Syssphinx molina (Cramer) é considerada uma espécie de interesse fitossanitário, pois pode ser praga de algumas plantas cultivadas pelo homem, além disso, em lavouras de monoculturas podem ocorrer acidentes com as larvas dessa espécie, causando dermatites nos trabalhadores. O principal objetivo desse estudo é obter e caracterizar as células embrionárias indiferenciadas de Syssphinx molina. Ovos da espécie serão obtidos através de mariposas fêmeas grávidas, coletadas pela equipe da Coleção Zoológica do Maranhão (CZMA), da Universidade Estadual do Maranhão (UEMA), Campus Caxias. Os ovos foram caracterizados e comparados com ovos de outras espécies filogeneticamente próximas à S. molina. Culturas primárias de células embrionárias de S. molina foram cultivadas por 20 dias, ocorreram duas passagens e procedeu-se com o congelamento. Após descongelamento das células ocorreram 10 passagens. Foram analisadas amostras de células de cada passagem para obter dados do ciclo célular e características das células através de uso de marcadores: Anti-Axons, Anti-Caspase 3 ativa, Anti-CD105, Anti-CD117, Anti-CD24, Anti-CD43, Anti-CD73, Anti-CD90/Thy1, Anti-Ciclina D1, Anti GM 130, Anti-HLA DR, Anti-HSP47, Anti-HSP70,. Anti-KI67, Anti-MCP1, Anti- Oct 3/4, Anti-p53, Anti RAB 5, Anti-SSEA4, Anti-Stro-1, Anti-TGF beta 1, Anti-Vimentina e Schneider L2. Pela primeira vez é determinado um protocolo para resfriamento de ovos de S. molina, assim como protocolo para cultura primária e secundária de células embrionárias dessa espécie. São analisadas também as idades gestacionais dos ovos de S. molina e comparadas com ovos de outras espécies de mariposas da mesma subfamília. A análise de ciclo celular e marcadores confirmam a alta taxa de proliferação das células, no entanto, a análise com os anticorpos Anti-Caspase 3 ativa e Anti-P53 mostrou o percentual de morte celular programada (apoptose) é, geralmente, maior que 25% nas populações de células analisadas. Os marcadores Anti GM130 e Anti RAB 5, que participam, respectivamente, do recrutamento de proteínas pela fase cis do aparelho de Golgi e do processo de maturação do endossoma, marcaram mais de 50% das células das amostras analisadas. Anti-HLA-DR, que revela proteínas da membrana do linfócito T, com um percentual geralmente superior a 30% de marcação. Dentre os marcadores de células multi e pluripotentes, aquele que marcou maior taxa de células foi Anti- CD117, que se liga em células estaminais hematopoiéticas. Todos os anticorpos utilizados para marcar células do sistema hematopoiético (Anti-CD24, Anti-CD43, Anti-CD73, Anti-CD90/Thy1, Anti-HLA DR e Anti-MCP1) foram expressos nas células cultivadas de S. molina. Portanto, entende-se que os insetos, a exemplo de S. molina, são um grupo que possuem atividades metabólicas complexas e o entendimento dessas atividades permitirá, no futuro, delinear novas formas de controle biológico. Além disso, os dados inéditos sobre o sistema hematopoiético dos insetos apresentado nesse trabalho, além constitui um subsídio fundamental para estabelecer futuros modelos importantes para estudos de estratégias de controle biológico, como também poderá auxiliar no desenvolvimento de técnicas para combater doenças transmitidas por insetos. / Syssphinx molina (Cramer) is considered a species of phytosanitary interest, it can be curse of some plants cultivated by man, in addition, in monoculture plantations, accidents may occur with the larvae of this species, causing dermatitis in workers. The main objective of this study is to obtain and characterize the undifferentiated embryonic cells of Syssphinx molina. Eggs of the species will be obtained through pregnant female moths, collected by the team of the Coleção Zoológica do Maranhão (CZMA), Universidade Estadual do Maranhão (UEMA), Campus Caxias-MA. The eggs were characterized and compared with eggs of other phylogenetically close species of S. molina. Primary cultures of S. molina embryonic cells were cultured for 20 days, Two passes occurred and proceeded with freezing. After thawing of the cells, there were 10 passes. Cell samples from each passage were analyzed to obtain cell cycle data and cell characteristics through the use of markers: Anti-Axons, Anti-Caspase 3 ativa, Anti-CD105, Anti-CD117, Anti-CD24, Anti-CD43, Anti-CD73, Anti-CD90/Thy1, Anti-Ciclina D1, Anti GM 130, Anti-HLA DR, Anti-HSP47, Anti-HSP70,. Anti-KI67, Anti-MCP1, Anti- Oct 3/4, Anti-p53, Anti RAB 5, Anti-SSEA4, Anti-Stro-1, Anti-TGF beta 1, Anti-Vimentina e Schneider L2. For the first time a protocol for cooling eggs of S. molina is determined, as well as protocol for primary and secondary culture of embryonic cells of this species. The gestational age of S. molina eggs and compared to eggs of other species of moths of the same subfamily. Cell cycle analysis and markers confirm the high rate of cell proliferation, however, analysis with the active Anti-Caspase 3 and Anti-P53 antibodies showed the percentage of programmed cell death (apoptosis) is generally greater than 25 % in the analyzed cell populations. Markers Anti GM130 and anti RAB 5, which participate respectively, recruitment of proteins by cis phase of the Golgi apparatus and endosome maturation process, scored more than 50% of the cells in the samples analyzed. Anti-HLA-DR, which reveals T lymphocyte membrane proteins, with a percentage generally greater than 30% labeling. Among the multi- and pluripotent cell markers, the one that scored the highest cell rate was Anti-CD117, which binds to hematopoietic stem cells. All antibodies used to label cells from the hematopoietic system (Anti-CD24, Anti-CD43, Anti-CD73, Anti-CD90 / Thy1, Anti-HLA DR and Anti-MCP1) were expressed in the cultured cells of S. molina. Therefore, it is understood that insects, like S. molina, are a group that has complex metabolic activities and the understanding of these activities will, in the future, outline new forms of biological control. In addition, the unpublished data on the hamatopoietic system of insects presented in this work, beyond is a key benefit to establish future important models for studies of biological control strategies, but may also assist in the development of techniques to combat diseases transmitted by insects.

