Mammalian embryonic development is subject to complex biological relationships that need to be understood. However, before the whole structure of development can be put together, the individual building blocks must first be understood in more detail. One of these building blocks is the second cell fate decision and describes the differentiation of cells of the inner cell mass of the embryo into epiblast and primitive endoderm cells. These cells then spatially segregate and form the subsequent bases for the embryo and yolk sac, respectively. In organoids of the inner cell mass, these two types of progenitor cells are also observed to form, and to some extent to spatially separate. This work has been devoted to these phenomena over the past three years. Plenty of studies already provide some insights into the basic mechanics of this cell differentiation, such that the first signs of epiblast and primitive endoderm differentiation, are the expression levels of transcription factors NANOG and GATA6. Here, cells with low expression of GATA6 and high expression of NANOG adopt the epiblast fate. If the expressions are reversed, a primitive endoderm cell is formed. Regarding the spatial segregation of the two cell types, it is not yet clear what mechanism leads to this. A common hypothesis suggests the differential adhesion of cell as the cause for the spatial rearrangement of cells. In this thesis however, the possibility of a global cell-cell communication is investigated. The approach chosen to study these phenomena follows the motto "mathematics is biology's next microscope". Mathematical modeling is used to transform the central gene regulatory network at the heart of this work into a system of equations that allows us to describe the temporal evolution of NANOG and GATA6 under the influence of an external signal. Special attention is paid to the derivation of new models using methods of statistical mechanics, as well as the comparison with existing models. After a detailed stability analysis the advantages of the derived model become clear by the fact that an exact relationship of the model parameters and the formation of heterogeneous mixtures of two cell types was found. Thus, the model can be easily controlled and the proportions of the resulting cell types can be estimated in advance. This mathematical model is also combined with a mechanism for global cell-cell communication, as well as a model for the growth of an organoid. It is shown that the global cell-cell communication is able to unify the formation of checkerboard patterns as well as engulfing patterns based on differently propagating signals. In addition, the influence of cell division and thus organoid growth on pattern formation is studied in detail. It is shown that this is able to contribute to the formation of clusters and, as a consequence, to breathe some randomness into otherwise perfectly sorted patterns. / Die embryonale Entwicklung von Säugetieren unterliegt komplexen biologischen Zusammenhängen, die es zu verstehen gilt. Bevor jedoch das gesamte Gebilde der Entwicklung zusammengesetzt werden kann, müssen zunächst die einzelnen Bausteine genauer verstanden werden. Einer dieser Bausteine ist die zweite Zellschicksalsentscheidung und beschreibt die Differenzierung von Zellen der inneren Zellmasse des Embryos hin zu Epiblast- und primitiven Endodermzellen. Diese Zellen teilen sich daraufhin räumlich auf und bilden die anschließend die Grundlagen für den Embryo und den Dottersack. In Organoiden der inneren Zellmasse wird ebenfalls beobachtet, wie sich diese zwei Typen von Vorläuferzellen bilden, und sich in gewissem Maße räumlich voneinander trennen. Diesem Phänomenen widmete sich diese Arbeit im Verlaufe der letzten drei Jahre. Über diese Zelldifferenzierung ist bereits bekannt, dass die ersten Anzeichen für Epiblast- und primitive Endodermdifferenzierung jeweils die Expressionslevel der Transkriptionsfaktoren NANOG und GATA6 sind. Dabei nehmen Zellen mit niedriger Expression an GATA6 und hoher Expression an NANOG das Epiblastschicksal an. Sind die Expressionen umgekehrt, so entsteht eine primitive Endodermzelle. Bei der räumlichen Aufteilung der beiden Zelltypen ist noch nicht eindeutig geklärt, welcher Mechanismus dazu führt. Eine gängige Hypothese besagt, dass die Ursache für die räumliche Umlagerung der Zellen in der unterschiedlichen Adhäsion der Zellen liegt. In dieser Arbeit wird jedoch die Möglichkeit einer globalen Zell-Zell-Kommunikation untersucht. Die gewählte Vorgehensweise bei der Untersuchung dieser Phänomene folgt dem Motto "Die Mathematik ist das nächste Mikroskop der Biologie". Mit Hilfe mathematischer Modellierung wird das zentrale genregulierende Netzwerk im Mittelpunkt dieser Arbeit in ein Gleichungssystem umgewandelt, welches es ermöglicht, die zeitliche Entwicklung von NANOG und GATA6 unter Einfluss eines externen Signals zu beschreiben. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Herleitung neuer Modelle mit Hilfe von Methoden der statistischen Mechanik, sowie dem Vergleich mit bestehenden Modellen. Nach einer ausführlichen Stabilitätsanalyse werden die Vorteile des hergeleiteten Modells dadurch deutlich, dass ein exakter Zusammenhang der Modellparameter und der Formierung von heterogenen Mischungen zweier Zelltypen gefunden wurde. Dadurch lässt sich das Modell einfach kontrollieren und die Proportionen der resultierenden Zelltypen bereits im Voraus abschätzen. Dieses mathematische Modell wird außerdem kombiniert mit einem Mechanismus zur globalen Zell-Zell Kommunikation, sowie einem Modell zum Wachstum eines Organoiden. Dabei wird gezeigt dass die globale Zell-Zell Kommunikation dazu in der Lage ist die Bildung von Schachbrettmustern, sowie auch umrandenden Muster anhand unterschiedlich ausbreitender Signale zu vereinen. Zusätzlich wird der Einfluss der Zellteilung und somit des Organoidwachstums auf die Musterbildung genauestens untersucht. Es wird gezeigt, dass dies zur Bildung von Clustern beiträgt und infolgedessen eine gewisse Zufälligkeit in ansonsten perfekt sortierte Muster einbringt.

Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen. / During embryonic development, the Notch signaling pathway plays a central role in cell fate specification, proliferation and communication between neighboring cells. Hey basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors are targets of the Notch signaling pathway and show crucial functions in cardiovascular development. Hey2 knock out (KO) mice and Hey1/HeyL double knock out mice (DKO) exhibit incomplete formation of the septum and valves in heart development and defects in the differentiation of blood vessels. The aim of this study was to find new target genes of the Hey proteins to further clarify their function during organ development and to get more insight into the phenotypes of the Hey KO mice. Towards this goal, a combination of microarray analysis and chromatin immunoprecipitation (ChIP) was chosen to get an overview of genes directly regulated by Hey proteins in a cell culture model of HEK293 cells overexpressing doxycycline-inducible Flag-tagged Hey1 or Hey2. Microarray analysis revealed approximately 100 target genes that were downregulated up to 5-fold by both Hey1 and Hey2. Interestingly, 15 genes were upregulated more than 2-fold by Hey2. ChIP with αFlag antibody confirmed direct interaction of Hey1 and Hey2 with the proximal promotor regions of 4 downregulated target genes (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Overexpression of mutant Hey1 proteins with deletion of the DNA-binding basic domain or single amino acid exchanges in the basic domain (3 arginine to lysine), failed to downregulate Hey1 target genes. Additionally, ChIP assay demonstrated that the binding of the Hey mutants to the promotor regions of HEY1, BMP2, KLF10 or FOXC1 is abolished, suggesting an essential role for the basic domain in DNA binding and function of the Hey proteins. We then utilized ChIP-PET in conjunction with highthroughput sequencing to perform a genome-wide screen for Hey1 and Hey2 binding sites in HEK293 cells. 1453 and 4288 target genes were identified for Hey1 and Hey2, respectively, of which 1147 genes were targets of both Hey1 and Hey2. Although the binding sites were located upstream and downstream of coding sequences, or even in exons and introns, 55 % and 49 % of all binding sites for Hey1 and Hey2, respectively, were located in proximal promoter regions between -0.5 kb and the first exon. An in silico binding motif analysis suggests a repetitive GC-rich sequence for Hey binding which is probably located in CpG islands, indicating a direct regulation of the transcriptional machinery by the Hey proteins. A comparison of the target genes from microarray analysis and ChIP-PET sequencing data demonstrates a large number of downregulated genes with binding sites that are directly bound by the Hey proteins. While 60 % of Hey2 downregulated genes contain binding sites, only 20 % of upregulated genes have binding sites for Hey2, invoking a repressor function for Hey proteins. To investigate, whether the Hey proteins regulate different target genes in a cell type specific manner, embryonic stem cells (ES cells) were generated which also overexpress doxycycline-inducible Hey1 or Hey2. These ES cells could be differentiated efficiently into cardiomyocytes and thus could also be used for gene expression analysis after induction of Hey overexpression. Microarray analysis of ES cells and cardiomyocytes resulted in more up- than downregulated genes in comparison to HEK293 cells. The overlap of common regulated genes in HEK293, ES cells and cardiomyocytes was very low. Only two Hey2 target genes were regulated more than 2-fold in both HEK293 and ES cells (Hes1, Zic2). This disparity indicates a narrow cell-type specific gene regulation by Hey proteins. Gene ontology analysis of all target genes demonstrated interactions of Hey proteins with different signaling pathways (e.g. TGFβ, Id or Wnt signaling), which are all indispensable for early developmental processes. These results show that Hey proteins influence and modulate gene expression levels in different signaling pathways in a cell-type specific manner. These data provide new possibilities for future research efforts to elucidate the role of Hey proteins in early organ development.

