Hohenheim, Univ., Diss., 2007.

In dieser Arbeit wurde die Wirkung der ungesättigten Fettsäure Arachidonsäure, des Endocannabinoids Anandamid und des synthetischen Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN55,212-2 auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 untersucht. Dazu wurden an Xenopus Oozyten, denen die entsprechende Kanal-RNA injiziert wurde, in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme elektrophysiologische Messungen durchgeführt. Zunächst wurden für alle drei Substanzen Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt. Diese führten zu folgenden Ergebnissen: • TASK-1 wird durch WIN55,212-2 um bis zu ca. 81% gehemmt. Die IC50 beträgt 0,83 µM. Anandamid besitzt eine IC50 von 1,92 µM und hemmt den Strom um bis zu ca. 71%. Bei WIN55,212-2 bzw. bei Anandamid liegt mit einem Hill-Koeffizienten (nH) von 1,65 bzw. von 1,42 positive Kooperativität vor. Arachidonsäure hingegen inhibiert den Strom nur um bis zu ca. 63%. Die IC50 beträgt 11,3 µM. Der Hill-Koeffizient von 0,9 ergibt negative Kooperativität. • TASK-3 wird durch alle drei Substanzen deutlich weniger inhibiert. Die maximale Inhibition durch WIN55,212-2 [10µM] beträgt 32,4% (± 9,7). Fünf µM Anandamid bzw. 80 µM Arachidonsäure verursachen eine Hemmung um 32,1% (± 5,4) bzw. um 20,3% (± 5,5). Bei beiden Kanalproteinen wurde außerdem untersucht, welche Bedeutung den Aminosäuren in Position 243-248, die bei TASK-1 und TASK-3 mit Ausnahme einer Aminosäure übereinstimmen, bei der Wirkung von Cannabinoiden zukommt. Dazu wurden Mutationsstudien im Bereich des C-Terminus von TASK-1 und TASK-3 durchgeführt. • Es wurden die sechs Aminosäuren in Position 243-248 aus TASK-1 bzw. TASK-3 entfernt (TASK-1 [243-248] bzw. TASK-3 [243-248]). Die inhibitorische Wirkung von WIN55,212-, Anandamid und Arachidonsäure war bei TASK-1 [243-248] deutlich vermindert, während es bei TASK-3 [243-248] zu unterschiedlichen Effekten kam. • Der gesamte C-Terminus des TASK-1 wurde entfernt, mit Ausnahme der sechs Aminosäuren in Position 243-248. Außerdem wurden die endständigen Aminosäuren RSSV an das Restprotein angefügt, da diese für einen gut funktionierenden Transport in die Membran notwendig sind (TASK-1 [249-390RSSV]. Die Wirkungen von WIN55,212-2, Anandamid und Arachidonsäure entsprachen bei dieser Mutante denen, die beim TASK-1 [Wildtyp] beobachtet wurden. • Durch Punktmutation wurde beim TASK-3 Leucin an Position 247 durch Methionin ersetzt (TASK-3 [L247M]. Diese Mutante besitzt dadurch in Position 243-248 das gleiche Sequenzmotiv wie der TASK-1. Im Vergleich zum TASK-3 [Wildtyp] waren die Wirkungen der Cannabinoide bei dieser Mutante jedoch unverändert. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die untersuchten Cannabinoide eine rezeptorunabhängige, spezifische und reversible inhibitorische Wirkung auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 haben. Die Aminosäuren in Position 243-248 sind für diese Wirkung der Cannabinoide von wesentlicher Bedeutung. / Effects of the fatty acid arachidonic acid, the endocannabinoid anandamide and the synthetic cannbinoid receptor agonist WIN55,212-2 on the two-pore-domain potassium channles TASK-1 and TASK-3 were examined using the Xenopus oocyte expression system. Electrophysiological recordings have been performed with the two-electrode-voltage-clamp technique. At first dose-response relationships between the channel-proteins and the cannabinoids have been performed. All three substances had inhibitory effects on both channels. On TASK-1 WIN55,212-2 showed the strongest inhibition (ca. 81%), followed by anandamide (ca. 71%) and arachidonic acid (ca.63%). The inhibitory effects of all three substances on TASK-3 have been low. Furthermore the C terminus was targeted for mutation in order to examine the importance of the six-residue sequence at position 243-248. TASK-1 and TASK-3 contain nearly the same sequence at this position except only one amino acid. The first mutations performed were TASK-1 [243-248] and TASK-3 [243-248], both lacking the amino acids in position 243-248. The lack of this sequence reduced inhibitory effects of the cannabinoids on TASK-1 [243-248] nearly completely. On TASK-3 [243-248] various effects could be observed. Deletion of the whole C terminus of TASK-1 except the amino-acids in position 243-248 and the terminal motif RSSV, crucial for membrane trafficing (TASK-1 [249-390RSSV], lead to very similar inhibitory effects of the cannabinoids as on TASK-1 [wild-type]. The amino acid leucin of TASK-3 at position 247 has been changed to methionin (TASK-3 [L247M]) in order to construct a mutation of TASK-3 containing the same sequence as TASK-1. The effects of the examined cannabinoids on TASK-3 [L247M] did not differ from those on TASK-3 [wild-type]. These results suggest, that anandamide, arachidonic acid and WIN55,212-2 inhibit the two-pore-domain potassium channels TASK-1 and TASK-3 specific and reversible, independently of receptors. The six-residue sequence at position 243-248 has a basic impact.