Relógios biológicos são marcapassos endógenos presentes tanto em eucariotos quanto em procariotos. Relógios diferentes possuem períodos distintos, e aqueles que se aproximam de 24h de oscilação são chamados circadianos. Em mamíferos, o primeiro relógio circadiano identificado situa-se no núcleo supraquiasmático, localizado no hipotálamo. O funcionamento do relógio circadiano envolve mecanismos de retroalimentação positiva e negativa, em geral tendo início com a ativação dos genes Per e Cry por CLOCK e BMAL1. Atualmente sabe-se que os relógios estão presentes em áreas do cérebro fora do núcleo supraquiasmático e em muitos tecidos periféricos. Em Drosophila e Danio rerio, os osciladores periféricos podem ser sincronizados diretamente por luz, enquanto em mamíferos o reinício de fase dos mesmos parece ser controlado por sinais regulados pelo marcapasso do núcleo supraquiasmático. Uma nova opsina, denominada melanopsina, foi recentemente descoberta na retina de todos os vertebrados estudados, em uma subpopulação de células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis. Ela é responsável pela captura de luz e envio dessa informação para o núcleo supraquiasmático. A endotelina (ET) é um peptídeo vasoconstritor composto por 21 resíduos de aminoácidos. Existem três isoformas endógenas de ETs, designadas ET-1, ET-2 e ET-3. Três tipos de receptores para endotelinas já foram clonados, sendo eles designados ETA, ETB e ETC. Todos pertencem à família dos receptores acoplados à proteína G. Órgãos, tecidos e células de Danio rerio constituem um excelente modelo para o estudo dos genes de relógio e de ritmos in vitro. Em células embrionárias ZEM 2S deste teleósteo, constatamos a presença de melanopsina, do receptor ETA para endotelina, e dos seis genes Cry através de PCR. A presença de melanopsina também foi confirmada por imunocitoquímica. Foram realizadas curvas de crescimento em células ZEM 2S previamente mantidas por cinco dias em regime de 14C:10E (luz acesa às 9:00h). No 6º. dia, as células foram transferidas para as seguintes condições: escuro constante; 14C:10E; 10C:14E e luz constante. Houve inibição da proliferação celular por luz. O padrão de expressão temporal dos genes Per1, Cry1b, Clock e da melanopsina foi estudado, assim como sua modulação por ET-1. Células ZEM 2S foram mantidas em fotoperíodo 12C:12E (luz acesa às 9:00h) durante cinco dias, após o que foram tratadas com ET-1 nas concentrações 10-11M, 10-10M, 10-9M e 10-8M, durante 24h. O RNA extraído a cada 3h foi submetido a RT-PCR para posterior análise por PCR quantitativo. RNA ribossômico 18S foi utilizado como normalizador do experimento. Melanopsina não apresentou ritmicidade de expressão em fotoperíodo 12C:12E. ET-1 exerceu efeito bifásico, aumentando a expressão nas menores concentrações de hormônio utilizadas e diminuindo nas maiores. Na concentração 10-10M, ET-1 aparentemente estabeleceu uma oscilação ao longo das 24 horas, com crescente expressão na fase de escuro, atingindo um pico em ZT21 e decrescente durante o período de luz, com o mínimo em ZTs 6 e 9. A expressão do gene Clock é rítmica em regime fotoperíodo 12C:12E, com valores significativamente maiores em ZT12 a ZT21 do que em ZT0, ZT3 e ZT9, indicando um aumento de expressão coincidente com o período de escuro. Foi observado um pico de expressão em ZT6, durante a fase de luz. ET-1 nas concentrações de 10-11 e 10-10M aboliu o ritmo de expressão de Clock, e inibiu o pico de expressão em ZT6. Expressão de Clock permaneceu elevada somente em ZT18. Nas maiores concentrações (10-9M e 10-8M), a inibição ocorreu em todos os ZTs, abolindo completamente o ritmo e atenuando qualquer variação previamente observada entre os ZTs. A expressão do gene Per1 é rítmica em regime fotoperíodo 12C:12E, com valores significativamente maiores nos ZTs 21, 0, 3, 6 e 9 do que nos ZTs 12, 15 e 18, indicando um aumento de expressão na fase de claro. Vale mencionar que já em ZT21, há um aumento significativo antecipatório da fase de luz. Nas concentrações de 10-11 e 10-10M, ET-1 não alterou o período ou a amplitude desse ritmo. A ação evidente de ET-1 foi a inibição da expressão de Per1 na fase de luz (ZT0, ZT3, ZT6 e ZT9), e também em ZT21 (fase de escuro) nas maiores concentrações (10-9M e 10-8M) não afetando o período da oscilação, mas diminuindo marcadamente sua amplitude. A expressão de Cry1b foi rítmica durante o ciclo claro:escuro, com aumento na fase de claro e diminuição na fase de escuro. Novamente a ET-1 apresentou um efeito bifásico sobre a expressão deste gene, aumentando a mesma durante a fase de luz na concentração de 10-11M, e em ZT6 e ZT9 na concentração 10-10M. No entanto, não alterou o período ou a amplitude do ritmo. Por outro lado, durante toda a fase de luz houve inibição deste gene na presença de ET-1 10-9 e 10-8M, diminuindo a amplitude observada nas células controle. / Biological clocks are endogenous timekeepers that are present both in eukaryotic as in prokaryotic organisms. Different clocks have different periods, and those that have about 24h of oscillation are called circadian clocks. In mammals, the first identified circadian clock is located in the suprachiasmatic nucleus, in the hipothalamus. It is now well known that clocks are present in brain regions other than the suprachiasmatic nucleus and in many peripheral tissues. In Drosophila and Danio rerio, peripheral oscillators can be synchronized directly by light, while in mammals the reset of the phase seems to be controlled by signals regulated by the suprachiasmatic timekeepers. The maintenance of the circadian clock is governed by positive and negative feedback loops, in general starting with the activation of Per and Cry genes by CLOCK and BMAL1. A new opsin called melanopsin, was recently discovered in the retina of all studied vertebrates, in a subset of intrinsically photosensitive ganglion cells. This photopigment is responsible for capturing light and sending this information to the suprachiasmatic nucleus. Endothelin (ET) is a 21-amino acid residue vasoconstrictor peptide. There are three endogenous isoforms of ETs, ET1, ET2 and ET3. Three subtypes of endothelin receptors have already been cloned: ETA, ETB and ETC, all members of the family of G protein -coupled receptors. Organs, tissues and cells of Danio rerio constitute an excellent model for the study of clock genes and rhythms in vitro. In ZEM 2S embryonic cells of this teleost, we demonstrated the presence of melanopsin, the endothelin receptor ETA, and