. For the mRNAs capture assay using the 5 'CAP by GST-EgReIF4E were used total RNA from E. granulosus and E. ortleppi. The ability of EgReIF4E to capture mRNAs was evaluated by RT-qPCR compared with the total RNA and the results obtained with the commercial Oligo-dT kit. For comparison and analyzed were selected both genes related to trans-splice process as genes that do not undergo this process. The levels of rRNAs in the samples were also assessed. Our preliminary data indicate that EgReIF4E was able to purify the mRNAs and reduce the levels of rRNA. However, there was a significant loss in the level of mRNAs and it need to be adjusted. Despite of being a promising for flatworms, the implementation of this alternative methodology should be further standardized to increase the overall efficiency of the system.

O termo proteoformas refere-se a todas as formas moleculares na qual variantes proteicas codificadas por um único gene podem ser encontradas, incluindo mudanças devido a variação genética, splicing alternativo e modificações cotraducionais e póstraducionais (MCTs e MPTs, respectivamente). Em Echinococcus granulosus, o agente causador da hidatidose cística, a caracterização de proteoformas ainda não foi sistematicamente abordada e pode revelar mecanimos moleculares relevantes para o estabelecimento do parasito nos hospedeiros intermediários. A caracterização tanto de proteoformas da frutose-bifosfato-aldolase (FBA) e enolase, potencialmente moonlighting, como de outras proteoformas expressas em frações subcelulares do estágio larval deste parasito foi realizada. Em relação às enzimas glicolíticas, várias evidências indicam a EgFBA1 e a EgEno1 como sendo proteínas moonlighting: (i) as localizações não usuais destas proteínas no tegumento de protoescólices e em produtos de excreção/secreção (ES) in vivo (líquido hidático) e in vitro; (ii) características estruturais destas proteínas, com destaque para a identificação de um sítio de ligação à F-actina na estrutura da EgFBA1; (iii) a habilidade destas proteínas de interagirem com várias proteínas não relacionadas à glicólise. Em relação ao repertório de proteínas expressas em frações subcelulares, frações nucleares e citosólicas de protoescólices de E. granulosus foram analisadas através de proteômica top down e bottom up. De modo geral, 525 proteínas foram identificadas, sendo 224 e 156 proteínas exclusivamente detectadas em frações nucleares e citosólicas, respectivamente. Além da identificação de proteínas, nossa abordagem de proteômica top down também permitiu a caracterização de MCTs e MPTs, destacando a excisão da metionina N-terminal e a acetilação N-terminal como modificações conservadas nas proteínas de E. granulosus. Nossos resultados representam as primeiras evidências de funções alternativas realizadas por enzimas glicolíticas em E. granulosus e sugerem que proteínas multifuncionais devem desempenhar papéis importantes na interação parasitohospedeiro. Os proteomas nuclear e citosólico de protoescólices também foram descritos, revelando novos aspectos da biologia do parasito, incluindo proteoformas com MCTs e MPTs, as quais devem desempenhar papéis críticos na regulação de processos celulares deste parasito. / The term proteoforms refers to all molecular forms in which the protein product of a single gene can be found, including changes due to genetic variation, alternatively spliced RNA transcripts and co-translational and post-translational modifications (CTMs and PTMs, respectively). In Echinococcus granulosus, the causative agent of hydatid disease, the characterization of proteoforms has never been systematically addressed and it may reveal molecular mechanisms underlying the parasite biology. Here, the characterization of fructose-bisphosphate aldolase (FBA) and enolase proteoforms, potentially moonlighting, and also, the identification and characterization of proteoforms expressed in subcellular fractions of E. granulosus larval stage were performed. In relation to the glycolytic enzymes, several evidences indicate EgFBA1 and EgEno1 as moonlighting proteins: (i) their unusual locations in protoscolex tegument and in in vivo (hydatid fluid) and in vitro excretory/secretory (ES) products; (ii) their structural features, highlighting the F-actin binding site in the EgFBA1 structure; (iii) their ability to interact with several proteins non-related to glycolysis. In relation to the repertoire of proteins expressed in subcellular fractions, nuclear and cytosolic fractions from E. granulosus protoscoleces were analyzed by top down and bottom up proteomics for protein identification and characterization. Altogether, 525 proteins were identified, with 224 and 156 proteins exclusively detected in nuclear and cytoplasmic fractions, respectively. Besides protein identification, our top down approach also provided CTMs and PTMs characterization, highlighting N-terminal methionine excision and N-terminal acetylation as conserved modifications in E. granulosus proteins. Overall, our results provided the first experimental evidences of alternative functions performed by glycolytic enzymes in E. granulosus and suggested that multifunctional proteins might play important roles in hostparasite interplay. We also provided the description of nuclear and cytosolic proteomes which revealed new aspects of parasite biology, highlighting proteoforms with CTMs and PTMS which might be playing critical roles in regulating cellular processes occurring in this parasite species.

