Devido ao aumento da preocupação com o impacto dos agrotóxicos no meio ambiente e na saúde humana, busca-se uma agricultura sustentável. É no âmbito dessa questão que a resistência induzida torna-se uma ferramenta fundamental no manejo integrado de doenças e indispensável para uma nova agricultura, mais racional e sustentável. Dentre os diversos agentes bióticos e abióticos, utilizados em trabalhos de indução de resistência de plantas a patógenos, os cogumelos Lentinula edodes e Agaricus blazei vem sendo pesquisados. Desse modo, este trabalho teve como objetivos avaliar o efeito de diferentes isolados de L. edodes e A. blazei e do acibenzolar-S-metil (aSm) in vitro contra as bactérias e o controle de doenças de importância econômica para as culturas do tomate e da berinjela, em casa-de-vegetação. Depois de obtida a proteção, estudar os possíveis mecanismos bioquímicos ativados nas plantas através do uso dos extratos dos cogumelos e buscar a purificação parcial destes extratos, a fim de identificar o(s) princípio(s) ativo(s). No patossistema berinjela/Ralstonia, os extratos aquosos dos cogumelos não exerceram nenhum efeito direto sobre o patógeno, sendo que os isolados Abl-11 e Abl-28 de de A. blazei reduziram significativamente a ocorrência de folhas murchas das plantas em casa-devegetação, em relação aos demais tratamentos. Ocorreu um aumento na atividade da peroxidase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase nas folhas tratadas. O preciptado 60-80% obtido pela precipitação com sulfato de amônia e a fração 4 da cromatografia de troca aniônica (CTA) de Abl-28 reduziram a ocorrência de folhas murchas, sendo que a separação eletroforética revelou a presença de uma banda no gel com aproximadamente 29 kDa nesta fração. Em tomate, os extratos aquosos dos isolados dos cogumelos e o acibenzolar-S-metil não exerceram nenhum efeito inibitório in vitro no crescimento de Ralstonia solanacearum e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Porém, os isolados Abl-26 de A. blazei, Le-96/17 de L. edodes e aSm foram os que conferiram maior proteção das plantas de tomates contra os patógenos, diminuindo a ocorrência de folhas murchas, proporcionando um aumento na atividade da peroxidase no patossistema tomate/Ralstonia e um aumento na atividade de peroxidase, quitinase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase no patossistema tomate/Clavibacter. O preciptado 40-80% de Le-96/17 foi submetido à CTA, obtendo-se seis frações protéicas. As frações 3 e 4, junto com aSm e o extrato aquoso de Le-96/17 reduziram a ocorrência de folhas murchas. A separação eletroforética destas frações da CTA, do preciptado 40-80% e do extrato aquoso de Le-96/17 revelaram a presença de mais de uma banda no gel na fração 3 e 4 da CTA, no preciptado 40-80% e no extrato aquoso bruto de Le-96/17. Com base nos resultados, os cogumelos A. blazei e L. edodes apresentam compostos que induziram resistência em plantas berinjela e tomate, podendo auxiliar no controle de doenças. / Because the increase of the impact of chemical products in the environment and in human health, a search by sustainable agriculture is needed. It is in the scope of this problem that the induced resistance becomes a tool in the integrated management of pests and diseases and indispensable for a new agriculture, more rational and sustainable. Among the biotic and abiotic agents used to induce resistance, the mushrooms Lentinula edodes and Agaricus blazei have being studied. Thus, the objectives of the present work were evaluate the effects of different isolates of L. edodes and A. blazei and of the acibenzolar-S-methyl (aSm) on in vitro bacterial growth and the control of the diseases in tomato and eggplant under greenhouse conditions. The studies also tried to elucidate the mode of action of the extracts from the fruiting bodies and partially purify them. In eggplant plants, the aqueos extracts from the different mushroom isolates did not have any direct effect on the pathogen. The isolates Abl-11 and Abl-28 of A. blazei reduced the wilt in eggplant leaves, under greenhouse conditions, and increased peroxidase, phenylalanine ammonia-lyase and polyphenoloxidase