the six Cry genes by PCR. The presence of melanopsin was also confirmed by immunohistochemistry. ZEM 2S cells previously kept for five days in 14L:10D (lights on 9:00am) were transferred in the sixth day to the following conditions: constant darkness, 14L:10D, 10L:14D and constant light, and growth curves were determined. ZEM 2S showed inhibition of proliferation by light. The temporal expression pattern of the genes Per1, Cry1b, Clock and of melanopsin and their modulation by ET-1 were studied. ZEM 2S cells were kept in 12D:12L photoperiod (lights on 9:00am) for five days, and then treated with 10-11M, 10-10M, 10-9M and 10-8M ET-1, for 24h. RNA extracted every 3 hours was submitted to RT-PCR for subsequent analysis by Real Time-PCR. 18S ribosomal RNA was used to normalize the results. Melanopsin did not show rhythmicity of expression in 12D:12L photoperiod. ET-1 exhibited a biphasic effect, increasing the expression in the lower concentrations, and reducing at the higher concentrations. At 10-10M, ET-1 apparently established an oscillation along the 24h-period, with increasing expression in the dark phase, reaching a peak at ZT2, and decreasing during the light phase, with the minimum at ZT6 and 9. The expression of Clock gene was rhythmic in 12D:12L photoperiod, with significant higher values in ZT12 to ZT21 than ZT0, ZT3 e ZT9, indicating an increase of expression coincident with the dark period. A peak of expression was observed at ZT6, during the light phase. At 10-11 and 10-10M, ET-1 abolished the rhythm of expression of Clock, and inhibited the peak of expression at ZT6. Expression of Clock remained high only at ZT18. At the higher concentrations (10-9M e 10-8M), the inhibition occurred at all ZTs, completely abolishing the rhythm and attenuating any variation previously observed among ZTs. The expression of Per1 gene was rhythmic in 12D:12L photoperiod, with significant higher values at ZTs 21, 0, 3, 6 and 9 than at ZTs 12, 15 and 18, indicating an increase of expression in the light phase. It is important to mention that at ZT21 there was already a significant increase, anticipatory of the light phase. At 10-11 e 10-10M, ET-1 did not alter neither the period nor the amplitude of this rhythm. The evident action of ET-1 was the inhibition of Per1 expression in the light phase (ZT0, ZT3, ZT6 e ZT9), and also at ZT21 (dark phase), at the higher concentrations (10-9M e 10-8M), with no change in the oscillation period, but markedly reducing its amplitude. The expression of Cry1b was rhythimic during the light:dark cycle, with increase in the light phase and reduction in the dark phase. Again, ET-1 showed a biphasic effect on this gene expression, increasing it during the light phase at the concentration of 10-11M, and at ZT6 and 9 at 10-10M. However, the hormone did not affect either the period or the amplitude of the rhythm. On the other hand, along the light phase, there was inhibition of Cry1b in the presence of ET-1 10-9 and 10-8M, reducing the amplitude observed in the control cells.

Células-tronco embrionárias (CTE) são importantes para estudos de desenvolvimento embrionário, diferenciação e manipulação genética. Além disso, essas células podem ser utilizadas na terapia celular e organogênese in vitro. Na pesquisa sobre terapia celular a partir de CTE oriundas de embriões humanos, considerações éticas, morais e religiosas têm sido feitas por pesquisadores e leigos. Portanto, um modelo animal como o suíno (Sus scrofa) será bastante válido por transpor tais barreiras, visto que o suíno possui parâmetros fisiológicos semelhantes aos humanos. Apesar do alto potencial biomédico das CTE, existem dificuldades na manutenção da pluripotência in vitro dessas células em suínos. Portanto, estudos que visam elucidar os mecanismos de manutenção da pluripotência de CTE in vitro são necessários para viabilizar o cultivo dessas células. Os objetivos do presente estudo foram (1) isolar células-tronco embrionárias suínas a partir de blastocistos produzidos in vitro e in vivo; (2) comparar dois sistemas de cultivo in vitro das massas celulares internas (MCI) isoladas, MEF ou Matrigel e (3) identificar e comparar a expressão dos fatores de transcrição Nanog, Sox2 e FoxD3 em CTE e blastocistos suínos produzidos in vitro e in vivo. Assim, blastocistos suínos foram produzidos in vitro a partir da maturação e fecundação in vitro de oócitos de ovários obtidos em matadouro. Os embriões foram cultivados in vitro por 7 dias, até atingirem o estágio de blastocisto. Blastocistos suínos também foram produzidos in vivo, através de superovulação seguida de inseminação artificial de marrãs com 150 dias de idade. Para a colheita dos embriões, foi realizada lavagem dos cornos uterinos post-mortem cinco dias após a ovulação. Tanto blastocistos produzidos in vitro quanto os produzidos in vivo foram submetidos à imunocirurgia para isolamento da MCI. Brevemente, a zona pelúcida foi digerida com solução de pronase e os embriões incubados com soro de coelho anti-suíno para remoção das células do trofoectoderma e soro complemento de cobaia. A MCI resultante foi cultivada em meio para células-tronco (GMEM acrescido de 15% SFB, 0,1 mM ß-mercaptoetanol, 1% aminoácidos não essenciais e 4 ng/mL de bFGF) sobre monocamada de fibroblastos fetais murinos (MEF) inativados por radiação ou sobre Matrigel. Não foi observada diferença entre os dois sistemas de cultivo in vitro (MEF e Matrigel) na adesão das MCI isoladas. Também não foi verificada diferença entre os grupos de blastocistos, produzidos in vitro e in vitro, nas taxas de adesão das MCI cultivadas. Contudo, nenhuma colônia de CTE suínas foi obtida. A análise da expressão gênica em blastocistos produzidos in vitro e in vitro demonstrou que os genes Nanog e Sox2 são menos expressos em blastocistos produzidos in vitro. Contudo, a expressão do gene FoxD3, demonstrada pela primeira vez em suínos no presente trabalho, se mostrou semelhante entre os dois grupos de embriões. Visto que nenhuma linhagem de CTE legítima foi isolada em suínos até o momento, sugere-se que esta espécie possua requerimentos diferentes dos já conhecidos para as espécies murina e humana. Portanto, novos estudos são necessários para o estabelecimento de protocolos mais efetivos para o isolamento de CTE de suínos. / Embryonic stem cells (ESC) represent a useful tool to study embryonic development, cell differentiation and genetic manipulation. Moreover, these cells can be applied in cell-based therapies and in vitro organogenesis. The