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.

O termo proteoformas refere-se a todas as formas moleculares na qual variantes proteicas codificadas por um único gene podem ser encontradas, incluindo mudanças devido a variação genética, splicing alternativo e modificações cotraducionais e póstraducionais (MCTs e MPTs, respectivamente). Em Echinococcus granulosus, o agente causador da hidatidose cística, a caracterização de proteoformas ainda não foi sistematicamente abordada e pode revelar mecanimos moleculares relevantes para o estabelecimento do parasito nos hospedeiros intermediários. A caracterização tanto de proteoformas da frutose-bifosfato-aldolase (FBA) e enolase, potencialmente moonlighting, como de outras proteoformas expressas em frações subcelulares do estágio larval deste parasito foi realizada. Em relação às enzimas glicolíticas, várias evidências indicam a EgFBA1 e a EgEno1 como sendo proteínas moonlighting: (i) as localizações não usuais destas proteínas no tegumento de protoescólices e em produtos de excreção/secreção (ES) in vivo (líquido hidático) e in vitro; (ii) características estruturais destas proteínas, com destaque para a identificação de um sítio de ligação à F-actina na estrutura da EgFBA1; (iii) a habilidade destas proteínas de interagirem com várias proteínas não relacionadas à glicólise. Em relação ao repertório de proteínas expressas em frações subcelulares, frações nucleares e citosólicas de protoescólices de E. granulosus foram analisadas através de proteômica top down e bottom up. De modo geral, 525 proteínas foram identificadas, sendo 224 e 156 proteínas exclusivamente detectadas em frações nucleares e citosólicas, respectivamente. Além da identificação de proteínas, nossa abordagem de proteômica top down também permitiu a caracterização de MCTs e MPTs, destacando a excisão da metionina N-terminal e a acetilação N-terminal como modificações conservadas nas proteínas de E. granulosus. Nossos resultados representam as primeiras evidências de funções alternativas realizadas por enzimas glicolíticas em E. granulosus e sugerem que proteínas multifuncionais devem desempenhar papéis importantes na interação parasitohospedeiro. Os proteomas nuclear e citosólico de protoescólices também foram descritos, revelando novos aspectos da biologia do parasito, incluindo proteoformas com MCTs e MPTs, as quais devem desempenhar papéis críticos na regulação de processos celulares deste parasito. / The term proteoforms refers to all molecular forms in which the protein product of a single gene can be found, including changes due to genetic variation, alternatively spliced RNA transcripts and co-translational and post-translational modifications (CTMs and PTMs, respectively). In Echinococcus granulosus, the causative agent of hydatid disease, the characterization of proteoforms has never been systematically addressed and it may reveal molecular mechanisms underlying the parasite biology. Here, the characterization of fructose-bisphosphate aldolase (FBA) and enolase proteoforms, potentially moonlighting, and also, the identification and characterization of proteoforms expressed in subcellular fractions of E. granulosus larval stage were performed. In relation to the glycolytic enzymes, several evidences indicate EgFBA1 and EgEno1 as moonlighting proteins: (i) their unusual locations in protoscolex tegument and in in vivo (hydatid fluid) and in vitro excretory/secretory (ES) products; (ii) their structural features, highlighting the F-actin binding site in the EgFBA1 structure; (iii) their ability to interact with several proteins non-related to glycolysis. In relation to the repertoire of proteins expressed in subcellular fractions, nuclear and cytosolic fractions from E. granulosus protoscoleces were analyzed by top down and bottom up proteomics for protein identification and characterization. Altogether, 525 proteins were identified, with 224 and 156 proteins exclusively detected in nuclear and cytoplasmic fractions, respectively. Besides protein identification, our top down approach also provided CTMs and PTMs characterization, highlighting N-terminal methionine excision and N-terminal acetylation as conserved modifications in E. granulosus proteins. Overall, our results provided the first experimental evidences of alternative functions performed by glycolytic enzymes in E. granulosus and suggested that multifunctional proteins might play important roles in hostparasite interplay. We also provided the description of nuclear and cytosolic proteomes which revealed new aspects of parasite biology, highlighting proteoforms with CTMs and PTMS which might be playing critical roles in regulating cellular processes occurring in this parasite species.