Die Volkskrankheit Adipositas zieht eine Reihe von kostenträchtigen Komplikationen mit sich wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 und kardiovaskuläre Erkrankungen. Der Endocannabinoidblocker Rimonabant ist hierbei ein viel versprechendes Medikament, mit dem nicht nur die Adipositas an sich, sondern zusätzlich auch ihre weit reichenden Komplikationen im kardiovaskulären Bereich reduziert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten an Hand 6 Monate alter diabetischer Ratten, welche für 10 Wochen mit Rimonabant behandelt wurden, aufgezeigt werden, dass Rimonabant auf verschiedenste Weise die Initialphase der Atherogenese positiv beeinflusst. Zum einen konnte die Anzahl der zirkulierenden Monozyten signifikant vermindert und auch die für die initiale Rekrutierung von Thrombozyten und Monozyten wichtigen Chemokine RANTES und MCP-1 reduziert werden. Zum anderen zeigten sich positive Effekte auf das Lipidprofil der Probanden. Ein besonderes Augenmerk lag auf dem Aktivitätszustand der Thrombozyten: Mit Rimonabant wurde sowohl die thrombozytäre Aktivierung minimiert als auch ein positiver Einfluss auf die Thrombozytenadhäsion und -aggregation bestätigt. Folglich reduziert Rimonabant das kardiovaskuläre Risiko, indem es die pro-inflammatorischen und pro-atherosklerotischen Kaskaden vermindert. / 6 month old obese Zucker rats were fed with cannabinoid receptor-1 antagonist rimonabant for 10 weeks. We demonstrate positive modulation of circulating monocyte numbers, reduced platelet activation and lower RANTES and MCP-1 levels by Rimonbant in Zucker rats. This may potentially contribute to a reduction of cardiovascular risk.

La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) (enfermedad de Crohn (EC) y Colitis Ulcerosa (CU)), es una enfermedad crónica, poligénica y compleja, de curso recurrente, que afecta al tracto gastrointestinal. Estudios recientes in vitro y modelos experimentales en animales sugieren que el Sistema Endocannabinoide (SE) y la Haptoglobina (Hp) pueden tener un papel protector en la EII. Estudio 1: Sistema Endocannabinoide y EII Se analizó, mediante Western-Blot e inmunohistoquímica, la presencia de los componentes del sistema endocannabinoide (receptores - CB1,CB2-, enzimas de síntesis -DAGL-α/β, NAPE-PLD-, y enzimas de degradación -FAAH y MAGL-) en mucosa de colon de individuos normales, y en pacientes con CU en fase activa, antes de iniciar el tratamiento, y en fase quiescente. Se identificó por primera vez la expresión de todos los componentes del SE en mucosa colónica normal. Como novedades destacan la localización de: CB1 en las células “goblet”; CB2 en las células de Paneth y en los plexos neuroentéricos; FAAH y MAGL en células plasmáticas y polimorfonucleares; enzimas de síntesis en las células epiteliales y en ambos plexos mientéricos. Además, se demostró la presencia de un tono endocannabinoide basal que se modifica en pacientes con CU, tanto en la fase activa como en la fase quiescente: - En pacientes con CU leve-moderada, en fase activa, existe un aumento de la expresión de CB2, cuyos niveles se recuperan en la fase quiescente. - En la fase activa existe una disminución de la expresión de NAPE-PLD, que se recupera en fase quiescente, y un aumento de DAGL-α y MAGL, que se mantienen en la fase quiescente. En conclusión, los componentes del SE se modifican durante la inflamación en la CU , fundamentalmente mediante un aumento de receptores CB2. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos que aumenten el tono endocannabinoide durante la inflamación, podrían ser una nueva vía de investigación en la terapéutica de la EII. Estudio 2: Haptoglobina y EII. La Hp es una proteína con propiedades inmunomoduladoras. Existe un polimorfismo en el gen de la Hp, con 2 alelos: Hp1 y Hp2. El objetivo de este estudio fue investigar el papel genético y funcional de la Hp en la EII. Se genotiparon, utilizando PCR “touch-down", 1061 pacientes con EC , 755 con CU y 452 individuos sanos. La prevalencia de la Hp2 fue mayor en EC y en CU que en los controles. Estos resultados se confirmaron en tríos familiares de EII (464 con EC y 151 con CU), en los que el alelo Hp2 se transmite a los descendientes