activities in treated leaves. The fraction of aqueous extract of A. blazei (Abl-28) obtained with ammonium sulfhate and fraction 4 from anion exchange chromatography reduced bacterial wilt and a protein fraction exhibiting molecular mass around 29 kDa was obtained. In tomato plants, the aqueos extracts from the different mushrooms and the acibenzolar-S-methyl did not inhibit in vitro growth of Ralstonia solanacearum and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. However, the isolates Abl-26 of A. blazei, Le-96/17 of L. edodes and aSm protected tomato plants against the bacterial pathogens, reducing the wilt and causing an increase in peroxidase activity in the tomato/Ralstonia interaction and an increase in peroxidase, chitinase, phenylalanine ammonialyase and polyphenoloxidase activities in the tomato/Clavibacter interaction. The ammonium sulphate fraction of Le-96/17 was submitted to anion exchange chromatography, and the proteins from fractions 3 and 4, aSm and the aqueous extract of Le-96/17 reduced the occurrence of wilt in the leaves. A protein fraction exhibiting proteins with molecular mass around 29, 37 and 45 kDA was obtained in fractions 3 and 4. Thus, the results showed that the mushrooms A. blazei and L. edodes edodes have substances that induce resistance in eggplant and tomato plants.

Pollution of soil by trace metals has become one of the biggest global environmental challenges resulting from anthropogenic activities, therefore, restoration of metal contaminated sites needs due attention. The use of phytoremediation technologies as nature-based solution to pollution, could support successful implementation of green economic development strategies; with economically affordable and environmentally friendly benefits. The present investigation employed an exploratory study on the phytoremediation potentials of three selected native plants; Phytolacca dodecandra (L’Herit), Adhatoda schimperiana (Hochst) and Solanum incanum L, dominating areas close to heavy metal contamination sources; in metropolitan centers of Addis Ababa. In this work, concentration of six heavy metals of interest chromium (Cr), lead (Pb), cadmium (Cd), nickel (Ni) copper (Cu) and zinc (Zn) were examined in soil and in different tissues (leaves, stems and roots) of selected plants (both seedlings and mature plants), in dry and rainy seasons using atomic absorption spectrophotometer. Efficiency of phytoremediation is discussed based on calculated values of Bio-concentration Factor (BCF), Translocation Factors (TF) and Bioaccumulation Coefficient (BAC). Phytolacca dodecandra showed BCF, TF and BAC > 1 for Zn, Pb, Ni, Cu and Cd Adhatoda schimperiana gave BCF, TF and BAC > 1 for Zn, Cu, Ni and Cr; likewise, BCF, BAC and TF values of > 1 were noted in Solanum incanum for Zn, Cu, Pb and Ni. Based on these scenarios, the three plants could be utilized for phytoextraction of contaminated soil. Conversely, BCF and BAC for Cr levels in tissues of Phytolacca dodecandra were all < 1, which indicates unsuitability for phytoremediation of Cr in contaminated soils. Besides, Adhatoda schimperiana retained Pb and Cd in their roots showing root BCF > 1, while BAC and TF < 1, which highlights its suitability for phytostabilization. Moreover, BCF, TF and BAC values of < 1 noted for Cr and Cd in Solanum incanum reveal that Solanum incanum may not be a good candidate for remediation of Cr and Cd contaminated environments. In conclusion, results from this study revealed that the selected plants can accumulate substantial amounts of the above trace metals in their tissues and can serve as prospective phytoremediators of most of these metals. Phytoextraction and phytostabilization were the main mechanisms of remediation in this study. / Environmental Sciences / Ph. D. (Environmental Sciences)