Alpha2-Rezeptoren, die weiter in alpha2A, alpha2B und alpha2C unterteilt werden, gehören zur Gruppe der adrenergen Rezeptoren innerhalb der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie sind maßgeblich an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Vieles, was heute über alpha2-Rezeptoren bekannt ist, wurde mithilfe von alpha2-defizienten Mäusen, sogenannten „Knock-Out“-Mäusen (KO) herausgefunden, von denen bislang drei Einzel-KOs und der Doppel-KO der Subtypen A und C existieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Kreuzung der vorhandenen KO-Linien Mauslinien generiert, die defizient für alpha2A und alpha2B, für alpha2B und alpha2C oder alle drei alpha2-Rezeptoren sind. Während alpha2AB-KO-Mäuse ungefähr entsprechend der Mendelschen Verteilung geboren wurden, zeigte sich, dass alpha2BC-KO-Mäuse teilweise und alpha2ABC-KO-Mäuse sogar komplett embryonal letal waren. Die morphologischen Unter-suchungen legten den Zeitpunkt der embryonalen Letalität der alpha2ABC-KO-Mäuse auf den Tag E10,5 der Embryonalentwicklung fest und konnten zeigen, dass diese Letalität in einem Vaskularisierungsdefekt innerhalb der extraembryonalen Organe Plazenta und Dottersack begründet lag. Diese Organe stellen die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen und Sauerstoff sicher und sorgen somit für dessen Entwicklung. Durch RT-PCR-Experimente konnte die mRNS für alle drei alpha2-Rezeptorsubtypen an Tag E10,5 sowohl im Embryo als auch in Plazenta und Dottersack nachgewiesen werden. Autoradiographische Experimente und Radioligandenbindungsstudien an Plazenten machten deutlich, dass der Großteil an alpha2-Rezeptoren im embryonalen Teil der Plazenta exprimiert wird, nämlich in den Riesenzellen und in der sich daran anschließenden Spongiotrophoblastschicht, und dass hierbei alpha2-Rezeptoren vom B-Subtyp vorherrschen. In den genannten Zellen konnte mittels Immunhistochemie eine alpha2-Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 gezeigt werden, die auch in kultivierten WT-Dottersäcken beobachtet werden konnte. Unter basalen Bedingungen zeigte sich, dass die ERK1/2-Phosphorylierung in Gewebe von alpha2ABC-KO-Embryonen drastisch vermindert war, während andere Signalwege, die von alpha2-Rezeptoren angestoßen werden können, nicht beeinträchtigt waren. Versuche in einem Zellkulturmodell und mit kultivierten WT-Dottersäcken ergaben eine physiologisch relevante Wechselwirkung zwischen dem alpha2B-Rezeptor und dem PDGFbeta-Rezeptor, einer Rezeptortyrosinkinase, als deren Mechanismus sich in Co-Kultur-Experimenten mit alpha2B-Rezeptor-transfizierten Zellen und alpha2ABC-defizienten Dottersäcken die Transaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen herausstellte. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass a2-Rezeptoren bei der Maus über eine Transaktivierung von ERK1/2 die Vaskularisierung der Plazenta und des Dottersacks bedingen und damit eine normale Embryonalentwicklung sicherstellen. / alpha2-Receptors belong to the familiy of adrenergic receptors within the superfamily of G-protein coupled receptors. They are involved in the regulation of many physiological processes. Most of the known functions have been investigated using mice deficient in alpha2-receptors. To date, single knockout mouse lines exist for each subtype of alpha2-receptors and also the alpha2AC-knockout. In this study the remaining double knockouts and the triple-knockout were generated by crossing the existing knockout mice. While mice deficient for the alpha2A- and the alpha2B-receptor were born with the expected Mendelian ratio, embryonic lethality occurred in the alpha2BC-knockout mice, and this was complete in mice lacking all three alpha2-receptors. Morphological examinations revealed that alpha2ABC-mice die around midgestation because of a defect in vascularisation in the extra-embryonic organs placenta and yolk sac. These are the organs which support the embryo with nutrients and oxygen and are therefore essential for embryonic development. RT-PCR-experiments detected mRNA for all three subtypes of alpha2-receptors on day E10.5 of embryonic development in embryo, placenta and yolk sac. Autoradiography and radioligand binding studies showed that most of the alpha2-receptors are expressed in the embryonic part of the placenta, in particular in giant cells and the underlying spongiotrophoblast layer. The alpha2B-receptor is the main subtype in these tissues. Immunohistochemistry of stimulated placenta slices demonstrated alpha2-receptor mediated phosphorylation of the MAP-kinase ERK1/2, which was also observed in cultivated yolk sacs of WT-mice. In freshly prepared tissue of alpha2ABC-knockout embryos ERK1/2-phosphorylation was dramatically decreased, while other signaling pathways of alpha2-receptors were unaffected. Experiments using cell culture and cultivated yolk sacs of WT-mice revealed a physiologically relevant interaction between alpha2B-receptors and PDGFbeta-receptors, a receptor tyrosine kinase. The mechanism of this interaction was illucidated in co-culture experiments of alpha2B-receptor transfected cells and alpha2 ABC-knockout yolk sacs as a G-protein coupled receptor initiated transactivation of receptor tyrosine kinases. In this study it was demonstrated that in mice alpha2-receptors are responsible for the vascularisation of placenta and yolk sac by transactivation of ERK1/2, and that they are, therefore, necessary for proper embryonic development.

HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären. / HMGN proteins are architectural chromatin proteins that reduce the compaction of the chromatin fiber, facilitate access to nucleosomes and modulate DNA-dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. In this work the functional role of the HMGN proteins during embryogenesis was analyzed using the African clawed frog Xenopus laevis as a model system. The expression and cellular location of the HMGN proteins was found to be developmentally regulated. Experimental manipulations of the HMGN protein amounts led to gross developmental defects in postblastula embryos. HMGN transcripts and proteins were present throughout oogenesis. Interestingly, the HMGN proteins were stored in the cytoplasm of later oocyte stages and excluded from the oocytes nuclei and lampbrush chromosomes. Upon maturation of oocytes into eggs, HMGN proteins were no longer detectable. During embryogenesis, HMGN proteins were first detected in blastula stage embryos, coinciding with the transcriptional activation of the embryonic genome. At least at the mRNA level the expression pattern showed a tissue specific pattern, with relatively high levels of mRNAs in the mesodermal and neuroectodermal regions of early tailbud embryos as shown by whole mount in-situ hybridization and RT-PCR-analyses. After microinjection of recombinant HMGN proteins (overexpression) or morpholino-antisense oligonucleotides (knock-down) the embryos displayed typical phenotypes with imperfect closure of the blastopore, distorted body axis and abnormal head structures. Histological analyses and magnetic resonance imaging indicated that mesoderm differentiation was particularly affected by aberrant HMGN protein levels. The results demonstrate that proper embryonic development of Xenopus laevis requires precisely regulated levels of HMGN proteins. “Animal cap assays” and RT-PCR-analyses of the expression of mesodermal genes indicated that HMGN proteins are involved in the regulation of mesoderm specific genes. These experiments also indicated that the HMGN expression itself is regulated during mesoderm differentiation. Moreover, by studying the expression pattern of developmentally relevant genes during midblastula transition it became evident that altered HMGN protein levels influence the onset of the expression of specific genes such as Xbra and chordin. The results show, for the first time, that these ubiquitous chromatin proteins modulate the expression of specific genes. The HMGN-induced misexpression of Xbra and chordin as key regulatory genes during mesoderm differentiation may explain the observed malformations of mesodermal structures.