con mayor frecuencia. Se determinaron además los valores séricos de Hp en 62 individuos sanos. Se observaron valores inferiores en aquellos sujetos con genotipo 22. Se desarrollaron dos modelos murinos de colitis experimental (DSS y OXA) en los que demostró que los ratones KO para el gen de la Hp desarrollaban formas de colitis más graves. Además, en ratones KO para el gen de la Hp, los niveles de mRNA de IL-17, INF-γ, TNF e IL-6 en DSS-colitis y los de IL-13 en OXA-colitis se encontraban elevados. En la DSS-colitis, al añadir IL-23 en los ratones KO para el gen de la Hp, aumentaba significativamente la producción de IL-17. En resumen, el polimorfismo de la Hp está implicado en la susceptibilidad genética a padecer EII, lo que subraya la existencia de mecanismos patogénicos comunes con otras enfermedades de base inmunológica. Además, Hp desempeña un papel en la reducción de la severidad de la inflamación en la colitis experimental y modula la producción de IL-17, por lo que podría tener potenciales aplicaciones terapéuticas en la EII. / Inflammatory Bowel Disease (IBD) (Crohn’s disease (CD) and Ulcerative Colitis (CU)), is a chronic, poligenic, complex and relapsing disease of the gastrointestinal tract. Recent studies in vitro and experimental animal models have suggested a protective role of the Endocannabinoid System (ES) and Haptoglobin in IBD. Study 1: Endocannabinoid system and IBD We examined, using Western-Blotting and immunohistochemistry, the expression of all components of ES (receptors - CB1, CB2-, biosynthesis enzymes -DAGL-α/β, NAPE-PLD-, and degradating enzymes -FAAH y MAGL- in healthy human colonic tissue, and in active UC patients, without any previous treatment, and in quiescent phase. We identified for the first time, the presence of all components of ES in normal colonic tissue. As novelties we pointed out the expression of: CB1 in globlet cells; CB2 in Paneth cells and in neuroenteric plexi; FAAH and MAGL in plasmatic cells and in polymorphonuclear cells; byosynthesis enzymes in epithelial cells and in both mienteric plexi. Besides, we evidenced the presence of a basal endocannabinoid tone modified in UC patients, in active flares as in quiescent phases: - In UC patients with mild-moderate flares, there was an increase in CB2 expression, that returned to normality in the quiescent phase. - In the active phase there was a decrease in NAPE-PLD expression, that recovered in the quiescent phase, and an increase in DAGL-α and MAGL expression, that is maintained in the quiescent phase. In conclusion, the ES components are altered during inflammation in UC, mainly by an increase in CB2 expression. Therefore, the development of new drugs raising the endocannabinoid tone during inflammation may lead to new therapeutical approaches in IBD. Study 2: Haptoglobin and IBD. Hp is a protein with immunomodulatory properties. There is a polymorphism in the Hp gene, with two different alleles: Hp1 and Hp2. The goal of this study was to investigate the role of Hp in IBD, both genetically and functionally. We genotyped, using a “touch-down” PCR, 1061 CD patients, 755 UC patients and 452 healthy individuals. Prevalence of Hp2 was higher in CD and UC patients than in controls. These results were confirmed in IBD trios families (464 CD trios and 151 UC trios) where Hp2 allele was over-transmitted to the affected offspring. We determined serum levels of Hp in 62 healthy controls. Serum Hp values were lower in individuals with genotype 22. We developed two murine models of experimental colitis (DSS and OXA) and we demonstrated that Hp KO mice developed more severe colitis. In Hp KO mice, mRNA levels of IL-17, INF-γ, TNF and IL-6 in DSS-colitis and mRNA levels of IL-13 en OXA-colitis were higher than in WT mice. In DSS-colitis, after adding IL-23, in Hp KO mice production of IL-17 was significantly increased. To summarized, the Hp polymorphism is implicated in genetic susceptibility to IBD, underscoring common pathogenic pathways with other immune-based diseases. Moreover, Hp has a role in reducing the severity of experimental colitis inflammation and it modulates IL-17 production, suggesting potencial therapeutical applications in IBD.