[ES] El impacto del cambio climático en los cultivos hortícolas es cada vez más evidente, lo que ha llevado a la pérdida y erosión de diversidad genética de manera drástica. Esto plantea importantes desafíos para la mejora de los cultivos, que requiere la exploración de los recursos fitogenéticos conservados en los bancos de germoplasma y el desarrollo de tecnologías que permitan evaluar el valor fenotípico y genotípico de estos materiales. Sin embargo, la situación actual de las colecciones de germoplasma es la existencia de duplicados no identificados entre colecciones, errores en la clasificación taxonómica, documentación insuficiente y no disponible para investigadores y mejoradores, añadido a la falta de financiación para la conservación y gestión adecuadas. Esto dificulta enormemente la utilización de estos recursos. En la presente Tesis se aborda este problema comenzando por la unificación de datos de pasaporte, fenotipado e imágenes de las principales colecciones de tomate, pimiento y berenjena en un mismo repositorio en el primer capítulo. El segundo capítulo se centra en el desarrollo y optimización de un método de extracción de ADN genómico de alta calidad, rápido y económico que combina las ventajas del método de extracción basado en el CTAB, añadido a la purificación de los ácidos nucleicos en una matriz de sílice. Es un método universal que puede utilizarse para diferentes especies y tejidos. Se ha evaluado la eficiencia del ADN genómico resultante en diferentes plataformas de secuenciación como SPET (Single Primer Enrichment Technology) y Oxford Nanopore, generando resultados muy prometedores. Esto facilita el paso previo al genotipado de las colecciones que es la extracción de ADN. En el tercer capítulo se aborda el genotipado de las colecciones. El elevado número de accesiones de cada cultivo, en particular el tomate, supone un problema de tipo económico, en ocasiones irresoluble. Por ello, el tercer capítulo está orientado a la evaluación del potencial de la tecnología de secuenciación SPET, más económica que otras conocidas, para el genotipado de alto rendimiento de colecciones de germoplasma de tomate y berenjena. Los resultados revelan que el genotipado SPET es una tecnología robusta y de alto rendimiento para estudios genéticos, incluyendo la posibilidad de identificación de duplicados y errores de clasificación taxonómica en las entradas conservadas en los bancos. Con la información generada en los primeros tres capítulos se establecieron las colecciones nucleares para cada cultivo, abarcando la máxima diversidad genética y fenotípica en un conjunto de 450 individuos. Finalmente, en el cuarto capítulo, se analiza y describe la colección nuclear de tomate a nivel genético y fenotípico, mediante un enfoque basado en el establecimiento de grupos genéticos basados en su proximidad genética. El análisis de la diversidad genética y fenotípica reveló patrones de variación distintos entre diferentes grupos genéticos, contradiciendo afirmaciones anteriores que proponían una disminución en la diversidad genética como consecuencia de la mejora genética y descubriendo correlaciones entre rasgos morfológicos únicas dentro de los diferentes grupos. En resumen, esta tesis aumenta el conocimiento y accesibilidad a las colecciones de Solanaceae en bancos de germoplasma y proporciona herramientas moleculares. Destaca la importancia de estos bancos como reservorios de diversidad genética, aunque enfrenten desafíos como datos limitados y duplicados. Estos avances sientan las bases para la conservación y programas de mejora futuros. / [CA] L'impacte del canvi climàtic en els cultius hortícoles és cada vegada més evident, la qual cosa ha portat a la dràstica pèrdua i erosió de la diversitat genètica. La reduïda diversitat genètica planteja importants reptes per a la millora dels cultius. Sent necessari l'exploració dels recursos genètics vegetals conservats en els bancs de germoplasma i el desenvolupament de tecnologies que permeten avaluar el valor fenotípic i genotípic d'aquests materials. Pel que fa a les col·leccions de germoplasma presenten duplicats no identificats entre col·leccions, errors en la classificació taxonòmica, falta de finançament per a la conservació i gestió adequades a banda de documentació insuficient i no disponible (investigadors i milloradors vegetals). En la present tesi doctoral en el primer capítol s'aborda aquest problema unificant les dades de passaport, fenotipat i imatges de les principals col·leccions de tomaca, pebre i albergínia