Die vorliegende Studie über den Alterseinfluß bei der Honigbiene (Apis mellifera) besteht aus drei Hauptteilen. Der erste Teil befasst sich mit den Charakteristiken des Spermathekeninhalts alter und junger Bienenköniginnen. Im zweiten Teil geht es um die Auswirkungen des maternalen Alters auf die embryonale Mortalität und die juvenile Entwicklung der Brut. Im dritten Studienteil werden die Auswirkungen der Verweildauer in der Spermatheca auf die embryonale Mortalität, Embryonenqualität und Larvenentwicklung der Nachkommen untersucht. Der Samen aus den Spermatheken älterer Bienen weist andere Bewegungsmuster, eine geringere Geschwindigkeit und eine anderen Enzymaktivität auf als der Samen, der aus den Spermatheken junger Königinnen gewonnen wurde. Ein altersbedingtes Nachlassen der Fertlität ist daraus zu erklären. Im Laufe von zwei Jahren wurde die embryonale Entwicklung und das Larvenwachstum von Nachkommen unterschiedlich alter Königinnen untersucht (2-jährige bis frisch begattete Königinnen). Ältere Königinnen legten kleinere Eier und deren Nachkommen zeigten eine signifikant höhere Mortalitätsrate und kleinere Entwicklungsstadien als die Nachkommen jüngerer Königinnen. In einer weiteren Studie wurde die embryonale Mortalität und die Embryonalentwicklung von Nachkommen, die aus älteren Samen entstanden, untersucht. Dabei wurde der Samen aus den Spermatheken von alten und jungen begatteten Königin entnommen und jungfräuliche Königinnen übertragen. um das Alter der Königin auszugleichen. Bei der Untersuchung wurde eine höhere embryonale Mortalität und generell, zu gewissen Entwicklungszeiten signifikant, kleine Entwicklungsstadien bei den Königinnen festgestellt, die mit dem älteren Samen befruchtet wurden. Der relative Anteil an früher und später embryonaler Mortalität war auch zwischen den beiden Spermien-Alterlassen signifikant unterschiedlich. Die insgesamt hohe embryonale Mortalität auch in der Kontrollgruppe (Königinnen besamt mit Sperma aus den Spermathecen junger Königinnen) belegt, dass die Methode der Samenextraktion und Reinsemination einen großen Einfluß auf die Embryonalentwicklung hatte. Auch das Phänomen „leerer Eier“, welches in beiden Gruppen in gleicher Frequenz vorgefunden wurde, ist möglicherweise durch diese Methode bedingt. / This study on the honey bee, Apis mellifera, consists of three major parts. The first involves the characteristics of the spermathecal content of old and young honey bee queen. The second examines maternal age effects on embryonic mortality and juvenile development of offspring in the honey bee. The third investigates on the impact of semen age on early embryonic mortality, embryo quality and larvae development in the honey bee. Semen collected from the spermatheca of old queen bees show different sperm movement patterns and slower speed than sperm from the spermathecae of young queens. This ability is possibly related to different enzyme activities and metabolisms found in the spermathecal contents of differently aged queens. The embryonic development and larval growth rate have been examined with regard to queen honey bees of different ages (2-year-old to freshly mated queens) during two years (2005 and 2006). Early embryonic mortality “EEM” has been found to be higher within the eggs from old queens than in those from younger queens. Egg volume, consequently embryo size, reduces as queen’s age. A further investigates embryonic mortality in offspring originating from older semen. This has been carried out by extracting the semen from the spermatheca of an old or/and young mated queen and re-inseminating it into a virgin queen, in order to adjust for queen age. The investigation show higher embryonic mortality in the offspring from virgin queens inseminated with semen extracted from older queens than with semen from younger queens. The relative percentage of early and late embryonic mortality within the groups was different between queens re-inseminated with aged semen. High embryonic mortality in the control semen ages may be affected by the method of extracting from semen out of the spermatheca and re-inseminating it into a virgin queen. Empty egg phenomenon, which has been found in both groups, may be related to this technique