Die adipositasbedingte Insulinresistenz geht mit einer unterschwelligen Entzündungsreaktion einher. Als Antwort auf dieses Entzündungsgeschehen wird PGE2 unter anderem von Kupffer Zellen der Leber freigesetzt und kann seine Wirkung über vier PGE2-Rezeptorsubtypen (EP1-EP4) vermitteln. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass PGE2 in Rattenhepatozyten über den EP3 R ERK1/2-abhängig die intrazelluläre Weiterleitung des Insulinsignals hemmt. Über die Modulation der Insulinrezeptorsignalkette durch andere EP-Rezeptoren war bisher nichts bekannt. Daher sollte in stabil transfizierten Zelllinien, die jeweils nur einen der vier EP-Rezeptorsubtypen exprimierten, der Einfluss von PGE2 auf die Insulinrezeptorsignalkette untersucht werden. Es wurden HepG2-Zellen, die keinen funktionalen EP-Rezeptor aufwiesen, sowie HepG2-Zellen, die stabil den EP1-R (HepG2-EP1), den EP3β-R (HepG2 EP3β) oder den EP4-R (HepG2 EP4) exprimierten, sowie die humane fötale Hepatozytenzelllinie, Fh hTert, die den EP2- und den EP4-R exprimierte, für die Untersuchungen verwendet. Die Zellen wurden für 330 min mit PGE2 (10 µM) vorinkubiert, um die pathophysiologische Situation nachzustellen und anschließend mit Insulin (10 nM) für 15 min stimuliert. Die insulinabhängige Akt- und ERK1/2-Phosphorylierung wurde im Western-Blot bestimmt. In allen Hepatomzelllinien die EP-R exprimierten, nicht aber in der Zelllinie, die keinen EP R exprimierte, hemmte PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung. In allen drei stabil transfizierten Zelllinien, nicht jedoch in den Fh-hTert-Zellen, steigerte PGE2 die basale und insulinstimulierte Phosphorylierung der Serin/Threoninkinase ERK1/2. In den HepG2 EP1- und den HepG2-EP3β-Zellen steigerte PGE2 mutmaßlich über die ERK1/2-Aktivierung die Serinphosphorylierung des IRS, welche die Weiterleitung des Insulinsignals blockiert. Die Hemmung der Aktivierung von ERK1/2 hob in EP3 R-exprimierenden Zellen die Abschwächung der Insulinsignalübertragung teilweise auf. In diesen Zellen scheint die ERK1/2-Aktivierung die größte Bedeutung für die Hemmung der insulinstimulierten Akt-Phosphorylierung zu haben. Da durch die Hemmstoffe die PGE2-abhängige Modulation nicht vollständig aufgehoben wurde, scheinen darüber hinaus aber noch andere Mechanismen zur Modulation beizutragen. In den Fh hTert-Zellen wurde die Insulinrezeptorsignalkette offensichtlich über einen ERK1/2-unabhängigen, bisher nicht identifizierten Weg unterbrochen. Eine gesteigerte PGE2-Bildung im Rahmen der Adipositas ist nicht auf die peripheren Gewebe beschränkt. Auch im Hypothalamus können bei Adipositas Zeichen einer Entzündung nachgewiesen werden, die mit einer gesteigerten PGE2-Bildung einhergehen. Daher wurde das EP R-Profil von primären hypothalamischen Neuronen und neuronalen Modellzelllinien charakterisiert, um zu prüfen, ob PGE2 in hypothalamischen Neuronen die Insulinsignalkette in ähnlicher Weise unterbricht wie in Hepatozyten. In allen neuronalen Zellen hemmte die Vorinkubation mit PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. In der neuronalen hypothalamischen Zelllinie N 41 wirkte PGE2 eher synergistisch mit Insulin. In durch Retinsäure ausdifferenzierten SH SY5Y-Zellen waren die Ergebnisse allerdings widersprüchlich. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Expression der EP Rezeptoren im Verlauf der Kultur stark schwankte und somit die EP R-Ausstattung der Zellen zwischen den Zellversuchen variierte. Auch in den primären hypothalamischen Neuronen variierte die EP R-Expression abhängig vom Differenzierungszustand und PGE2 beeinflusste die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. Obwohl in allen neuronalen Zellen die Akt-Phosphorylierung durch Insulin gesteigert wurde, konnte in keiner der Zellen eine insulinabhängige Regulation der Expression von Insulinzielgenen (POMC und AgRP) nachgewiesen werden. Das liegt wahrscheinlich an dem niedrigen Differenzierungsgrad der untersuchten Zellen. Im Rahmen der Adipositas kommt es zu einer Überaktivierung des Endocannabinoidsystems. Endocannabinoidrezeptoren sind mit den EP Rezeptoren verwandt. Daher wurde geprüft, ob Endocannabinoide die Insulinsignalweiterleitung in ähnlicher Weise beeinflussen