en un mateix repositori. El segon capítol es focalitza en el desenvolupament i optimització d'un mètode d'extracció de ADN genòmic d'alta qualitat, ràpid i econòmic que combina els avantatges del mètode d'extracció basat en el CTAB amb l'ús de matrius de sílice. El mètode desenvolupat pot utilitzar-se de manera universal per a diferents espècies i teixits vegetals. S'ha avaluat l'eficiència del ADN genòmic resultant en diferents plataformes de seqüenciació com SPET (Single Primer Enrichment Technology) i Oxford Nanopore, generant resultats molt prometedors. Això facilita el pas previ al genotipat de les col·leccions que és l'extracció d'ADN. En el tercer capítol aborda l'optimització del procés de genotipat de les col·leccions generades. L'elevat nombre d'accessions de cada cultiu, en particular la tomaca, suposa un problema de tipus econòmic, a vegades irresoluble. Per això, aquest capítol està orientat a l'avaluació del potencial de la tecnologia de seqüenciació SPET per al genotipat d'alt rendiment de col·leccions de germoplasma de tomaca i albergínia a un preu econòmic. Els resultats revelen que el genotipat SPET és una tecnologia robusta i d'alt rendiment per a estudis genètics, incloent-hi la possibilitat d'identificació de duplicats i errors de classificació taxonòmica en les entrades conservades en els bancs de germoplasma. La informació generada va permetre establir col·leccions nuclears per a cada cultiu, abastant la màxima diversitat genètica i fenotípica en un conjunt de 450 individus. Finalment, en el quart capítol, s'analitza i descrigué la col·lecció nuclear de tomaca a nivell genètic i fenotípic, focalitzant-se en l'establiment de grups genètics basats en la seua proximitat genètica. L'anàlisi de la diversitat genètica i fenotípica va revelar patrons de variació diferents entre diferents grups genètics, contradient afirmacions anteriors que proposaven una disminució en la diversitat genètica a conseqüència de la millora genètica. També és descobriren noves correlacions entre trets morfològics únics dins dels diferents grups. L'estudi destaca la importància d'abordar les iniciatives de millora de la tomaca tenint en compte tant la diversitat genètica com la fenotípica, amb especial èmfasi en aspectes com la grandària, la forma, el color i la qualitat del fruit. En definitiva, els treballs realitzats en aquesta tesi doctoral augmenten, d'una banda, el coneixement i l'accessibilitat a les principals col·leccions de solanàcies conservades en els bancs de germoplasma. Per un altre, generen eines moleculars que permeten l' avaluació genotípica de les col·leccions analizades. En resum, aquests avanços suposen una base per al futur, proporcionant informació valuosa per a la pròpia conservació de les col·leccions i el seu ús en programes de millora. / [EN] The impact of climate change on horticultural crops is increasingly evident, leading to drastic loss and erosion of genetic diversity. This poses significant challenges for crop improvement, which requires the exploration of plant genetic resources conserved in germplasm banks and the development of technologies. However, the current situation of germplasm collections is characterized by the existence of unidentified duplicates among collections, taxonomic mislabelling, insufficient and unavailable documentation for researchers and breeders, and a lack of funding for proper conservation and management. This greatly hampers the utilization of these resources. This thesis addresses this problem by starting with the unification of passport, phenotyping, and image data from the main collections of tomato, pepper, and eggplant. Genotyping these collections enables the creation of core collections, enhancing knowledge of genotypic and phenotypic variability for researchers and breeders. In the first chapter, an inventory of available passport and phenotypic data of tomato, pepper, and eggplant accessions conserved in major European and non-European germplasm banks were conducted to improve the efficiency of plant genetic resource management. The second chapter focuses on the development and optimization of a high-quality, fast, and cost-effective genomic DNA