Raf Proteine sind Serin/Threonin Kinasen, die als zentrale Elemente des Ras, Raf, Mek, Map Kinase Wegs, an der Weiterleitung von extrazellulären Signalen von der Zellmembran zu nukleären Effektoren beteiligt sind. Auf diese Weise kontrollieren sie elementare Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und das Überleben von Zellen. In Säugetieren wurden drei funktionelle Gene (A-, B- and C-raf) beschrieben. Aus biochemischen Untersuchungen ergibt sich, dass die Isozyme überlappende aber auch differentielle Funktionen übernehmen. Allerdings wurde ein differenziertes Verständnis der jeweiligen spezifischen Rolle dadurch erschwert, dass in den meisten Zelltypen verschiedene Raf-Isozyme expremiert werden und dass wegen der Vielzahl der Aktivatoren und Effektoren eine eindeutige Isoform-Zuordnung schwer möglich war. Aufgrund der Beteiligung an verschiedenen Krankheitsbildern, insbesondere der Tumorentstehung und –progression, ist jedoch die Aufklärung der Isozym-spezifischen Funktionen von vorranginger wissenschaftlicher Bedeutung. B-Raf hat unter den Raf Kinasen die höchste Kinaseaktivität und zeigt antiapoptotische Eigenschaften. B-Raf knockout Mäuse zeigen eine allgemeine Wachstumsverzögerung und sterben zwischen E10,5 und E12,5 aufgrund fehlentwickelter Gefässe in Folge massiver Apoptose differenzierter Endothelzellen. [1]. Um die Lethalität des B-Raf-/- (KO) Phänotyps zu überkommen und um die Redundanz der B-Raf Proteine weiter zu untersuchen, wurden Mäuse generiert, die unter der Kontrolle des B-Raf Promoters statt B-Raf eine A-Raf cDNA exprimieren. Nur in einem Fall entwickelte sich eine ausgewachsene p20 Maus ohne sichtbare Entwicklungsdefekte oder Verhaltensauffälligkeiten. Darüber hinaus wurden lebende Embryonen mit normaler Entwicklung aber reduzierter Grösse mit niedriger Inzidenz zwischen E12,5d und E16,5d beobachtet. In allen diesen Fällen fanden wir ein intaktes Gefäßsystem. Andererseits waren Neurogenese und die Bewegung der neuralen Vorläuferzellen in den überlebenden Embryonen gestört, was in einigen Fällen zu unterentwickelten Hirnregionen führte. Mittels TUNEL bzw. PCNA Assay konnten wir zeigen, dass mehr apoptotische und weniger proliferierende Zellen in ventrikulärer und subventrikulärer Zone der Hirn Ventrikel und im Striatum der KIN Embryonen zu finden sind. Außerdem wurden in einer Reihe von Geweben von E13,5d und in den Lungen von E16,5d Embryonen, vermehrt apoptotische Zellen beobachtet. Dies war in der einen ausgewachsenen KIN Maus nicht der Fall. Diese zeigte einen reduzierten Anteil an neuronalen Vorläuferzellen in der subgranulären Zone des Hippocampus und an reifen Neuronen im Riechkolben. Ansonsten waren aber keine Störungen der Neurogenese in der ausgewachsenen KIN Maus detektierbar. Fibroblasten die aus KIN Embryonen etabliert wurden, zeigten im Vergleich zu Wildtypzellen reduzierte Fähigkeit zur Proliferation und erhöhte Sensibilität gegenüber Apoptoseauslösern. Die erhöhte Apoptosetendenz spiegelte sich auf molekularer Ebene in einer Reduktion an antiapoptotischen Molekülen wieder. Aktive ERK und Akt Kinase sind erniedrigt. Außerdem war von dem bekannten Raf Substrat BAD, weniger an der inaktiven phosphorylierten Form zu beobachten, wodurch bei gleicher Menge Gesamtprotein auf ein Mehr an proapoptotischem unphosphoryliertem BAD geschlossen werden kann. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Substitution von B-Raf durch die weniger aktive A-Raf Kinase zwar die endotheliale Apoptose verhindern kann, die die Ursache für das frühe Absterben der B-Raf-/- (KO) Mäuse ist, dass aber die normale Entwicklung dennoch entscheidend gestört ist. / Cellular proliferation, differentiation and survival in response to extracellular signals are controlled by the signal transduction pathway of Ras, Raf and MAP kinase. The Raf proteins are serine/threonine kinases with essential function in growth/differentiation/survival - related signal transduction events. In mammals, three functional (A-, B-, and C-Raf) genes were described. Biochemical studies suggest overlapping and differential utilization of Raf isozymes. However, the frequent co-expression of Raf isozymes and their multiple activators and effectors impedes the full understanding of their specific roles. The elucidation of these roles is important due to the involvement of the Ras/Raf/MEK/MAP kinase cascade in human disorders especially in tumor development and progression. B-Raf was shown to posses the strongest kinase activity among Raf kinases and display antiapoptotic properties. Mice deficient in B-Raf show overall growth retardation and die between E10.5 and E12.5 of vascular defects caused by excessive death of differentiated endothelial cells. To elucidate the redundancy of Raf isozymes during embryonic development and to rescue B-Raf-/- (KO) phenotype, B-Raf alleles were disrupted by introducing A-Raf cDNA under the control of endogenous B-Raf promoter. The resulting BRaf A-Raf/A-Raf (KIN) phenotype depends on genetic background. The living embryos displaying normal development but size reduction were found with low incidence at E12.5d-16.5d. All of them displayed the rescue of vascular system. One adult p20 mouse without any visible defects in development and behavior was obtained. On the other hand, the processes of neurogenesis and neural precursors migration in survived embryos were disturbed which led in some cases to underdevelopment of different brain compartments. TUNEL and cell proliferation (PCNA staining) assays revealed more apoptotic (E13.5d) and less proliferating(E12.5d cells within ventricular and sub-ventricular zones of brain ventricles and in striatum of KIN embryos. In addition, more apoptotic cells were detected in many other tissues of E13.5d and in lung of E16.5d KIN embryos but not in adult KIN mouse. p20 KIN mouse demonstrated reduced fraction of neural precursor cells in sub-granular zone of hippocampus and mature neurons in olfactory bulb. The other processes of neurogenesis were not disturbed in adult KIN animal. Fibroblasts obtained from KIN embryos demonstrated less proliferative ability and were more susceptible to apoptotic stimuli compared to WT. This was accompanied by the reduction of active ERK and Akt required for survival, and with decrease of inactive phosphorylated BAD. The kinetic of both ERK and Akt phosphorylation upon serum stimulation was delayed. All these data indicate that moderate A-Raf kinase activity can prevent the endothelial apoptosis but is not enough to completely rescue the other developmental consequences.