Os fatores que afetam a susceptibilidade a infecção com E. granulosus são pouco conhecidos. Neste trabalho, foi avaliada a interação de protoescólices e um antígeno imunodominante secretado (AgB) de E. granulosus com neutrófilos humanos saudáveis. A intensidade de expressão de CD11b e produção de H2O2 foram avaliadas por citometria de fluxo usando sangue total. Os neutrófilos isolados também foram incubados com protoescólices ou AgB, e a interleucina 8 (IL-8) foi determinada por ELISA de captura. Os protoescólices induziram um aumento significativo na expressão de CD11b em neutrófilos (p=0,026) e na produção de H2O2 (p=0,026), entretanto a sua viabilidade não foi afetada. Em contraste, nenhum efeito foi observado com o AgB em ambos ensaios. Uma moderada produção de IL-8 foi detectada somente em sobrenadantes de neutrófilos cultivados com protoescólices comparada com a produção basal (p=0,028). O efeito de uma incubação prévia com o AgB foi avaliada em relação a expressão de CD11 e H2O2 induzida pelo tratamento dos neutrófilos com forbol meristato acetato (PMA). Nenhuma mudança foi observada na expressão de CD11b, entretanto, a intensidade de produção de H2O2 foi significantemente reduzida em comparação ao tratamento apenas com PMA (p=0,038) quando o fator ativador de plaquetas (PAF) foi usado como priming. Como os protoescólices ocasionalmente podem ser liberados dos cistos em compartimentos do hospedeiro causando a hidatidose secundária, estes resultados contribuem para elucidação da defesa do hospedeiro e dos mecanismos imunomoduladores do parasito. A identificação de produtos de secreção e/ou excreção de protoescólices de E. granulosus também foi avaliada neste trabalho. Os produtos de secreção e/ou excreção foram obtidos a partir das primeiras 48 h de cultivo de protoescólices in vitro. A caracterização imunológica foi feita por western blotting com um pool de soros de indivíduos infectados com hidatidose cística. Os produtos de secreção e/ou excreção também foram analisados por espectrometria de massas. As preparações de seis diferentes amostras de protoescólices continham componentes protéicos, os quais foram visualizados por SDS-PAGE com aparentes massas moleculares entre 10 e 200 kDa. Os ensaios de western blotting mostraram a presença de diversos antígenos imunogênicos de massas moleculares maiores (acima de 50 kDa), e do AgB. Os resultados de espectrometria de massas foram obtidos com um pool de seis amostras de sobrenadantes de cultivo contendo produtos de secreção e/ou excreção, e foram identificadas onze proteínas: malato desidrogenase, ciclofilina, miofilina, P-29, 14-3-3, enolase, duas serinoproteases, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e tiorredoxina peroxidase. Estes resultados também podem contribuir para elucidação de novos aspectos da complexa interação parasito-hospedeiro, e de mecanismos imunomoduladores, uma vez que as proteínas secretadas podem estar diretamente envolvidas nesses processos. / The factors affecting innate susceptibility to infection with E. granulosus are little known. In this work, the interaction of healthy human neutrophils with protoscoleces and a secreted immunodominant antigen (AgB) of E. granulosus was assessed. The intensity of CD11b expression and H2O2 production were evaluated by flow cytometry using whole blood. Isolated neutrophils were incubated also with PSC or AgB and interleukin 8 (IL-8) was measured by capture ELISA. The protoscoleces induced a significant increment of CD11b expression in neutrophils (p=0.026) and of H2O2 production (p=0.026), however their viability was not affected. In contrast, no effect was observed with AgB in both assays. A moderate IL-8 production was detected only in supernatants from neutrophils cultured with protoscoleces compared