extraction method that combines the advantages of the CTAB-based extraction method with nucleic acid purification on a silica matrix. The efficiency of the resulting genomic DNA was evaluated on different sequencing platforms, such as Single Primer Enrichment Technology (SPET) and Oxford Nanopore, yielding promising results. This facilitates the prerequisite step of DNA extraction before genotyping the collections. Chapter three addresses the genotyping of the collections. The high number of accessions for each crop, particularly tomato, poses an often insurmountable economic problem. Therefore, chapter three is focused on evaluating the potential of SPET sequencing technology, which is more cost-effective than other known methods, for high-throughput genotyping of tomato and eggplant germplasm collections. The results reveal that SPET genotyping is a robust and high-performance technology for genetic studies, including the identification of duplicates and taxonomic misclassifications in the accessions stored in the germplasm banks. Based on the information generated in the first three chapters, core collections were established for each crop, encompassing maximum genetic and phenotypic diversity in a set of 450 individuals. Finally, in the fourth chapter, the genetic and phenotypic analysis of the tomato core collection is examined and described using an approach based on establishing genetic groups based on their genetic proximity. Genetic and phenotypic diversity analysis revealed distinct patterns of variation among different genetic groups, contradicting previous claims of a decrease in genetic diversity due to genetic improvement and uncovering unique correlations between morphological traits within different groups. The study highlights the importance of considering both genetic and phenotypic diversity in tomato breeding initiatives, with a particular emphasis on aspects such as fruit size, shape, color, and quality. In conclusion, this thesis enhances knowledge and accessibility to major Solanaceae collections in germplasm banks, while providing molecular tools for genotypic evaluation. It underscores germplasm banks' role as genetic diversity reservoirs, despite challenges such as data limitations and inaccuracies, emphasizing the importance of data standardization and maintenance. These advancements lay a foundation for conservation and breeding programs in the future. / This work was supported by grants CIPROM/2021/020 from Conselleria d’Innovació, Universitats, Ciència i Societat Digital (Generalitat Valenciana, Spain), PID2021-128148OB-I00 funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ and by “ERDF A way of making Europe”, PDC2022-133513-I00 funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033/, and by “European Union NextGenerationEU/PRTR”, by Grant Agreement No. 677379 (G2P-SOL project: Linking genetic resources, genomes and phenotypes of Solanaceous crops) from European Union’s Horizon 2020 Research and Innovation Programme, by the Grant Agreement No. 101094738 (PRO-GRACE project: Promoting a Plant Genetic Resource Community for Europe) from the European Union’s Horizon Europe programme, as well as by the initiative "Adapting Agriculture to Climate Change: Collecting, Protecting and Preparing Crop Wild Relatives", which is supported by the Government of Norway. This later project is managed by the Global Crop Diversity Trust with the Millennium Seed Bank of the Royal Botanic Gardens, Kew and implemented in partnership with national and international gene banks and plant breeding institutes around the world. For further information, see the project website: htp://www.cwrdiversity.org/. The overall work also partially fulfils some goals of the Agritech National Research Center and received funding from the European Union Next-Generation EU (PIANO NAZIONALE DI RIPRESA E RESILIENZA (PNRR)–MISSIONE 4 COMPONENTE 2, INVESTIMENTO 1.4—D.D. 1032 17/06/2022, CN00000022). David Alonso is grateful to Universitat Politècnica de València for a predoctoral (PAID-01-16) / Alonso Martín, D. (2023). Linking Genetic Resources, Genomes and Phenotypes of Solanaceus Crops [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201550