Die Familie der RAF-Kinasen umfasst drei Mitglieder, A-RAF, B-RAF und C-RAF. Nur für die B-RAF-Isoform wurde eine wichtige Funktion für die Entwicklung des Zentralen Nervensystems (ZNS) gefunden. Das Fehlen von B-RAF führt bei neu generierten embryonalen Neuronen zum Zelltod, weil sie in vitro nicht auf überlebensfaktoren reagieren können. Bei einer zweiten Zelllinie, die durch die Abwesenheit von B-RAF beeinträchtigt ist, handelt es sich um endotheliale Zellen. Ihr Zelltod führt zu inneren Blutungen und zu Letalität von B-RAF-/--Mäusen zwischen Tag 10.5 (E10.5) und 12.5 (E12.5) der Embryonalentwicklung. Dies verhinderte bisher weitere Untersuchungen der neuralen B-RAF-Funktion bei späteren Stadien. Im Gegensatz zu B-RAF-/--Mäusen überleben B-RAFKIN/KIN-Mäuse die Mitte der Embryonalentwicklung, da ihre Endothelzellen vor Apoptose geschätzt sind. Diese Tiere besitzen kein B-RAF, stattdessen wird im B-RAF-Locus ein chimäres Protein exprimiert, das den N-Terminus von B-RAF sowie alle Domänen von A-RAF umfasst. Der Schutz vor abnormaler neuraler Apoptose im Vorderhirn macht diese Tiere zu einem potentiellen Modell zur Untersuchung der Proliferations- und Differenzierungsfunktion von B-RAF, die die Kinase neben der Überlebensfunktion in der ZNS-Entwicklung ausübt. Die detaillierte Untersuchung der B-RAFKIN/KIN-Tiere konzentrierte sich auf die Entwicklung der Hirnrinde. Augenscheinlich waren kortikale Defekte im B-RAFKIN/KIN Vorderhirn: Der Verlust von B-RAF führte zu einer starken Reduzierung von Brn-2 exprimierenden pyramidalen Projektions-Neuronen begleitet von einer Störung der Dendritenbildung mit weniger und dünneren Dendriten in diesen oberen Schichten. Weitere Untersuchungen mit BrdU-Markierungsexperimenten zeigten in der ventrikulären Schicht reduzierte Zellproliferation für E14.5-E16.5 der Mutantenembryonen und ein Migrationsdefizit der spätgebideten kortikalen Neuronen. Während der Proliferationsdefekt der Hirnrinden-Vorläuferzellen mit einer reduzierten ERK-Aktivierung einherging, bleibt der Mechanismus der gestörten neuralen Migration zu erklären. Unsere Hypothese ist, dass die subzelluläre Lokalisation von Phospho-ERK in den wandernden Hirnrinden-Neuronen der B-RAFKIN/KIN-Mäuse verändert sein könnte. Zur Bestäigung der in vivo-Funktion von B-RAF und weiteren Studien zu ihrer unbekannten Rolle in der embryonalen Neurogenese sowie anderen Morphogenesen wäre die konditionale B-RAF Inaktivierung erforderlich. Durch die Deletion des genetischen Materials bzw. die Inaktivierung der Genfunktion in ausgew�hlten Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt ließen sich die Embryo-Letalität sowie unerwünschte pleiotrope Nebeneffekte vermeiden und akkumulierende, kompensierende Entwicklungsveränderungen von Beginn an ausschließen. Um die Cre Rekombinase-Methode einsetzen zu können, wurden floxed B-RAF embryonale Stammzell (ES)-Zelllinien generiert. Außerdem wurde ein auf dem Tetrazyklin Operator basierendes Schaltallel in den B-RAF Genort von embryonalen Stammzellen integriert, so dass die B-RAF Expression konditional und reversibel durch die Zugabe von Doxyzyklin angeschaltet werden konnte. Bisher wurden hochgradige chimäre Mäuse nach Blastozysten-Injektion geboren. Die Keimbahnübertragung dieser chimären Mäuse wird momentan untersucht. Wenn beide konditionale