with basal production (p=0.028). The effect of previous AgB incubation was evaluated in relation with CD11b and H2O2 expression induced by phorbol meristate acetate (PMA) treatment. No changes were observed with CD11 expression, however the magnitude of H2O2 production was significant decreased in comparison with PMA alone (p=0.038) when platelet–activating factor was used for priming. As protoscoleces occasionally spillaged from cysts into compartments of the host causing secondary cysts, these results contribute to the elucidation of the host defense and parasite immunomodulatory mechanisms involved. The identification of excretory and/or secretory products from E. granulosus protoscoleces also was assessed in this work. Excretory and/or secretory products were obtained from the first 48 h maintenance of protoscoleces in vitro. Immunological characterization was performed by western blotting with a pool of sera from individuals infected by cystic hydatidosis. Excretory and/or secretory products also were assessed by mass spectrometry. The preparations of six differents sample of protoscoleces contained components proteins which could be distinguished by SDS-PAGE with apparent molecular masses between 10 and 200 kDa. The assays of western blotting showed the presence of the several immunogenic antigens of major molecular masses (above 50 kDa), and of the AgB. The results of the mass espectrometry were obtained with a pool of six cultive sobrenadants sample containing excretory and/or secretory products, and were identified eleven proteins: malate dehydrogenase, cyclofilin, myophilin, P-29, 14-3-3, enolase, tegumental protein, two serineproteases, phosphoenolpyruvate carboxykinase and thioredoxin peroxidase. These results can contribute also for elucidate novel aspects of the complex interaction host-parasite and of the immunomodulatory mechanisms, since that secreted proteins can be directly involved in these process.

A presença de microssatélites no genoma de Echinococcus granulosus foi verificada utilizando-se oito oligonucleotídeos com repetições como sondas (GT15, CT15, AT15, CG15, CAT10, CAA10, CGG10 e CATA10). Experimentos de hibridização revelaram que as repetições GT, CAA, CATA e CT são as mais frequentes no genoma de E. granulosus. As sondas AT e GC não apresentaram sinais de hibridização. Seis lócus contendo repetições CA/GT, quatro lócus contendo repetições GA/CT e oito lócus contendo repetições AAC/GGT foram clonados e sequenciados. O lócus Egmsca1 foi analisado em 73 isolados do Brasil e da Argentina cujas linhagens haviam sido previamente caracterizadas e em 27 isolados provenientes da Etiópia cujas linhagens ainda não foram identificadas. Os isolados brasileiros da linhagem bovina e os isolados argentinos da linhagem do camelo apresentaram-se monomórficos e compartilharam o alelo (CA)7. Isolados argentinos das linhagens da ovelha e da ovelha da Tasmânia compartilharam dois alelos [(CA)8 e (CA)10] com os isolados brasileiros da linhagem da ovelha. O alelo (CA)11 foi encontrado somente em isolados brasileiros da linhagem da ovelha em uma baixa frequência. O alelo (CA)9 ocorreu apenas em um isolado da Etiópia. As populações brasileira e argentina da linhagem da ovelha foram testadas em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg e somente a primeira estava de acordo com as expectativas. Protoescólices isolados de um único cisto hidático não apresentaram polimorfismo, validando a utilização de protoescólices de um mesmo cisto, agrupados como um isolado, em estudos populacionais. Um microssatélite contendo repetições de pentanucleotídeos, contido no complexo gênico do snRNA U1, também foi isolado. Este estudo descreve pela primeira vez o isolamento e caracterização de microssatélites em E. granulosus.