[ES] Los viroides, genomas mínimos de RNA circular no codificante, monocatenarios y muy estructurados, parasitan factores celulares de las plantas para replicarse autónomamente, establecer infecciones sistémicas y usualmente causar enfermedades. Los de la familia Avsunviroidae se replican y acumulan en cloroplastos por un mecanismo de círculo rodante simétrico. Una RNA polimerasa cloroplástica produce concatémeros lineales de polaridad complementaria que son reducidos a monómeros por las ribozimas de cabeza de martillo (HHR) del concatémero. Producen extremos 5'-hidroxilo y 2',3'-fosfodiéster cíclico, que la isoforma cloroplástica de la tRNA ligasa convierte en enlaces 5',3'-fosfodiéster intramoleculares, generando viroides circulares de polaridad complementaria que pueden entrar en otra ronda de transcripción, simétrica a ésta. En esta Tesis se han analizado las secuencias y estructuras viroidales esenciales para su circularización, usando como modelo el viroide latente de berenjena (ELVd), que induce infecciones asintomáticas en berenjena. Expresamos en Escherichia coli precursores del ELVd(+) lineales flanqueados por dos copias de su HHR. Su procesamiento genera monómeros con los extremos adecuados para la ligación por la tRNA ligasa de la berenjena, que es coexpresada. Mutaciones puntuales y deleciones en el sitio nativo de ligación sugieren que solo el dominio HHR es esencial para la circularización. La conservación de la secuencia y estructura de la HHR con las del sustrato natural del enzima (los tRNAs) nos hacen proponer que la HHR del ELVd secuestra la ligasa mimetizando las características generales del bucle anticodón de los tRNAs. Este sistema de expresión permite también producir RNAs recombinantes, insertándolos en una posición particular del RNA del ELVd. Las quimeras son procesadas por las HHRs flanqueantes y sus extremos ligados por la tRNA ligasa. El andamiaje viroidal circular, compacto y posiblemente asociado a la ligasa, permite aumentar la vida media del RNA de interés y su acumulación en la bacteria. En esta Tesis adaptamos el sistema para producir RNAs de doble cadena (dsRNAs) que desencadenen interferencia por RNA (RNAi), un mecanismo de defensa y regulación génica eucariota basado en la complementariedad de bases entre RNAs. dsRNAs complementarios a genes endógenos reducen los niveles de sus transcritos y generan fenotipos de pérdida de función. Los insectos pueden tomar dsRNAs del ambiente, internalizarlos en sus células y distribuirlos sistémicamente, haciendo al RNAi una estrategia prometedora para el control de plagas. Para producir dsRNAs, separamos las repeticiones invertidas del gen diana que genera la horquilla con el cDNA de un intrón autocatalítico del grupo I de Tetrahymena thermophila, aumentando la estabilidad de los plásmidos de expresión. El intrón es eliminado tras la transcripción, resultando en una molécula viroidal de la que protruye el dsRNA de interés. Flanquear las repeticiones invertidas con una copia adicional permutada del intrón permite separar el ELVd del producto final, un dsRNA circular cerrado en ambos lados por pequeños bucles. Ambas moléculas poseen actividad reguladora: las quimeras viroide-dsRNA con homología al gen de la unión septada suave 1 del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica virgifera virgifera) exhiben actividad insecticida oral contra las larvas similar a la de horquillas sintetizadas in vitro, y los dsRNAs circulares sin andamiaje viroidal homólogos al gen de la ATPasa vacuolar (subunidad A) y la proteína ribosomal S13 silencian eficientemente estos genes en adultos de la mosca del Mediterráneo (Ceratitis capitata); este caso es de especial relevancia al ser la primera demostración del RNAi para el control de esta plaga. En conclusión, a pesar de su limitada relevancia agrícola, el ELVd es útil para investigar la biología molecular de la familia Avsunviroidae y una poderosa herramienta biotecnológica en combinación con el sistema de expresión en E. coli. / [CA] Els viroides, genomes mínims d'RNA circular no codificant, monocatenaris i molt estructurats, parasiten factors cel·lulars de les plantes