Mauslinien bereit sind, k�nnte die Entwicklung ihres Zentralnervensystems untersucht werden, um die Rolle von B-RAF in der Entwicklung des Nervensystems herauszufinden. / The RAF family of protein kinases consists of three members, A-RAF, B-RAF and C-RAF. Unlike the other isotypes, B-RAF has been found to have an important function for normal development of the central nervous system (CNS), because newly generated embryonic neurons lacking B-RAF cannot respond to survival factors and undergo cell death in vitro. A second cell lineage affected by the absence of B-RAF are endothelial cells and their death leads to internal bleedings and lethality of B-RAF-/- mice between embryonic day 10.5 (E10.5) and E12.5 precluding an opportunity to further analyze neural B-RAF function at a later stage. In contrast to B-RAF-/- mice, B-RAFKIN/KIN mice, which are B-RAF deficient but express a chimeric protein consisting of the unique N terminus of B-RAF and all the domains of A-RAF in the B-RAF gene locus, survive after midgestation because their endothelial cells are protected from apoptosis. More importantly, overall prevention of abnormal neural apoptosis in the forebrain allows us to study proliferation- or differentiation-oriented function of B-RAF other than its survival effects in CNS development. The detailed investigation of B-RAFKIN/KIN animals was concentrated on cortical development. There were apparent cortical defects in B-RAFKIN/KIN forebrain: Loss of B-RAF led to severe reduction of Brn-2 expressing pyramidal projection neurons accompanied by a disruption of dendrite formation in the upper layers. In further analysis, BrdU labelling experiments showed that from E14.5 to E16.5 cell proliferation in the ventricular zone of the mutant mice was reduced and that the late-born cortical neurons failed to migrate properly. While the proliferation defect of cortical progenitors was associated with reduced ERK activation, the mechanism causing impaired neuronal migration remains to be determined. Our hypothesis is that the subcellular localization of phospho-ERK may be altered in migrating cortical neurons in B-RAFKIN/KIN mice. To confirm in vivo function of B-RAF and further study unknown roles in embryonic neurogenesis as well as other morphogenesis, conditional B-RAF knockouts would be the ideal models, which can efficiently avoid embryonic lethality, prevent unwanted pleiotropic side effects and exclude accumulative compensatory developmental changes from the earliest developmental stage on, through the deletion of genetic material/gene function in selected cells at a specific time. The use of site-specific recombinases such as Cre and the successful development of the reversible tetracycline-based switch have provided powerful venues for creating conditional loss-of-function mouse models. Generation of tetracycline-regulated B-RAF and floxed B-RAF mouse embryonic stem (ES) cell lines was performed. Up to now, high-grade chimeric mice were obtained after blastocyst injection of the modified ES cell clones. The germline transmission from these chimeric mice is currently under investigation. When either of conditional mouse lines is ready, detailed examination in their CNS development would be done to reveal how B-RAF plays a real role for normal development of the nervous system.