können wie PGE2. Die Vorinkubation der N 41-Zellen für 330 min mit einem Endocannabinoidrezeptoragonisten steigerte die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung, was auf einen insulinsensitiven Effekt von Endocannabinoiden hindeutet. Dies steht im Widerspruch zu der in der Literatur beschriebenen endocannabinoidabhängigen Insulinresistenz, die aber auf indirekte, durch Endocannabinoide ausgelöste Veränderungen zurückzuführen sein könnte. / The obesity related insulin resistance is accompanied by a low grade inflammation. In response to inflammatory stimuli, PGE2 is released from Kupffer cells and signals through four G-Protein coupled PGE2-receptors (EP1-EP4). Previous work showed that PGE2 attenuated insulin signaling in rat hepatocytes through an EP3ß- and ERK1/2-dependent mechanism. Since EP-receptor expression on hepatocytes varies between species and physiological conditions, the effect of the individual EP receptor subtypes on insulin signaling was studied in hepatoma cell lines expressing individual EP receptor subtypes. HepG2 cells lacking functional EP-receptors, and derivatives stably expressing either EP1 receptor (HepG2-EP1), EP3ß receptor (HepG2-EP3ß) or EP4 receptor (HepG2-EP4) and Fh-hTert cells expressing EP2- and EP4-receptor were pre-incubated with PGE2 for 330 min to mimic the sub-acute inflammation. The cells were subsequently stimulated with insulin for 15 min. Akt and ERK1/2 activation was determined by Western Blotting with phospho-specific antibodies. PGE2 inhibited insulin stimulated Akt phosphorylation in all cell lines expressing EP receptors, except in HepG2 cells which are lacking functional EP receptors. PGE2 increased insulin stimulated phosphorylation of the serine/threonine kinase ERK1/2 in all EP R expressing HepG2 cell lines except in Fh-hTert cells. In HepG2-EP1 and HepG2 EP3ß cells PGE2 increased the serine phosphorylation of the insulin receptor substrate, presumably through an ERK1/2 activation. This IRS-serine phosphorylation leads to attenuation of insulin signal transduction. Inhibiting ERK1/2 activation with a specific inhibitor attenuated the PGE2-dependent inhibition of insulin signal transmission in HepG2 EP3ß cells to some extent. ERK1/2 activation in these cells seems to be of major importance for the observed attenuation of insulin stimulated Akt phosphorylation. Application of inhibitors in the other cell lines stably expressing EP receptors provided evidence that other mechanisms contributed to the attenuation of insulin signaling. Insulin signal transduction in Fh-hTert cells by PGE2 was apparently blocked by an ERK1/2-independent mechanism. Increased PGE2 production during obesity is not limited to the periphery. Signs of inflammation have been detected in the hypothalamus, which might be associated with an increased PGE2 production. Therefore, the EP receptor profile of primary neurons as well as neuronal cell models was characterised in order to investigate, whether PGE2 attenuates insulin signal transduction in neuronal cells similar to what was observed in hepatocytes. Pre-incubation with PGE2 did not attenuate insulin stimulated Akt phosphorylation in all neuronal cells. The EP receptor profile in SH SY5Y cells and in primary neurons varied depending on the differentiation status of the cells. Although Akt-kinase was phosphorylated in response to insulin stimulation in all neuronal cells studied, gene expression of insulin target genes (POMC, AgRP) was not modulated by insulin. This might be due to the low level of differentiation of the investigated cells. In the course of obesity, an over-activation of the endocannabinoid system is detected. Since endocannabinoid receptors are related to EP receptors, it was investigated whether endocannabinoids can interfere with insulin signaling in a similar way as PGE2. Pre-incubation of the neuronal cell line N 41 for 330 min with an endocannabinoid receptor agonist, increased insulin stimulated Akt phosphorylation. This implies an insulin sensitising effect of endocannabinoids. This is contradictory to the endocannabinoid-dependent insulin resistance described in the literature and might be caused by indirect endocannabinoid-triggered mechanisms.