A forma larval de Echinococcus granulosus (metacestóide) é o agente causador da hidatidose cística, zoonose endêmica no Rio Grande do Sul. Essa parasitose caracteriza-se pelo crescimento de uma massa cística preenchida de líquido hidático que causa compressão em órgãos e tecidos vizinhos. O antígeno B (AgB) é um dos maiores componentes do líquido hidático. Apesar da função do AgB ser mal conhecida, alguns indícios sugerem que ele está envolvido na interação parasito/hospedeiro. Sabe-se que os genes de contingência em microparasitas (protozoários e bactérias) são os responsáveis pela evasão da resposta imune do hospedeiro, e estão localizados, freqüentemente, na região sub-telomérica dos cromossomos. A localização sub-telomérica poderia estar relacionada com a alta variabilidade encontrada na família multigênica do AgB, uma vez que tais regiões costumam estar mais sujeitas à mutação. No presente trabalho procuramos verificar a proximidade dos genes de AgB dos telômeros através de experimentos de Southern blot utilizando a técnica de TRF (Telomere Restriction Fragment) onde o DNA genômico de E. granulosus e E. multilocularis foi clivado com seis diferentes enzimas de restrição e hibridizado com um inserto que possui o motivo telomérico C3TA2 (caracterizado para E. granulosus) e re-hibridizado com produtos de PCR dos genes AgB, ambos marcados com fluoresceína. Os nossos resultados permitiram a identificação de heterogeneidade no tamanho dos telômeros de E. granulosus. Ainda, utilizamos um PCR extra longo (XL-PCR) com primers específicos para os genes de AgB e um primer contendo o motivo telomérico de E. granulosus. Foram obtidos amplicons de aproximadamente 1600 pb para AgB2 , AgB3 e AgB4, e de 1300 e 3500 pb para AgB3. Não foram obtidos amplicons para AgB1. Com base nos dados obtidos neste trabalho, sugerimos que os genes AgB2, AgB3 e AgB4 estão localizados próximos a um motivo telomérico, mas ainda não podemos definir a precisa localização dos genes nos cromossomos. / The larval stage of Echinococcus granulosus (metacestode) causes the cystic hydatic disease, an endemic zoonosis from the state of Rio Grande do Sul. The disease is characterized by the growth of a cyst filled with liquid (hydatic fluid), leading to the compression of the neighbouring organs and tissues. Although the biological role of antigen B (AgB) is still uncertain, several clues show that it is involved in the parasite/host interaction. Contingency genes are known to be responsible for the evasion of host imune response in microparasites, and are frequently localized in chromosome sub-telomeric regions. A sub-telomeric localization could be related to the high variability found in the AgB multigene family, since these regions are usually more prone to mutations. In the present work we tried to verify the proximity of AgB genes to the telomeres with Southern blot experiments using the TRF (Telomeric Restriction Fragment) technique, where the genomic DNA from 35 E. granulosus and 5 E. multilocularis isolates were digested with 6 different restriction enzimes and hybridized with an insert containg the E. granulosus telomeric motif (C3TA2) and re-hybridized with PCR products derived from AgB genes, both labeled with fluorescein. Our results show heterogenity in the E. granulosus telomere size. Furthermore, we used an extra long PCR (XL-PCR) with specific primers for AgB genes and a primer containing the E. granulosus telomeric motif. We obtained amplicons with about 1600 bp for AgB2, AgB3 and AgB4, and with 1300 and 3500 bp for AgB3. No amplicons were obtained using AgB1 specific primers. Based on these data, we suggest that the E. granulosus AgB2, AgB3 and AgB4 genes are localized in the vincinity of telomeric motifs, but we are still unable to define the precise localization of the genes at chromosomes.