per a replicar-se autònomament, establir infeccions sistèmiques i usualment causar malalties. Els de la família Avsunviroidae es repliquen i acumulen en cloroplasts per un mecanisme de cercle rodant simètric. Una RNA polimerasa cloroplàstica produeix concatèmers lineals de polaritat complementària que són reduïts a monòmers per els ribozims de cap de martell (HHR) del concatèmer. Produeixen extrems 5'-hidroxil i 2',3'-fosfodièster cíclic, que la isoforma cloroplàstica de la tRNA lligasa converteix en enllaços 5',3'-fosfodièster intramoleculars, generant viroides circulars de polaritat complementària que poden entrar en una nova ronda de transcripció, simètrica a la primera. En aquesta Tesi s'han analitzat les seqüències i estructures viroidals essencials per a la seua circularització, emprant com a model el viroide latent d'albergínia (ELVd), que indueix infeccions asimptomàtiques en albergínia. Expressem en Escherichia coli precursors de l'ELVd(+) lineals flanquejats per dos còpies del seu HHR. El seu processament produeix monòmers amb els extrems apropiats per a la lligació mediada per la tRNA ligasa de l'albergínia, que és coexpressada. Mutacions puntuals i delecions en el lloc nadiu de lligació suggereixen que només el domini HHR és essencial per a la circularització. La conservació de la seqüència i estructura del HHR amb les del substrat natural de l'enzim (els tRNAs) ens fan proposar que el HHR de l'ELVd segresta la lligasa mimetitzant les característiques generals del bucle anticodó dels tRNAs. Aquest sistema d'expressió també permet produir RNAs recombinants, inserint-los en una posició particular de l'RNA de l'ELVd. Les quimeres són processades pels HHR flanquejants i els seus extrems lligats per la tRNA lligasa. L'RNA viroïdal circular, compacte i possiblement associat a la lligasa, permet augmentar la vida mitjana de l'RNA d'interés i la seua acumulació en els bacteris. En aquesta Tesi adaptem el sistema per a produir RNAs de doble cadena (dsRNAs) que desencadenen interferència per RNA (RNAi), un mecanisme de defensa i regulació gènica eucariota basat en la complementarietat de bases entre RNAs. dsRNAs complementaris a gens endògens redueixen els nivells dels seus transcrits i generen fenotips de pèrdua de funció. Els insectes poden prendre dsRNAs de l'ambient, internalitzar-los en les seues cèl·lules i distribuir-los sistèmicament, fent a l'RNAi una estratègia prometedora en el control de plagues. Per a produir dsRNAs, separem les repeticions invertides del gen diana que genera la forqueta amb el cDNA d'un intró autocatalític del grup I de Tetrahymena thermophila, augmentant l'estabilitat dels plasmidis d'expressió. L'intró és eliminat després de la transcripció, resultant en una molècula viroïdal de la qual protrueix el dsRNA d'interés. Flanquejar les repeticions invertides amb una còpia addicional permutada de l'intró permet separar l'ELVd del producte final, un dsRNA circular tancat als dos costats per xicotets bucles. Els dos tipus de molècules posseeixen activitat reguladora: les quimeres viroide-dsRNA amb homologia al gen de la unió septada suau 1 del cuc de l'arrel de la dacsa (Diabrotica virgifera virgifera) exhibeixen activitat insecticida oral contra les larves similar a la de forquetes sintetitzades in vitro, i els dsRNAs circulars sense l'RNA viroïdal homòlegs al gen de la ATPasa vacuolar (subunitat A) i la proteïna ribosomal S13 silencien eficientment aquests gens en adults de la mosca del Mediterrani (Ceratitis capitata); aquest cas és d'especial rellevància perquè és la primera demostració de l'RNAi per al control d'aquesta plaga. En conclusió, malgrat la seua limitada rellevància agrícola l'ELVd és útil per a investigar la biologia molecular de la família Avsunviroidae i una poderosa ferramenta biotecnològica en combinació amb el sistema d'expressió en E. coli. / [EN] Viroids, minimal genomes of non-coding circular RNA, single-stranded and highly structured, parasitize plant cellular factors to replicate autonomously, establish systemic infections, and typically cause disease. Those of the family Avsunviroidae replicate and accumulate in chloroplasts by a symmetrical rolling circle