El sistema endocannabinoide (SEC) está formado por los receptores cannabinoides (CB1 y CB2), los ligandos que se unen a ellos, el 2- araquidonoilglicerol (2-AG) y la anandamida (AEA), y las enzimas responsables del metabolismo de estos lípidos. Estas moléculas están involucradas en mecanismos intracelulares de gran relevancia, teniendo funciones neuromoduladoras y neuroprotectoras. En los últimos años, se ha intensificado el estudio del SEC en la retina, si bien se ha demostrado su presencia y la participación de algunos componentes en la función visual, aún se desconoce su contribución en la respuesta a la luz. La entrada de luz al ojo es censada por las proteínas receptoras ubicadas en los discos del segmento externo de las células fotorreceptoras. A este nivel, se inicia la conversión de la señal lumínica en señal eléctrica, proceso denominado fototransducción. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue el de investigar la presencia del SEC en el segmento externo de los bastones de retinas bovinas (ROS) además de su modulación por el estímulo lumínico fisiológico. Este fue aplicado a la retina directamente o al ROS aislado proveniente de retinas mantenidas en oscuridad. En una primera etapa de este trabajo de Tesis se demostró la presencia de los elementos del SEC (receptores y enzimas metabólicas) en el ROS y cómo era su modulación por luz. Los resultados señalan la presencia de los receptores CB1 y CB2, así como de otros receptores que responden a cannabinoides, GPR55 y TRPV1, además de la principal enzima de síntesis diacilglicerol lipasa (DAGL) y de hidrólisis monoacilglicerol lipasa (MAGL) del 2-AG. Los estudios de las actividades de las enzimas de síntesis (DAGL y la lisofosfatidato fosfohidrolasa (LPAP)) e hidrólisis MAGL muestran su balance en favor del incremento del 2-AG en el ROS de retinas expuestas a la luz, coincidiendo con un aumento en los niveles proteicos de los receptores CB1 y CB2. Además, en esta condición de iluminación el nivel del GPR55 disminuye, no observándose modificaciones en la expresión del TRPV1 en el ROS. Otro hallazgo interesante de esta Tesis Doctoral lo presentan las actividades de las enzimas metabólicas en cuanto a la respuesta a las distintas formas de iluminación. Mientras la DAGL es independiente del momento en que se aplica el estímulo lumínico, la MAGL se estimula sólo cuando la luz se aplica directamente a la retina. Dado que las actividades de DAGL y MAGL se vieron modificadas por la luz, en una segunda etapa de este trabajo de Tesis Doctoral, se evaluó si alguna de las proteínas involucradas en el proceso visual, eran responsables de la modulación de estas actividades. Los resultados sugieren el rol de la transducina y de la PDE y arrestina en la regulación de las actividades de DAGL y de MAGL, respectivamente. Por último, y para establecer el rol del receptores CB1 y del CB2 sobre el propio metabolismo del 2-AG, se evaluó la acción de los agonistas y antagonistas de estos receptores sobre las actividades de síntesis e hidrólisis del 2-AG. Los resultados muestran que la modulación de estos receptores genera una menor disponibilidad del 2-AG a través de la disminución en la actividad de LPAP del ROS. Los resultados alcanzados en este trabajo de Tesis evidencian: i) la participación activa del SEC en el proceso visual y en la adaptación a la luz, ii) la modulación de la disponibilidad del 2-AG por proteínas relacionadas al fenómeno de fototransducción, e iii) la regulación del metabolismo del endocannabinoide a través de la modulación de los receptores a los que el se une con mayor afinidad. / The Endocannabinoid system (SEC) is composed of cannabinoid receptors (CB1, CB2), the ligand that binds to these receptors, 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) and anandamide (AEA), and the enzymes responsible for the metabolism of these lipids. These molecules are involved in highly relevant intracellular mechanisms and they have neuromodulatory as well as neuroprotective functions. The study of the SEC in the retina has been recently intensified. The presence and participation of some components of SEC in the visual function have been demonstrated although their contribution to the response to light is still unknown. The entry of light into the eye is sensed by receptors, which are located in the discs of the outer segment of the photoreceptor cells. The conversion of the light signal into an electrical signal, a process called phototransduction, begins at this level. The principal aim of this Ph. D. Thesis was to study the presence