research conducted with human ESC has generated many ethical, moral and religious considerations by scientists and laymen alike. Therefore, an animal model like the pig (Sus scrofa) is valuable by overcoming such hurdles, since this species holds physiologic parameters similar to humans. In spite of the high biomedical potential of ESC, many difficulties have been faced to maintain these cells in a pluripotent state in vitro. For this reason, studies to elucidate the mechanisms of in vitro maintenance of undifferentiated ESC are needed to improve the culture of these cells. The objectives of this study were (1) to isolate ESC from in vitro and in vitro produced swine blastocysts, (2) to compare two in vitro culture conditions to maintain isolated inner cell masses (ICM), MEF or Matrigel and (3) to identify and to compare the expression of the pluripotency markers Nanog, Sox2 and FoxD3 at ESC and in vitro and in vitro produced swine blastocysts. In this manner, swine blastocysts were obtained by in vitro maturation and fertilization of oocytes from ovaries collected in abattoirs. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. In addition, in vitro produced blastocysts were obtained by superovulation followed by artificial insemination of gilts (150 days of age). Embryos were collected by post-mortem uterus flushing five days after ovulation. in vitro and in vitroproduced blastocysts were submitted to immunosurgery to isolate the ICM. Briefly, zona pellucida was digested with pronase solution and embryos were incubated with anti-swine rabbit serum to remove trophoectoderm cells and with guinea-pig complement serum. The resultant ICM was cultured in stem cells media (GMEM added by 15% SFB, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, 1% non essential amino acids and 4 ng/mL of bFGF) over monolayer of irradiated murine fetal fibroblasts (MEF) or Matrigel. No difference was observed between the in vitro culture conditions (MEF and Matrigel) on isolated ICM adhesion. In addition, no difference was verified between in vitro and in vitro produced blastocysts on adhesion of cultured ICM. However, no swine ESC was obtained. Gene expression analysis of in vitro and in vitro produced blastocysts showed that Nanog and Sox2 are less expressed in in vitro produced blastocysts. However, the expression of FoxD3, demonstrated in this study for the first time, was similar between groups. Since no ESC lineage was obtained in swine until now, we believe this species have different requirements compared to murine and human. Therefore, more studies are necessary to establish protocols to isolate porcine ESC.

O estabelecimento de cultivo de células-tronco embrionárias (ESC) ainda não foi realizado com sucesso. Verificação de marcadores de pluripotência e diferenciação nos três folhetos germinativos são necessárias para validação de uma linhagem celular pluripotente. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar o cultivo de ESC suínas usando Matrigel e comparar a expressão dos marcadores de pluripotência Oct-4, CD9 e α6-integrina em embriões. Blastocistos in vitro ou in vivo foram submetidos à imunocirurgia para cultura da massa celular interna, fixados para imunocitoquímica ou extração de RNA total para RT-PCR. Nenhuma colônia de ESC foi obtida usando co-cultivo em fibroblastos embrionários murinos (MEF) ou em Matrigel. Expressão de Oct-4, CD9 e α6-integrina foi detectada por PCR. Os produtos de PCR de CD9 e α6-integrina tiveram suas sequências nucleotídicas determinadas e comparadas com bases de dados públicas. O produto de CD9 foi idêntico à seqüência do CD9 suíno e o produto de α66integrina foi similar à humana e eqüina. Reação de Imunocitoquímica revelou a presença de Oct-4 no citoplasma de células da massa celular interna e do trofoblasto. CD9 e α6-integrina foram observados preferencialmente em células do trofoblasto. Não foi possível comparar a expressão dos marcadores de pluripotência entre ESC e embriões em suínos. Porém, este estudo descreve pela primeira vez a expressão de CD9 e α6-integrina em blastocistos suínos, os quais podem não estar relacionados com células pluripotentes embrionárias suínas. / Establishment of embryonic stem cell (ESC) culture in pigs has not been achieved. Verification of pluripotency markers and differentiation in the three embryonic layers are necessary for validation of a pluripotent cell line. The objective of this study was to establish and characterize porcine ESC culture using Matrigel and compare the expression of pluripotency markers Oct-4, CD9 and α6-integrin with embryos. In vitro or in vivo porcine blastocysts were submitted to immunosurgery for culture of inner cell mass, fixation for immunocytochemistry or total RNA extraction for RT-PCR. No ESC colonies were obtained using co-culture on mouse embryonic fibroblasts (MEF) or on Matrigel. Expression of Oct-4, CD9 and α6-integrin was detected by PCR. CD9 and α6-integrin PCR products had their nucleotide sequence assessed and compared with public nucleotide database. CD9 product was identical to CD9 porcine sequences and α6-integrin product was similar to human and equine α6-integrin. Immunocytochemistry revealed Oct-4 expression in cytoplasm of the inner cell mass and trophoblast cells. CD9 and α6-integrin were observed preferentially on trophoblast cells. It was not possible to compare expression of pluripotency markers between porcine ESC and embryos. However, this study describes for the first time expression of CD9 and α6-integrin in porcine blastocysts, which may not be related to pluripotent porcine embryonic cells.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Claudia Barbosa Fernandes / Banca: Flávia Karina Dlella / Resumo: Células tronco embrionárias (CTE) são caracterizadas pelas capacidades de auto-renovação e diferenciação. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam estes dois processos são mal compreendidos. CTE de camundongos foram originalmente isoladas a partir da massa celular interna (MCI) de blastocistos produzidos in vitro e in vivo e mantidas em cultura sem perda da pluripotência, originando tecidos das três camadas germinativas. Há profundo interesse em conhecer os processos envolvidos na proliferação e diferenciação das células embrionárias contribuindo, no futuro, para engenharia de tecidos e clonagem terapêutica. Objetivos: Comparar o potencial gerador de CTE de embriões bovinos produzidos in vitro em meio contendo alta e baixa concentração de soro, assim como avaliar a manutenção da pluripotência das células em cultivo através da ação de dois fatores, a LIF e o bFGF, utilizados isoladamente ou em conjunto, no cultivo in vitro de CTEbov. Foram utilizados blastocistos bovinos com 9 dias de desenvolvimento in vitro para remoção da massa celular interna (MCI) e posterior cultivo das mesmas em placas tratadas com monocamada de fibroblastos bloqueados. As colônias celulares semelhantes a células-tronco foram analisadas através da identificação da expressão in sito dos fatores de indiferenciação Oct-4, Nanog, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1- 60, TRA-1-81. Os blastocistos bovinos com 9 dias de idade também foram submetidos à marcação imunocitoquímica. Adicionalmente foi avaliado o potencial de diferenciação in vitro das CTEbov para linhagens celulares de origem endodermal, mesodermal e ectodermal. Em média, 525 embriões de cada um dos dois grupos (2,5% e 10% de soro fetal bovino, respectivamente) foram selecionados para o isolamento da MCI. Foram utilizados 300 blastocistos iniciais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Embryonic stem cells (ESC) are characterized by their capacity for selfrenewal and differentiation. However, the molecular mechanisms which regulate these two processes are poorly understood. ESC of mice were originally isolated from the inner cell mass (ICM) of blastocysts in vitro and in vivo and maintained in culture without loss of pluripotency, yielding three germ layers of tissue. There is keen interest in learning about the processes involved in proliferation and differentiation of embryonic cells contribute in the future, tissue engineering and therapeutic cloning. To compare the potential generator ESC of bovine embryos produced in vitro in medium containing high and low concentrations of serum, as well as evaluating the maintenance of pluripotency of the cells in culture through the action of two factors, the LIF and bFGF, used singly or together, in vitro cultivation of ESCbov. We used bovine blastocysts to nine days of in vitro development to remove the inner cell mass (ICM) and further cultivation of the same plates treated with fibroblast monolayer blocked. The cell colonies similar to stem cells were analyzed by in situ identification of the expression of differentiation factors Oct-4, Nanog, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 . The bovine blastocysts with 9 days of age were also subjected to immunocytochemical labeling. Additionally it was evaluated the potential of differentiation in vitro of cell lines to ESCbov endodermal origin, mesodermal and ectodermal. The average 525 embryos from each of the two groups (2.5% and 10% fetal bovine serum, respectively) were selected for isolation of the ICM. Early blastocysts were used 300, 160 expanded blastocysts and 45 hatched blastocysts per group. However, only expanded blastocysts adhered to the monolayer of fibroblasts and developed into colonies similar to... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Flávia Lombardi Lopes / Coorientadora: Claudia Maria Bertran Membrive / Banca:Calie Castilho Silvestre / Banca:Guilherme de Paula Nogueira / Resumo: A suplementação com compostos ricos em ácido linoleico, dentre os quais inclui-se a semente de girassol, promove aumento na taxa de concepção em fêmeas bovinas. Hipotetizou-se que a suplementação com semente de girassol em doadoras de oócitos aumenta o número e a qualidade de oócitos, incrementa as taxas de clivagem e determina um aumento no número e qualidade dos blastocistos produzidos in vitro. Assim, objetivou-se investigar o efeito de tal suplementação, no número e qualidade de oócitos cultivados in vitro, na taxa de clivagem e no número e qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Para tanto, cinco vacas e vinte e cinco novilhas (n=30) Nelore foram divididas em dois grupos para receberem um dos seguintes tratamentos: 1,7 kg/dia de suplemento contendo 53% de farelo de soja com 44% de PB e 47% de milho (Grupo Controle - Grupo C; n= 15) ou 1,7 kg/dia de suplemento contendo 40% de farelo de soja com 44% de proteína bruta (PB) e 60% de semente de girassol (Grupo Girassol - Grupo G; n= 15), durante 57 dias. As fêmeas foram submetidas à aspiração folicular nos dias D0, D13, D29, D43, D56 e D77 (D0= início da suplementação; D56= término da suplementação). Os oócitos foram submetidos ao processo de produção de embriões in vitro. Os dados foram analisados pelo programa Mixed procedure (SAS) versão 9.2, pelo teste ANOVA modelo misto. Não se observou diferença entre os Grupos C e G no número de folículos visualizados (16,85 ± 1,32 vs. 16,12 ± 1,48); número... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Supplementation with compounds rich in linoleic acid, among which is included sunflower seed, promotes increase in conception rates in cows. It was hypothesized that sunflower seed supplementation in oocyte donors increases the number and quality of oocytes, increases the cleavage rates and determines an increase in the number and quality of blastocysts produced in vitro. Therefore the objective was to investigate the effect of such supplementation, in the number and quality of oocytes cultured in vitro on cleavage rate and in the number and quality of in vitro produced blastocysts. Therefore, cows five and twenty-five heifers (n = 30) Nellore were divided into two groups to receive one of the following treatments: 1.7 kg / day supplement containing 53% soybean meal 44% and 47% PB corn (Control Group - Group C, n = 15) or 1.7 kg / containing 40% add-on of soybean meal with 44% crude protein (CP) and 60% sunflower seed (Sunflower group - Group C; n = 15) for 57 days. Females underwent follicular aspiration on days D0, D13, D29, D43, D56 and D77 (D0 = start of supplementation; D56 = end of supplementation). The oocytes were subjected to in vitro embryo production process. Data were analyzed by the Mixed procedure (SAS) version 9.2, by ANOVA mixed model. There was no difference between Groups C and G on the number of displayed follicles (16.85 ± 1.32 vs. 16.12 ± 1.48); number of aspired oocytes (13.80 ± 1.27 vs. 13.05 ± 1.25); recovery rate (82 ± 1% vs. 80 ±... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-12-04T12:19:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CocultivoEmbrioesBovinos.pdf: 1514173 bytes, checksum: 3a720fb9e7e5105e7d7ca80b17a04e2d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-12-04T12:56:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CocultivoEmbrioesBovinos.pdf: 1514173 bytes, checksum: 3a720fb9e7e5105e7d7ca80b17a04e2d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-04T12:56:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CocultivoEmbrioesBovinos.pdf: 1514173 bytes, checksum: 3a720fb9e7e5105e7d7ca80b17a04e2d (MD5) Previous issue date: 2014 / A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotecnologia utilizada para aumentar o potencial reprodutivo de animais geneticamente superiores, os embriões produzidos in vitro são de qualidade inferior aos produzidos in vivo, por isso técnicas tentam melhorar os índices de embriões produzidos in vitro. Uma técnica é o sistema de co-cultivo com células somáticas que removem metabólitos tóxicos e protegem contra o stress oxidativo. As células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (CTA) são células multipotentes que segregam fatores de crescimento e citocinas. As células-tronco foram utilizadas em co-cultivo in vitro de embriões bovinos em diferentes concentrações com o objetivo de melhorar o protocolo de PIVE. CTAs foram submetidas à diferenciação em três linhagens mesenquimais, e foi realizada a imunofenotipagem de marcadores específicos de membrana das CTMs. A taxa de clivagem foi avaliada no segundo dia após a fertilização e taxa de blastocistos no sétimo dia, quando foram armazenados para contagem do número total de células e expressão gênica. Os resultados foram analisados por ANOVA, Teste-t e pós-teste de Fisher, adotando um nível de significância de 5%. O tratamento do co-cultivo com CTAs influenciou significativamente a formação de blastocisto, o número total de células de embriões e a expressão gênica correlacionada a pluripotência e metabolismo de carboidratos. Estes resultados mostraram aumento da taxa de produção e qualidade dos embriões produzidos in vitro em co-cultivo com CTAs em relação ao co-cultivo com células da granulosa. Os resultados deste trabalho indicam também que a presença constante de CTAs em co-cultivo é superior ao condicionamento com CTAs. Os efeitos verificados das CTAs podem ocorrer através de fatores solúveis ou via exossomos secretados pelas CTAs. Estudos futuros são necessários para esclarecer a possível via causadora dos efeitos positivos verificados neste trabalho pelas CTAs em co-cultivo. / The in vitro embryo production (IVP) is a biotechnology used to increase the reproductive potential of genetically superior animals, embryos produced in vitro are inferior in quality when compared in vivo. Techniques trying improve the rates of in vitro produced embryos. One technique is the co-culture system using somatic cells that remove toxic metabolites and protect against oxidative stress. Mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (CTA) are multipotent cells that secrete growth factors and cytokines. The stem cells were used in in vitro co-culture of bovine embryos at different concentrations in order to improve the protocol PIVE. CTAs underwent differentiation into three mesenchymal lineages, and was performed immunophenotyping of specific membrane markers of MSCs. The cleavage rate was assessed on the second day after fertilization and blastocyst rate on the seventh day when they were stored for counting the total number of cells and gene expression. The results were analyzed by ANOVA, T-test and post-test of Fisher, adopting a significance level of 5%. Treatment of co-cultivation with CTAs significantly influenced the formation of the blastocyst, the total number of cells in embryos and correlated gene expression pluripotency and carbohydrate metabolism. These results showed increased production rate and quality of embryos produced in vitro co-culture with CTAs compared to co-culture with granulosa cells. These results also indicate that the constant presence of CTAs in co-culture is superior to conditioning with CTAs. Checked the effects of CTAs can occur through soluble factors or via exosomes secreted by CTAs. Future studies are needed to clarify the possible cause for positive effects observed in this work by the CTAs in co-cultivation.

Introdução. A fertilização in vitro (FIV) é uma opção de tratamento para pacientes inférteis com endometriose (EDT), e a escolha dos embriões a serem transferidos é um passo fundamental para o sucesso do processo. A endometriose é capaz de interferir em todas as etapas do processo de FIV, a qual pode estar associada à foliculogênese anormal, a defeitos de implantação e à qualidade oocitária inferior, bem como a alterações na receptividade endometrial. Em estágios mais severos da doença, pode-se observar um importante substrato anatômico associado. O Escore de Graduação Embrionário (GES) é uma classificação baseada numa combinação da morfologia pronuclear, clivagem precoce e morfologia no terceiro dia após a fertilização que permite avaliar quais embriões terão maiores chances de implantação/gestação. Ainda não há, na literatura, relatos de comparação do GES com pacientes portadoras de endometriose. Objetivo. Determinar o escore de graduação embrionário médio entre as pacientes inférteis com endometriose submetidas à fertilização in vitro e comparar com pacientes inférteis sem endometriose. Métodos. Foram comparados, através de uma coorte prospectiva, 706 embriões (162 pacientes), sendo 472 embriões pertencentes às pacientes do grupo controle sem endometriose (n=109; infertilidade tubária ou por fator masculino) e 234 embriões de pacientes com endometriose (n=53). Todas as pacientes foram submetidas à fertilização in vitro, utilizando o protocolo de indução da ovulação com antagonista do GnRH. Todos os embriões foram transferidos no dia 3 após fertilização. O escore de graduação embrionário (GES) foi realizado através de avaliação de todos os embriões por 3 vezes, nos tempos: 16 – 18 horas, 25 – 27 horas e 64 – 67 horas, sempre pelo mesmo embriologista. Para pontuação do GES, avaliaram-se: citoplasma, morfologia pronuclear, fragmentação, alinhamento nucleolar, posição do corpo polar, número de blastômeros/morfologia e simetria. Consideramos escore médio a soma dos escores embrionários dividida pelo número de embriões obtidos; e o escore embrionário médio transferido como a soma dos GES dividido pelo número de embriões transferidos. Foi considerado estatisticamente significativo quando P < 0,05 utilizando-se os testes t Student e qui-quadrado. Resultados. Os grupos foram comparados quanto à idade, índice de massa corporal, perfil obstétrico (infertilidade primária, secundária, paridade, abortamentos) e