Die Pilzkörper von Drosophila melanogaster stellen eine für die Lebensfähigkeit dieses Organismus entbehrliche Gehirnstruktur dar. Die Entwicklungsprozesse, die der Bildung dieser zentralnervösen Struktur zugrunde liegen, sind gut erforscht. Die neuronalen Stammzellen, die für die Bildung dieser Gehirnstruktur verantwortlich sind, sind identifiziert und experimentell gut zugänglich. Daher bietet sich die Drosophila-Pilzkörperentwicklung als neurogenetisches Modellsystem an, grundlegende Mechanismen der Gehirnentwicklung durch die Untersuchung von Pilzkörperstrukturmutanten zu erforschen. In dieser Arbeit wurde mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) als eine durch Transposon- Insertion in den Casein-Kinase-2ß-Genlokus verursachte, hypomorphe Mutation identifiziert, die zu einer starken Verringerung der Anzahl der die Pilzkörper bildenden intrinsischen Neurone führt. Eine Reversion des mbuP1-Pilzkörperphänotyps konnte unter anderem durch die Expression von Casein-Kinase-2ß-(CK2ß)-Transgenen im mbuP1-Hintergrund erzielt werden. Durch Rekombination wurde ein fertiler mbuP1-Stamm etabliert, der nun die Untersuchung der zellulären mbuP1-Defekte ermöglicht. Eine partielle, letale Deletion der CK2ß-Transkriptionseinheit wurde erzeugt. Die Letalität dieser Deletion konnte sowohl durch ein genomisches CK2ß-Transgen als auch durch die ubiquitäre Expression einer CK2ß-cDNA gerettet, und hierdurch die essentielle Funktion der CK2ß-Transkriptionseinheit in Drosophila belegt werden. Durch die ubiquitäre Expression von in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im CK2ß-Letalhintergrund wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der regulatorischen CK2ß-Untereinheit durch die katalytisch aktive CK2α-Untereinheit kein lebensnotwendiger Prozess ist. Gleichartige Experimente wurden zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung eines CK2ß-Zinkfingermotivs und eines CK2ß-Destruction-Box-Motivs durchgeführt. Diese legen nahe, daß das Zinkfingermotiv im Gegensatz zum Destruction-Box-Motiv für die in vivo-Funktion der CK2ß-Untereinheit essentiell ist. Expression der in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im mbuP1-Hintergrund werden die funktionelle Bedeutung der ausgetauschten Aminosäuren für die Pilzkörperentwicklung zeigen. Eine letale genetische Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-MAP-Kinase-Gens rolled (rlSem) und eine lebensfähige Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-S6-Kinase-p90rsk-Gens ignorant (ignP1), bei der Flügel- und Augenent-wicklungsdefekte zu beobachten sind, wurden gefunden. Es wurde zudem gezeigt, daß rlSem als Suppressor des Pilzkörperphänotyps eines schwächeren mbu-Allels wirkt. Hierdurch konnte eine Beteiligung der Casein-Kinase-2 an MAP-Kinase-Signalübertragungswegen wahrscheinlich gemacht werden. / Mushroom bodies are dispensable for the developing and adult Drosophila fly. The developmental processes underlying mushroom body formation are well studied, the neural stem cells responsable for their development are identified and experimentally well accessable. Therefore Drosophila mushroom body development can be used as a powerful neurogenetic model system to find out about fundamental mechanisms underlying brain development by studying mutant flies showing aberrant mushroom body development. In the course of this work, mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) was identified as a hypomorphic casein kinase 2ß-allele (CK2ß) caused by the insertion of transposable elements in the casein kinase 2ß gene locus. The mbuP1-mutation leads to a drastic reduction of the number of intrinsic neurons forming the adult mushroom body. Expression of transgenic CK2ß in a mbuP1-mutant background led to a reversion of the mbuP1-associated mushroom body phenotype. Fertility of mbuP1-flies could be partially restored by recombining the original mbuP1{P3843/2}-chromosome with a w1118-chromosome. This will allow future studies to identify the cellular defects caused by mbuP1. A partial deletion of the CK2ß gene causes lethality which could be rescued by either a genomic CK2ß-transgene or by ubiquitous expression of a CK2ß-cDNA. Therefore, CK2ß has been shown to be an essential gene in Drosophila. By ubiquitous expression of in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a CK2ß-lethal background, a non-essential role of phosphorylation of the regulatory CK2ß-subunit by the catalytically active CK2α-subunit could be shown. Similar experiments were performed to examine the role of a CK2ß-zincfinger motif and a CK2ß-destruction-box motif. The obtained results suggest a non-essential in vivo function for the destruction-box motif and an essential in vivo function for the zincfinger-motif. Expression of the in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a mbuP1-background will reveal the functional significance of the substituted amino acids for mushroom body development. Performed genetic interaction studies showed a lethal interaction of mbuP1 with a mutation in the Drosophila-MAP-kinase gene rolled (rlSem) and a viable genetic interaction with a mutation in the Drosophila-S6-kinase-p90rsk gene ignorant (ignP1) which revealed defects in wing formation and eye development. It also could be shown that rlSem acts as a suppressor of the mushroom body phenotype associated with a weaker mbu-allele. These observations point towards a role of casein kinase 2 in MAP-kinase signalling.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Universiẗat, Diss., 2003--Würzburg.

University, Diss., 2004--Kiel.