of the SEC in rod outer segments (ROS) from bovine retina photoreceptor cells and its modulation by the physiological stimulus of light. This stimulus was applied to the retina either directly or to isolated ROS from retinas kept in the dark. In a first stage of this Ph. D. Thesis work, both the presence of SEC elements (receptors and metabolic enzymes) in ROS and how they are modulated by light were demonstrated. These results indicate the presence of CB1 and CB2 receptors as well as other receptors that respond to cannabinoids, GPR55 and TRPV1, in addition to the main enzyme of synthesis diacylglycerol lipase (DAGL) and hydrolysis monoacylglycerol lipase (MAGL) of 2-AG. The studies conducted on the activities of the biosynthetic enzymes (DAGL and lysophosphatidate phosphohydrolase (LPAP)) and the hydrolytic enzyme (MAGL) show their balance in favor of the increase of 2-AG in ROS of light-exposed retinas, in agreement with an increase in CB1 and CB2 receptor protein levels. In addition, under this lighting condition, the level of GPR55 decreased, with no changes in the expression of TRPV1 in the ROS. Another interesting finding from this Ph.D. Thesis concerns the activities of the metabolic enzymes relation the response to the different forms of lighting. In this respect, while DAGL is independent of the moment when the light stimulus is applied, MAGL is stimulated only when light is applied directly to the retina. Since DAGL and MAGL activities were modified by light, during the second stage of this Ph.D. Thesis work, it was evaluated if any of the proteins involved in the visual process were responsible for the modulation of these activities. The results collected suggest the role of transducin, and PDE and arrestin in the regulation of DAGL and MAGL activities, respectively. Finally, in order to determine the role of CB1 and CB2 receptors in 2-AG metabolism, the action of agonists and antagonists of these receptors on the synthesis and hydrolysis activities of 2-AG was evaluated. The results collected show that the modulation of these receptors generates a lower availability of 2-AG through the decrease in LPAP activity in ROS. Taken together, the results from this Ph.D. work evidence: i) the active participation of the SEC in the visual process and in the adaptation to light, ii) the modulation of the availability of 2-AG by proteins related to the phenomenon of phototransduction, and iii) the regulation of the endocannabinoid metabolism through the modulation of the receptors to which it binds with greater affinity.

Exposé de la situation : Des études menées sur les animaux démontrent que le système endocannabinoide est important dans le maintien de l’homéostasie de l’énergie et que les effets de sa modulation sont différents selon le sexe et l’exposition à la nicotine. Deux études longitudinales ont étudié l’association entre l’usage du cannabis (UC) et le changement de poids et ont obtenus des résultats contradictoires. L’objectif de ce mémoire est de décrire la modification de l’association entre l’UC et le changement de poids par la cigarette chez les jeunes hommes et femmes. Méthodes : Des donnés de 271 hommes et 319 femmes ont été obtenues dans le cadre de l’étude NICO, une cohorte prospective (1999-2013). L’indice de masse corporelle (IMC) et la circonférence de taille (CT) ont été mesurés à l’âge de 17 et 25 ans. L’UC dans la dernière année et de cigarette dans les derniers trois mois ont été auto-rapportées à 21 ans. Les associations entre l’UC et le changement d’IMC et de CT ont été modélisées dans une régression polynomiale stratifiée par sexe avec ajustement pour l’activité physique, la sédentarité et la consommation d’alcool. Résultats : Uniquement, chez les hommes, l’interaction de l’UC et cigarettes était statistiquement significative dans le model de changement IMC (p=0.004) et celui de changement de CT (p=0.043). L’UC était associé au changement d’adiposité dans une association en forme de U chez les homes non-fumeurs et chez les femmes, et dans une association en forme de U-inversé chez les hommes fumeurs. Conclusion : La cigarette semble modifier l’effet du cannabis sur le changement d’IMC et CT chez les hommes, mais pas chez les femmes. / Background: Animal studies suggest that the endocannabinoid system is a regulator of energy homeostasis, whose effects are modified by sex and nicotine. Two studies in humans have examined the association between cannabis use and change in adiposity, and obtained conflicting results. This thesis aimed to determine if the association between