perfil hormonal, não sendo encontrada diferença estatisticamente significativa. Apesar de o número de embriões transferidos ser maior em pacientes com endometriose quando comparadas ao grupo controle (2,38 ± 0,66 versus 2,15 ± 0,54, respectivamente; P=0,001), não se observou diferença no escore de graduação embrionário médio entre os grupos de estudo e controle (71 ± 19,8 versus 71,9 ± 23,5, respectivamente; P=0,881). Quanto às taxas de fertilização, houve semelhança entre os grupos, correspondendo a 61% nas pacientes com endometriose e 59% naquelas do grupo controle (P=0,511). Também não houve diferença estatisticamente significativa quando os grupos foram comparados quanto às taxas de implantação (21% versus 22%, respectivamente; P=0,989) e gestação (26,4% versus 28,4%, respectivamente; P=0,989). Para estes parâmetros de avaliação, os diferentes graus de severidade da endometriose não interferiram significativamente nos resultados. Conclusão. A presença de endometriose não impactou significativamente na qualidade embrionária. Da mesma forma, não foram observadas diferenças nos desfechos reprodutivos avaliados entre pacientes inférteis com e sem endometriose. / Objective. To determine embryo quality (Mean Graduated Embryo Score, MGES) in infertile patients with endometriosis submitted to in vitro fertilization (IVF-ET). Design. Prospective cohort. Setting. Private Human Reproduction Center. Patients. We compared 706 embryos (162 patients) divided in two groups: 472 embryos derived from patients without endometriosis (n=109, infertile patients with tubal or male infertility) and 234 embryos from patients in study group (n=53, infertile patients with endometriosis). Interventions. All patients were submitted to IVF using an estradiol-antagonist-recombinant FSH protocol for ovarian stimulation. MGES was performed evaluating all embryos three times: 16 – 18 hours, 25 – 27 hours and 64 – 67 hours, by the same embryologist. Embryo evaluation was performed according to the following parameters: fragmentation, nucleolar alignment, polar body apposition, blastomere number/morphology and symmetry. Main Outcome Measures. MGES scores, fertilization, implantation and pregnancy rates. Results. Groups were compared for age, body mass index (BMI), past ob/gyn characteristics (primary or secondary infertility, parity, abortions) and hormonal profile. Although the number of embryos transferred was greater in patients with endometriosis than in the control group (2.38 ± 0.66 versus 2.15 ± 0.54, respectively; P = 0.001), the MGES was similar in both groups (71 ± 19.8 versus 71.9 ± 23.5, respectively; P = 0.881). Likewise, fertilization rate was similar in groups, 61% in patients with endometriosis and 59% in control group (P=0,511). Moreover, no significant differences were found in implantation rates (21% versus 22%, respectively [P=0,989]) and in pregnancy rates (26,4% versus 28,4%, respectively [P=0,989]). The severity of endometriosis did not influence the results. Conclusions. Embryo quality measured by MGES was not influenced by endometriosis. Likewise, the reproductive outcomes evaluated were similar between infertile patients with and without endometriosis.

Introdução: A taxa da prevalência da infertilidade em casais com idade reprodutiva atinge 8-10%. A fim de tentar contornar esse problema, esses casais optam pela reprodução assistida. Em muitos dos casos, os resultados das técnicas de reprodução assistida (TRA) são bem sucedidos ao realizarem a fertilização in vitro (FIV), em outros não são satisfatórios ou ocorrem gestações múltiplas que aumenta o risco de morbidade a essas gestantes. Diante deste quadro, estudam-se formas de aperfeiçoar as TRA no que se refere à seleção do embrião. O hormônio anti-Mülleriano (AMH) já desempenha este papel ao refletir a reserva ovariana na rotina das clínicas de FIV. Os antígenos leucocitários humanos-G solúveis (sHLA-G) vêm sendo investigado no seu papel em refletir a qualidade embrionária. A existência da associação entre as concentrações de HLA-G mensuradas em fluido folicular e a qualidade embrionária avaliada pelo critério de pontuação Graduated Embryo Score (GES) poderia caracterizar o sHLA-G como um possível biomarcador de qualidade embrionária. Objetivos: Investigar a associação entre as concentrações do sHLA-G no fluido folicular (FF) e a pontuação dos embriões gerados avaliados pelo critério GES em ciclos de mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Métodos: Um estudo transversal foi realizado. Avaliaram-se setenta e três mulheres com idade ≤ 39 anos, submetidas à FIV pelas seguintes causas: fator tubário, fator masculino e/ou endometriose, com ambos os ovários e níveis hormonais de TSH, FSH e PRL dentro dos valores de referência. Não foram elegíveis ao estudo mulheres com síndrome de hiperestimulação ovariana no ciclo avaliado, com doença auto-imune, com síndrome dos ovários policísticos, com luteinização precoce e/ou endometrioma. Realizou-se a mensuração de sHLA-G por ELISA no FF de um pool de folículos puncionados das mulheres submetidas à indução de ovulação para a FIV. Os embriões obtidos após fertilização foram classificados segundo o critério GES. As outras variáveis necessárias foram transcritas dos prontuários das pacientes participantes no estudo. Resultados: A associação entre as concentrações de sHLA-G e o escore médio dos embriões gerados não foi observada. Observou-se uma sensibilidade aumentada do teste ELISA, quando comprada aos estudos da literatura, com detecção em mais de 98% das amostras analisadas. Foi encontrada uma associação significativa entre o AMH e a idade (r=-0,38; p=0,003), entre AMH e total de oócitos ( r=0,53; p<0,05) e idade e total de oócitos (r= -0,31, p=0,009). A mensuração de sHLA-G em mulheres com endometriose e sem endometriose (fator tubário e masculino) não mostrou diferença significativa (p=0,57). Conclusão: Não houve associação entre a qualidade embrionária e dosagens de sHLA-G. Diante destes resultados, ainda está controverso o uso de sHLA-G mensurado em FF como marcador prognóstico de qualidade de embrião embrionária avaliada pelo critério GES. Os resultados encontrados referentes ao AMH corroboram com a literatura. / Background: The prevalence of infertility rate in the couples in reproductive age reaches 8-10%. In order to solve this problem, these couples opt for assisted reproduction. In many cases, the results of assisted reproduction techniques (ART) are successful in performing the in