Dendritische Defekte vermitteln Störungen der Erregbarkeit, Modulation und Plastizität von Neuronen, die zur Entwicklung neurodegenerativer Krankheiten führen können. Eine Mutation des Transkriptionsregulators Zeb2 führt zur Entwicklung des Mowat-Wilson-Syndroms, einer Erkrankung, die mit kognitiven Störungen und einem erkennbaren Gesichtsphänotyp einhergeht. Obwohl kognitive Defekte häufig mit Defekten bei der Bildung des dendritischen Baums in Verbindung gebracht werden, wurde die Rolle von Zeb2 bei der dendritischen Entwicklung bisher nicht untersucht. Hier zeige ich, dass Zeb2-defiziente Neuronen in den oberen neokortikalen Schichten einen abnormalen dendritische Baum aufweisen. Außerdem führt der Verlust von Zeb2 zu einer Fehlorientierung des apikalen Dendriten in einer nicht senkrechten Ausrichtung zur Pia. Darüber hinaus habe ich die Signalwege analysiert, die an der Regulierung der Morphologie des Dendritenbaum stromabwärts von Zeb2 beteiligt sind, und zwar durch Deep Sequencing des Transkriptoms von Zeb2-defizienten und Wildtyp-Neokortices sowie durch Massenspektrometrie-Screens auf Veränderungen in der Expression von Zelloberflächenproteinen nach dem Verlust von Zeb2. Für die vielversprechenden Kandidaten habe ich ein in situ-Hybridisierungs-Screening bei E15,5 durchgeführt. Eine Reihe von Genen, die an der neuronalen Morphologie und an Membranproteinen beteiligt sind, darunter Neuropilin1 und Cadherin6, werden in Gehirnen mit Zeb2-Mangel überexprimiert. Insbesondere habe ich die Rolle der neuen nachgeschalteten Zielgene Nrp1, Cdh6 und Wnt5a analysiert. Ich verwendete shRNA von Nrp1, Cdh6 und Wnt5a in neuronale Zellkultur, um zu zeigen, dass Nrp1 und Wnt5a eine erhöhte dendritische Komplexität in den Zeb2-defizienten neuronalen Zellen fördern. Die Überexpression von Nrp1 in Neuronen der oberen Schicht in vivo mittels in utero Elektroporation ist ausreichend, um die dendritische Komplexität zu fördern. Darüber hinaus zeige ich durch in utero Elektroporation einer shRNA gegen Nrp1 in Zeb2-defiziente Tiere, dass die Unterdrückung von Nrp1 durch Zeb2 für die Unterdrückung exzessiver Verzweigungen während der Entwicklung erforderlich ist. Für die Ausrichtung des Dendritenbaum ist sie jedoch nicht erforderlich. Zusammengenommen zeigen diese Daten die wichtige Rolle des Zeb2-Gens bei der Entwicklung des korrekten Dendritenbaum von Neuronen und der Ausrichtung des apikalen Dendriten. / Dendritic defects mediate disturbances in the excitability, modulation and plasticity of neurons, which can lie at the cause of neurodegenerative diseases. Mutation of the transcriptional regulator, Zeb2, causes the development of Mowat-Wilson syndrome, a condition associated with cognitive defects and a recognizable facial phenotype. Although cognitive defects are often associated with defects in the formation of the dendritic tree, the role of Zeb2 in dendritic development had not been studied previously. Here, I show that Zeb2- deficient neurons in the upper neocortical layers have abnormal dendritic trees. Also, loss of Zeb2 results in the mis-orientation of the apical dendrite to a non-perpendicular orientation to the pia. Furthermore, I have analysed the signalling pathways involved in regulation of dendritic tree morphology downstream of Zeb2 by deep sequencing of the transcriptome of Zeb2-deficient and wildtype neocortices and mass spectrometry screens for changes in the expression of cell surface proteins upon loss of Zeb2. For the promising candidates, I have performed in situ hybridization screening at E15.5. A number of genes involved in neuronal morphology and membrane proteins, including Neuropilin1 and Cadherin6, become overexpressed in Zeb2- deficient brains. In particular, I analysed the role of the novel downstream target genes Nrp1, Cdh6 and Wnt5a. I used shRNA of Nrp1, Cdh6 and Wnt5a in cortical neuron cultures to demonstrate that Nrp1 and Wnt5a promote increased dendritic complexity in Zeb2-deficient neuronal cells. Overexpression of Nrp1 in upper layer neurons in vivo, using in utero electroporation, is sufficient to promote dendritic complexity. In addition, I show using in utero electroporation of an shRNA against Nrp1 into Zeb2-deficient animals, that repression of Nrp1 by Zeb2 is required for suppressing excessive branching during development. It is not needed however for the orientation of the dendritic tree. Taken together, these data show the important role of the Zeb2 gene in the development of the correct dendritic tree of neurons and the orientation of the apical dendrite.