cannabis use and change in adiposity is modified by cigarette smoking in young adults. Methods: Data were available for 271 males and 319 females participating in the Nicotine Dependence In Teens study, a prospective cohort investigation (1999-2013). Body mass index (BMI) and waist circumference (WC) were measured at ages 17 and 25 years. Self-report data on past-year cannabis use and past three-month cigarette smoking were collected at age 21 years. Modification of the association between cannabis use and change in adiposity by cigarette smoking was tested separately in each sex, in polynomial linear regression models controlling for physical activity and sedentary behavior in both sexes, and alcohol use in males only. Results: In males only, the interaction between cannabis use and cigarette smoking was statistically significant in both the model for change in BMI (p=0.004) and the model for change in WC (p=0.043). Cannabis use was associated with change in adiposity in a U-shaped form in females and in non smoking males, and in an inverted U-shaped association in males who smoked more than 10 cigarettes per day. Conclusion: Smoking cigarettes appears to attenuate the association between cannabis use and change in adiposity in young men, but not in young women.

Exposé de la situation : Des études menées sur les animaux démontrent que le système endocannabinoide est important dans le maintien de l’homéostasie de l’énergie et que les effets de sa modulation sont différents selon le sexe et l’exposition à la nicotine. Deux études longitudinales ont étudié l’association entre l’usage du cannabis (UC) et le changement de poids et ont obtenus des résultats contradictoires. L’objectif de ce mémoire est de décrire la modification de l’association entre l’UC et le changement de poids par la cigarette chez les jeunes hommes et femmes. Méthodes : Des donnés de 271 hommes et 319 femmes ont été obtenues dans le cadre de l’étude NICO, une cohorte prospective (1999-2013). L’indice de masse corporelle (IMC) et la circonférence de taille (CT) ont été mesurés à l’âge de 17 et 25 ans. L’UC dans la dernière année et de cigarette dans les derniers trois mois ont été auto-rapportées à 21 ans. Les associations entre l’UC et le changement d’IMC et de CT ont été modélisées dans une régression polynomiale stratifiée par sexe avec ajustement pour l’activité physique, la sédentarité et la consommation d’alcool. Résultats : Uniquement, chez les hommes, l’interaction de l’UC et cigarettes était statistiquement significative dans le model de changement IMC (p=0.004) et celui de changement de CT (p=0.043). L’UC était associé au changement d’adiposité dans une association en forme de U chez les homes non-fumeurs et chez les femmes, et dans une association en forme de U-inversé chez les hommes fumeurs. Conclusion : La cigarette semble modifier l’effet du cannabis sur le changement d’IMC et CT chez les hommes, mais pas chez les femmes. / Background: Animal studies suggest that the endocannabinoid system is a regulator of energy homeostasis, whose effects are modified by sex and nicotine. Two studies in humans have examined the association between cannabis use and change in adiposity, and obtained conflicting results. This thesis aimed to determine if the association between cannabis use and change in adiposity is modified by cigarette smoking in young adults. Methods: Data were available for 271 males and 319 females participating in the Nicotine Dependence In Teens study, a prospective cohort investigation (1999-2013). Body mass index (BMI) and waist circumference (WC) were measured at ages 17 and 25 years. Self-report data on past-year cannabis use and past three-month cigarette smoking were collected at age 21 years. Modification of the association between cannabis use and change in adiposity by cigarette smoking was tested separately in each sex, in polynomial linear regression models controlling for physical activity and sedentary behavior in both sexes, and alcohol use in males only. Results: In males only, the interaction between cannabis use and cigarette smoking was statistically significant in both the model for change in BMI (p=0.004) and the model for change in WC (p=0.043). Cannabis use was associated with change in adiposity in a U-shaped form in females and in non smoking males, and in an inverted U-shaped association in males who smoked more than 10 cigarettes per day. Conclusion: Smoking cigarettes appears to attenuate the association between cannabis use and change in adiposity in young men, but not in young women.