vitro fertilization (IVF), while in others they are not satisfactory or occur multiple pregnancy that increase morbidity risk to these pregnant women. In this context, several studies attempt new forms for to improve the ART in the selection the embryo. The anti-Müllerian hormone (AMH) already plays this role to reflect the ovarian reserve in IVF clinics routine. Soluble human leukocyte antigen-G (sHLA-G) has been investigated its role to reflect the embryo quality. The existence of the association between the sHLA-G concentrations measured in follicular fluid and embryo quality based on Graduated Embryo Score (GES) criteria could characterize the sHLA-G as a possible biomarker of embryo quality. Objectives: Our study investigated the association between the sHLA-G concentrations in follicular fluid (FF) and the score of embryo evaluated by Graduated Embryo Score (GES) criteria in women cycles treated by in vitro fertilization (IVF). Methods: A cross-sectional study was conducted. Evaluated a total of seventy-three women aged ≤ 39 years, undergoing IVF because of tubal factor, male factor and / or endometriosis, with both ovaries and hormone levels of TSH, FSH and PRL within the range of reference. It was not eligible to study women with ovarian hyperstimulation syndrome in the evaluated cycle, autoimmune disease, polycystic ovary syndrome, with early luteinization and / or endometrioma. In this study was measured the sHLA-G by ELISA in FF from a pool of follicles punctured of women undergoing ovulation induction for IVF. The embryos after fertilization were classified by GES criteria. The other study variables were transcribed from medical records of patients. Results: The association between concentrations of sHLA-G and the average score of the generated embryos was not observed. Sensitivity of the ELISA was observed with detection by more than 98% of the samples. Significant association was found between AMH and age (r = -0.38; p = 0.003), between AMH and total oocytes (r = 0.53; p <0.05) and age and total oocytes (r = -0.31, p = 0.009). The results of sHLA-G in women with endometriosis and without endometriosis (tubal and male factor) showed no significant difference (p = 0.57). Conclusion: There was no association between embryo quality and the dosages of sHLA-G. Considering these results, the use of sHLA-G measured in FF as a prognostic marker of quality embryo based on GES criteria is still controversial. The results for the AMH corroborate with the literature.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-13Bitstream added on 2014-06-13T20:29:35Z : No. of bitstreams: 1 guastali_md_me_botib.pdf: 527945 bytes, checksum: 8c4f9ed48c450ce2b601751b6f0633db (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Células tronco embrionárias (CTE) são caracterizadas pelas capacidades de auto-renovação e diferenciação. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam estes dois processos são mal compreendidos. CTE de camundongos foram originalmente isoladas a partir da massa celular interna (MCI) de blastocistos produzidos in vitro e in vivo e mantidas em cultura sem perda da pluripotência, originando tecidos das três camadas germinativas. Há profundo interesse em conhecer os processos envolvidos na proliferação e diferenciação das células embrionárias contribuindo, no futuro, para engenharia de tecidos e clonagem terapêutica. Objetivos: Comparar o potencial gerador de CTE de embriões bovinos produzidos in vitro em meio contendo alta e baixa concentração de soro, assim como avaliar a manutenção da pluripotência das células em cultivo através da ação de dois fatores, a LIF e o bFGF, utilizados isoladamente ou em conjunto, no cultivo in vitro de CTEbov. Foram utilizados blastocistos bovinos com 9 dias de desenvolvimento in vitro para remoção da massa celular interna (MCI) e posterior cultivo das mesmas em placas tratadas com monocamada de fibroblastos bloqueados. As colônias celulares semelhantes a células-tronco foram analisadas através da identificação da expressão in sito dos fatores de indiferenciação Oct-4, Nanog, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1- 60, TRA-1-81. Os blastocistos bovinos com 9 dias de idade também foram submetidos à marcação imunocitoquímica. Adicionalmente foi avaliado o potencial de diferenciação in vitro das CTEbov para linhagens celulares de origem endodermal, mesodermal e ectodermal. Em média, 525 embriões de cada um dos dois grupos (2,5% e 10% de soro fetal bovino, respectivamente) foram selecionados para o isolamento da MCI. Foram utilizados 300 blastocistos iniciais... / Embryonic stem cells (ESC) are characterized by their capacity for selfrenewal and differentiation. However, the molecular mechanisms which regulate these two processes are poorly understood. ESC of mice were originally isolated from the inner cell mass (ICM) of blastocysts in vitro and in vivo and maintained in culture without loss of pluripotency, yielding three germ layers of tissue. There is keen interest in learning about the processes involved in proliferation and differentiation of embryonic cells contribute in the future, tissue engineering and therapeutic cloning. To compare the potential generator ESC of bovine embryos produced in vitro in medium containing high and low concentrations of serum, as well as evaluating the maintenance of pluripotency of the cells in culture through the action of two factors, the LIF and bFGF, used singly or together, in vitro cultivation of ESCbov. We used bovine blastocysts to nine days of in vitro development to remove the inner cell mass (ICM) and further cultivation of the same plates treated with fibroblast monolayer blocked. The cell colonies similar to stem cells were analyzed by in situ identification of the expression of differentiation factors Oct-4, Nanog, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 . The bovine blastocysts with 9 days of age were also subjected to immunocytochemical labeling. Additionally it was evaluated the potential of differentiation in vitro of cell lines to ESCbov endodermal origin, mesodermal and ectodermal. The average 525 embryos from each of the two groups (2.5% and 10% fetal bovine serum, respectively) were selected for isolation of the ICM. Early blastocysts were used 300, 160 expanded blastocysts and 45 hatched blastocysts per group. However, only expanded blastocysts adhered to the monolayer of fibroblasts and developed into colonies similar to... (Complete abstract click electronic access below)