During zebrafish gastrulation, highly coordinated cellular rearrangements lead to the formation of the three germ layers, ectoderm, mesoderm and endoderm. Recent studies have identified silberblick (slb/wnt11) as a key molecule that regulates gastrulation movement through a conserved pathway, which shares significant similarity with a signalling pathway that establishes epithelial planar cell polarity (PCP) in Drosophila (Heisenberg et al., 2000; Veeman et al., 2003), suggesting a role for cell polarity in regulating gastrulation movements. However, the cellular and molecular mechanisms by which slb/wnt11 functions during zebrafish gastrulation are still not fully understood. In the first part of the thesis, the three-dimensional movement and morphology of individual cells in living embryos during the course of gastrulation were recorded and analysed using high resolution confocal microscopy. It was shown that in slb/wnt11 mutant embryos, hypoblast cells within the forming germ ring display slower, less directed migratory movements at the onset of gastrulation, which are accompanied by defects in the orientation of cellular processes along the individual movement directions of these cells. The net movement direction of the cells is not changed, suggesting that slb/wnt11-mediated orientation of cellular processes serves to facilitate and stabilize cell movements during gastrulation. By using an in vitro reaggregation assay on mesendodermal cells, combined with an analysis of the endogenous expression levels and distribution of E-cadherin in zebrafish embryos at the onset of gastrulation, E-cadherin mediated adhesion was found to be a downstream mechanism regulating slb/wnt11 function during gastrulation. Interestingly, the effects of slb/wnt11 on cell adhesion appear to be dependent on Rab5-mediated endocytosis, suggesting endocytic turnover of cell-cell contacts as one possible mechanism through which slb/wnt11 mediates its effects on gastrulation movements. - Die Druckexemplare enthalten jeweils eine CD-ROM als Anlagenteil: QuickTimeMovies (ca. 23 MB)- Übersicht über Inhalte siehe Dissertation S. 92 - 93"

Präzise regulierte Genexpression, ist der Schlüssel zu erfolgreicher Embryonal-entwicklung. Die Expression von Zelltyp-spezifischen Transkriptionsfaktoren kann durch räumliche Interaktionen von Promotoren und Enhancern im Nukleus kontrolliert werden, aber auch durch 3D Faltung der DNA in größere organisatorische Einheiten wie “Topologically Associating Domains” (TADs) oder “A/B compartments”. Um die 3D Faltung in den Zelltypen des prä-implantations Embryos zu untersuchen, nutze ich ES und XEN Zellen, die stark dem Epiblast und dem primitiven Endoderm in der inneren Zellmasse des E4.5 Embryos ähneln. Um den Zusammenhang zwischen 3D DNA Faltung und zellulärer Identität zu erforschen, habe ich GAM, ATAC-seq und RNA-seq Daten von ES und XEN Zellen produziert. Um die Genom-Architektur im Embryo zu untersuchen, habe ich außerdem die GAM Methode an den Mausembryo angepasst und kann dadurch erstmals genomweit DNA-Faltung in den spezifischen Zelltypen der inneren Zellmasse des prä-implantations Embryos zeigen. ES und XEN Zellen zeigen viele differentiell exprimierte Gene, sowie starke Veränderungen in der Chromatin-Organisation, beispielweise in der Bildung von reprimierten Chromatinnetzwerken in ESCs, die wichtige XEN Gene wie Gata6 und Lama1 enthalten, während diese nicht aktiv sind. XEN-spezifische Genexpression ist oft mit der Präsenz von XEN-spezifischen “TAD boundaries” gekoppelt. Der Sox2 Locus zeigt eine ESC-spezifische Organisation mit aktiven Genen, und Regionen die von den Transkriptionsfaktoren SOX2, NANOG und OCT4 gebunden sind. Die starke Reorganisation der Genom-Architektur in wichtigen Loci wie Gata6 und Sox2 konnte ich mit in vivo GAM Daten bestätigen und finde ähnliche Unterschiede zwischen den beiden Zelltypen der inneren Zellmasse wie im in vitro Model. Diese Ergebnisse zeigen, wie wichtig es ist, Zelltypen getrennt zu untersuchen und, dass eine Verbindung zwischen zellulärer Identität und der Faltung des Genoms in der Embryonalentwicklung besteht. / Tightly controlled gene regulation is key to functional metazoan embryonic development. The expression of cell-fate determining transcription factors orchestrates the establishment of the various lineages of the embryo. Gene expression is often regulated via specific chromatin organisation. To investigate cell type-specific differences in chromatin folding in early embryonic development, I used in vitro models of the two distinct cell populations in the blastocyst ICM. In mouse ES and XEN cells, I mapped 3D genome conformation using Genome Architecture Mapping (GAM), chromatin accessibility using ATAC-seq, and gene expression using total RNA-seq. To enable the mapping of 3D genome folding directly in the blastocyst ICM, I adapted GAM for cell type-specific selection of nuclei, by integrating immunofluorescence detection of markers, and generated the first genome-wide chromatin contact maps that distinguish ICM cell types. I report that the ES and XEN cell lineages undergo abundant large scale rearrangements of genome architecture and exhibit high numbers of differentially expressed genes. For example, extra-embryonic endoderm genes, such as Lama1 and Gata6, form silent hubs in ESCs, potentially connecting maintenance of pluripotency to 3D structure of the genome. Further, I show that the expression of XEN cell-specific genes relates to the formation of XEN cell-specific TAD boundaries. Chromatin contacts at the Sox2 locus exhibit an ESC-specific organisation around binding of pluripotency transcription factors OCT4, NANOG and SOX2, into hubs of high gene activity. The observations detected in in vitro models, were investigated in smaller GAM datasets produced using the in vivo counterparts in the ICM. Overall, in vivo data confirmed the high degree of chromatin rearrangement among the two cell types, specifically in loci of lineage driving genes. The findings from in vivo data further underscore the connection of genome topology and cellular identity.