mechanism. A chloroplast RNA polymerase produces linear concatemers of complementary polarity that are reduced to monomers by the hammerhead ribozymes (HHR) of the concatemer. They produce 5'-hydroxyl and 2',3'-cyclic phosphodiester ends, which the chloroplastic isoform of tRNA ligase converts to intramolecular 5',3'-phosphodiester bonds, generating circular viroids of complementary polarity that can enter another round of transcription, symmetric to the first one. In this Thesis, the viroid sequences and structures essential for its circularization have been analyzed, using as a model the eggplant latent viroid (ELVd), which induces asymptomatic infections in eggplant. We expressed in Escherichia coli linear ELVd(+) precursors flanked by two copies of its HHR. Its processing generates monomers with suitable ends for ligation by the eggplant tRNA ligase, which is co-expressed. Point mutations and deletions at the wild-type ligation site suggest that only the HHR domain is essential for circularization. The conservation of the sequence and structure of the HHR with those of the natural substrate of the enzyme (the tRNAs) lead us to propose that the HHR of the ELVd hijacks the ligase, mimicking the general characteristics of the anticodon loop of the tRNAs. This expression system also allows the production of recombinant RNAs, inserting them into a particular position of the ELVd RNA. Chimeras are processed by flanking HHRs and their ends ligated by the tRNA ligase. The compact, circular viroidal scaffold, possibly associated with the ligase, allows increasing the half-life of the RNA of interest and its accumulation in the bacteria. In this Thesis we adapt the system to produce double-stranded RNAs (dsRNAs) that trigger RNA interference (RNAi), a eukaryotic gene regulation and defense mechanism based on base complementarity between RNAs. dsRNAs complementary to endogenous genes reduce the levels of their transcripts and generate loss-of-function phenotypes. Insects can take dsRNAs from the environment, internalize them into cells, and distribute them systemically, making RNAi a promising pest control strategy. To produce dsRNAs, we separated the inverted repeats of the target gene that generates the hairpin with the cDNA of a group-I autocatalytic intron from Tetrahymena thermophila, increasing the stability of the expression plasmids. The intron is removed after transcription, resulting in a viroidal molecule from which the dsRNA of interest protrudes. Flanking the inverted repeats with an additional copy of the intron in a permuted form allows the ELVd molecule to be separated from the final product, a circular dsRNA molecule capped on both sides by small loops. Both molecules have regulatory activity: the viroid-dsRNA chimeras with homology to the smooth septate junction 1 gene of the corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) exhibit oral insecticidal activity against larvae similar to that of in vitro synthesized hairpins, and the circular dsRNAs without the viroid scaffold homologous to the vacuolar ATPase (subunit A) and ribosomal protein S13 genes efficiently silence those genes in adult Medfly (Ceratitis capitata); this case is of special relevance as it is the first demonstration of RNAi for the control of this pest. In conclusion, despite its limited agricultural relevance, the ELVd is useful for investigating the molecular biology of the Avsunviroidae family and a powerful biotechnological tool in combination with the E. coli expression system. / This work was supported by the Ministerio de Ciencia e Innovación (Spain; co-financed by the European Regional Development Fund) [BIO2017-83184-R] and [BIO2017‐ 91865‐EXP]; Universitat Politècnica de València [PAID-01-17]. We acknowledge support of the publication fee by the CSIC Open Access Publication Support Initiative through its Unit of Information Resources for Research (URICI). / Ortolá Navarro, B. (2023). Heterologous expression of circular RNAs in Escherichia coli for analyzing the ligation process of chloroplastic viroids and producing double-stranded RNAs with insecticidal activity [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/192635