A presença de microssatélites no genoma de Echinococcus granulosus foi verificada utilizando-se oito oligonucleotídeos com repetições como sondas (GT15, CT15, AT15, CG15, CAT10, CAA10, CGG10 e CATA10). Experimentos de hibridização revelaram que as repetições GT, CAA, CATA e CT são as mais frequentes no genoma de E. granulosus. As sondas AT e GC não apresentaram sinais de hibridização. Seis lócus contendo repetições CA/GT, quatro lócus contendo repetições GA/CT e oito lócus contendo repetições AAC/GGT foram clonados e sequenciados. O lócus Egmsca1 foi analisado em 73 isolados do Brasil e da Argentina cujas linhagens haviam sido previamente caracterizadas e em 27 isolados provenientes da Etiópia cujas linhagens ainda não foram identificadas. Os isolados brasileiros da linhagem bovina e os isolados argentinos da linhagem do camelo apresentaram-se monomórficos e compartilharam o alelo (CA)7. Isolados argentinos das linhagens da ovelha e da ovelha da Tasmânia compartilharam dois alelos [(CA)8 e (CA)10] com os isolados brasileiros da linhagem da ovelha. O alelo (CA)11 foi encontrado somente em isolados brasileiros da linhagem da ovelha em uma baixa frequência. O alelo (CA)9 ocorreu apenas em um isolado da Etiópia. As populações brasileira e argentina da linhagem da ovelha foram testadas em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg e somente a primeira estava de acordo com as expectativas. Protoescólices isolados de um único cisto hidático não apresentaram polimorfismo, validando a utilização de protoescólices de um mesmo cisto, agrupados como um isolado, em estudos populacionais. Um microssatélite contendo repetições de pentanucleotídeos, contido no complexo gênico do snRNA U1, também foi isolado. Este estudo descreve pela primeira vez o isolamento e caracterização de microssatélites em E. granulosus.

Recentemente, uma quantidade significativa de dados de sequência (tanto genômicas como transcritômicas) para Echinococcus spp. foi publicado, facilitando a análise de genes expressos durante um estágio especifico ou envolvidos no desenvolvimento do parasito. Para realizar uma análise adequada de quantificação da expressão gênica, o uso de genes de referência validados é fortemente recomendado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar e validar genes de referência para permitir a normalização confiável da expressão gênica de determinados genes de interesse em Echinococcus granulosus sensu stricto (s.s.) (G1) e Echinococcus ortleppi durante o desenvolvimento inicial da forma pré-adulta do parasito. Protoescólices não tratados (PS) e protoescólices tratados com pepsina (PSP) do metacestódeo de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi foram usados para extração de RNA total e análise da expressão gênica. A estabilidade na expressão gênica de onze genes candidatos (TUB, NDUFV2, RPL13, TBP, CYP, RNApol sub2, EF-1α, βACT, GAPDH, ETIF4 e ERK) foi avaliada usando os programas geNorm, NormFinder e RefFinder. Nossos dados de RT-qPCR mostraram uma alta correlação com dados recentemente publicados de RNA-seq. Em relação à estabilidade na expressão, EF-1α e TBP foram os genes mais estáveis para ambas as espécies. Entretanto, βACT (gene comumente utilizado como normalizador), GAPDH e ETIF4 (previamente identificados como genes housekeeping) não tiveram um comportamento estável em nossas condições de ensaio. Desta maneira, propomos o uso de EF-1α como gene de referência para estúdios que envolvam análises de expressão gênica no inicio do desenvolvimento da forma pré-adulta de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi. Para demonstrar sua aplicabilidade, EF-1α foi usado como gene normalizador na quantificação relativa de transcritos para genes que codificam as proteínas ribossômicas L10, L14, e S15, e para as subunidades do antígeno B de E. granulosus. O mesmo gene de referência EF-1α poderia ser usado em estudos com outras espécies de Echinococcus sensu lato. Este é o primeiro relato que valida genes de referência adequados para a classe Cestoda, phyllum Platyhelminthes, portanto fornecendo uma base para futuras validações em espécies de cestódeos epidemiologicamente importantes, como aquelas do gênero Taenia.