Im Rahmen der Studien zur Wirkung von Bleinitrat auf die Embryonalstadien des afrikanischen Welses Clarias gariepinus wurde zunächst der Einfluß der Besamung auf den Härtungsprozess des Chorions untersucht, um die Bedeutung des gehärteten Chorions als Schutzfunktion im Hinblick auf Schadstoffeinwirkung zu klären. Das Studium der Embryonalentwicklung war erforderlich, um das Ausmaß der Änderung der Normalentwicklung unter dem Einfluß von Bleinitrat bewerten zu können. Im Rahmen der toxikologischen Untersuchungen der Wirkung des Bleinitrats auf die Embryonalstadien wurden folgende biologische Marker (Biomarker) betrachtet: Änderungen in der Entwicklung und der Schlüpfrate, morphologische und histologische Änderungen, sowie biochemische Veränderungen (Änderungen von Stoffwechsel-Enzymaktivitäten) und molekulare Veränderungen (Erfassung von DNA-Schädigungen). Die Exposition der besamten Eier mit Bleinitrat führte zu einer Verlängerung der Inkubationszeit und zu starken Mißbildungen. Der Rückgang der Häufigkeiten der Mißbildungen mit der Zeit ließ die Annahme zu, daß die mißgebildeten Embryonen starben. Im Gegensatz zu den morphologischen Mißbildungen wurden histopathologische Effekte nur bei Embryonen gefunden, die den höchsten Dosierungen (300 µg/l und 500 µg/l Bleinitrat) ausgesetzt waren. Nach dem Schlupf war das Muster der Enzymaktivitäten nach Exposition mit Bleinitrat uneinheitlich; die Aktivität von G6PDH nahm zu, die von LDH nahm ab und die von PK zeigte unregelmäßige Fluktuationen. Die Embryonalstadien zeigten signifikante Dosis-abhängige Antworten über die Zeit, da das Ausmaß der DNA-Schädigungen signifikant mit den Bleinitrat Konzentrationen anstieg. Vor dem Schlupf konnten bei den Embryonen nach Bleinitrat Exposition keine Änderungen in den Enzymaktivitäten gefunden werden und nur geringe DNA-Schädigungen, d.h die toxischen Effekte waren sehr gering. Eine Erklärung könnte die schützende Wirkung der Eihülle gegenüber Schadstoffen sein. Die gewählten Biomarker stellen sensitive Detektionsmethoden für Bleinitrat dar. So könnten sie sich als sinnvolle Bioindikatoren für Ägypten erweisen, da dort zunehmend Umweltverschmutzung mit Blei und Bleiakkumulation in Lebensmitteln zu verzeichnen ist. / In order to study the embryo-toxic effects of lead nitrate of the African catfish Clarias gariepinus, we first had to study the effect of fertilization on the hardening process of the chorion to clarify the role of the hardened chorion on the protection of the embryo from the pollutants. Also we had to study the embryonic development of C. gariepinus for providing us with a model for comparison when normal patterns of development are altered due the exposure to lead nitrate. The present toxicological work focuses on lead toxicity in different developmental stages of C. gariepinus considering different biological markers (biomarkers) comprising changes in the development and hatching rate, morphological and histological changes, biochemical changes (alteration of metabolic enzymes activity) and molecular changes (monitoring of DNA damage). Exposure of fertilized eggs to lead nitrate prolonged the incubation period and caused severe morphological malformations. Since the frequencies of the morphological malformations decreased with time, we conclude a lethal impact and selected mortality of abnormal embryos. Unlike the morphological malformation, histopathological changes were only recorded in embryos exposed to the highest dosages (300 µg/l and 500 µg/l lead nitrate). In the post-hatching stages, the patterns of the enzymes activities after lead exposure varied, G6PDH increased, LDH decreased and PK showed fluctuations. Embryonic stages revealed significant dose-related DNA damage response over time, since the degree of DNA damage increased significantly with higher lead concentrations. No specific response in the activities of the selected enzymes and low DNA damage were recorded in the pre-hatching stage after exposure to the lead nitrate doses. This means the lead nitrate had a minute toxic effect on the pre-hatched embryos. We conclude that, low susceptibility in pre-hatching stages is most probably a consequence of the chorion, which seems to protect the embryos from a range of external pollutants. The selected biomarkers were sensitive detection methods for low-level toxicity of lead nitrate. Thus, these are useful tools for biomonitoring, urgently required in Egypt with regard to increasing environmental deposition of lead and bioaccumulation in human food recently observed.

Die Lokalisierung von mRNA ist ein wichtiger regulativer Mechanismus in polarisierten Zellen und in frühen Embryonalstadien. Dort sind räumliche Muster maternaler mRNA für die korrekte Entwicklung der Körperachsen und die Spezifizierung der Keimzellen verantwortlich. Systematische Analysen dieser Prozesse wurden jedoch bisher limitiert durch einen Mangel an räumlicher und zeitlicher Auflösung von Einzelzell- Sequenzierungsdaten. Wir analysierten die Dynamik des räumlichen und zeitlichen Transkriptoms während frühen Embryonalstadien von Zebrafischen. Wir verbesserten Empfindlichkeit und Auflösung von tomo-seq und erfassten damit systematisch räumlich aufgelöste Transkriptome entlang der animal-vegetalen-Achse Embryonen im Einzell-Stadium und fanden 97 vegetal lokalisierte Gene. Außerdem etablierten wir eine Hochdurchsatz kompatible Variante der RNA-Markierungsmethode scSLAM-seq. Wir wendeten diese in Embryonen während der Gastrulation. Von den vegetal lokalisierten Genen waren 22 angereichert in Keimzellen, was eine funktionelle Rolle bei der Spezifizierung von Keimzellen nahelegt. Mit tomo-seq untersuchten wir die evolutionäre Konservierung der RNA-Lokalisierung zwischen Zebrafischen und gereiften Oozyten zweier Xenopus-Arten. Wir verglichen die lokalisierten Gene, suchten nach konservierten 3'UTR-Motiven, und fanden zum Teil überlappende Motive, was auf eine mögliche mechanistische Konservierung der Lokalisierungsmechanismen hinweist. Wir untersuchten auch RNA-Editierung von Adenin zu Inosin während der Embryonalentwicklung und in den Organen erwachsener Fische. In im Gehirn exprimierten Transkripten fanden wir 117 Editierstellen, die hauptsächlich für Ionentransporter kodieren und zum Teil zum Menschen konserviert sind. Die höchsten Editierraten konnten wir in Eierstöcken, Hoden und frühen Embryonen nachweisen, was auf eine mögliche Rolle bei der Regulierung der RNA-Stabilität hindeutet. / Subcellular localization of mRNA is an important regulatory mechanism in polarized cells. In early embryos of many species, spatial patterns of maternal mRNA are essential for the proper development of body axes and the specification of germ cells. These processes have been studied in zebrafish, but systematic analyses have been hindered by a lack of spatial and temporal information in single-cell RNA sequencing. We performed a spatial-temporal analysis of the zebrafish transcriptome during early embryonic development to systematically characterize localized mRNA and the fate of maternal transcripts until gastrulation stage. We enhanced sensitivity and resolution of the tomo-seq method and systematically acquired spatially-resolved transcriptomes along the animal-vegetal axis of one-cell stage zebrafish embryos, and found 97 genes to be localized vegetally. Furthermore, we established an in vivo and high-throughput compatible version of the single-cell RNA labeling method scSLAM-seq in gastrulation stage embryos. We followed localized transcripts until gastrulation and found transcripts of 22 of the vegetally localized genes enriched in primordial germ cells. We propose that these genes have a functional role in the early priming of the germ cell fate. To investigate the evolutionary conservation of vegetal RNA localization, we acquired tomo-seq datasets of mature oocytes of two xenopus species. We compared the pools of localized RNA and searched for conserved 3’UTR motifs. The resulting sets showed high similarity, possibly reflecting a mechanistic conservation of localization pathways. We also investigated RNA A-to-I editing during embryonic development and in organs of adult fish. Specifically, we identified 117 recoding editing sites in the brain that mainly encode for ion transporters and are partly conserved in humans. We detected the highest editing levels in ovary, testes and in early embryos, implicating a potential role in regulating RNA stability.