Orientador: Patrícia de Oliveira Prada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T18:26:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Areias_MariaFernandaCondes_D.pdf: 914463 bytes, checksum: a03d2c15dfaa827247604af7078cc199 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A insulina tem efeitos anorexigênicos, reduzindo o peso corporal. Entretanto, a maior parte dos estudos teve como foco a ação e sinalização de insulina no hipotálamo. Assim, o primeiro objetivo do trabalho foi investigar a expressão e grau de fosforilação das proteínas da via de sinalização de insulina (IR/Akt), assim como a modulação da ingestão alimentar após estímulo com insulina na região da amígdala em animais controles. No segundo objetivo, investigamos se o bloqueio farmacológico da via da insulina com LY24002 na amígdala alterou a ingestão alimentar em resposta à insulina. O consumo de dieta hiperlipídica tem sido associado à resistência à insulina no hipotálamo. Assim, o terceiro objetivo foi investigar se a obesidade induz resistência à insulina nessa região e em adição investigar se a via inflamatória IKK/NFkB e o ER stress estavam alterados em amígdala de animais obesos. Obervou-se que após a injeção de insulina na amígdala, não houve diferença no peso corpóreo após 24 horas em animais controles. Em relação à ingestão alimentar, quatro horas após a injeção de insulina na amígdala, não houve diferença, entretanto, após 8, 12 e 24 horas houve uma diminuição na ingestão alimentar em animais controles. Após o bloqueio da PI3q com o inibidor farmacológico LY (240002), trinta minutos antes da injeção de insulina, observou se que a insulina não foi capaz de reduzir a ingestão alimentar. Verificou-se, após a injeção de insulina na região da amígdala, um aumento da fosforilação do receptor de insulina (IR) e da AKT em animais controles. Para confirmação da dissecção da amígdala, testou-se a expressão protéica FKBP5, que é expressa especificamente na região da amígdala. Os animais foram submetidos à dieta hiperlipídica e padrão por 3 meses e realizou-se um ITT (Teste Tolerância Insulina) para verificar a resistência à insulina dos animais. Observou-se que os animais obesos ficaram resistentes à insulina. Em relação ao peso corpóreo, houve um aumento de peso entre os obesos. Já em relação à ingestão alimentar, não houve diferença na ingestão após 4, 8, 12 e 24 horas entre os animais obesos. Após a injeção de insulina na região da amígdala, não se observou diferença na fosforilação da AKT de animais obesos quando comparada ao controle. Observou-se um aumento da fosforilação da JNK, da IKK alfa e beta, além da PERK e IRE1 no grupo submetido à dieta hiperlipídica quando comparada ao controle. Sendo assim, concluí-se que: o controle da ingestão alimentar é realizado, pelo menos em parte, pela ação da insulina na amígdala; e que o efeito da insulina na amígdala é via IR/PI3q/Akt. Os animais obesos apresentam resistência à ação da insulina na amígdala e esta é associada à redução da ativação da via IR/Akt. Acredita-se também que a dieta hiperlipídica aumenta a ativação, na amígdala, de serinas quinases que participam da via inflamatória e do stress do retículo endoplasmático, o que pode justificar a resistência à insulina / Abstract: Insulin has anorexigenic effects, reducing body weight. However most part of the studies has focused on hypothalamic insulin signaling. Thus the aim of the study was too investigated if insulin activates IR/Akt pathway in the amygdale and if this activation controls feeding. Besides this, it was investigated if the inhibition of PI3K by LY294002 alters food intake. In obese animals models insulin induces IR/PI3K/Akt pathway is impaired in the hypothalamus. Low grade inflammation characterized at cellular level by an activation of IKK/IKB/NF-KB pathway and JNK activation, and also induce of endoplasmatic reticulum (ER) stress are molecular mechanisms involved in insulin resistance in the hypothalamus of obese roedents. So, it was investigated if high fat diet impairs insulin signaling and action in the amygdale and if low grade inflammation and ER stress were present in this brain region. Food intake is decreased and IR and Akt phosphorylation were increased in response to insulin in the amygdale of control rats. In order to confirm whether the dissections of amygdale were corrected, the membranes with anti-co-chaperone FK506 binding protein 51 (FKBP5) antibody were re-blotted. FKBP51 is expressed in the amygdale region but not in striatum. It was observed the presence of FKBP5 in their membranes, indicating that the dissections of amygdale were appropriated. The administration of LY prior to insulin in the amygdale abolished this effect and also impaired Akt not IR phosphorylation in response to insulin. Body weight was increased in rats fed with HFD compared to control rats. Insulin tolerance test showed that obese rats were insulin resistant in comparison to control rats. Insulin injected in the amygdale did not decrease food intake after 4, 8, 12, 24 h. The IR and Akt phosphorylation were blunted in rats on HFD. The IKK and JNK phosphorylation were also increased in the amygdale of obese rats. In order to evaluate ER stress, it was investigated whether high fat feeding alters the protein expression of RNA-activated protein kinase-like ER resident kinase (PERK) and inositol-requiring kinase (IRE1). PERK and IRE1 protein expression were increased in the amygdale of rats fed a HFD compared to control rats, suggesting increased ER stress in the amygdale of obese rats Summing up, it was suggested that amygdale is an important region for food intake regulation in response to insulin and this regulation is disrupted in obese rats. It was also shown that food intake is regulated in a PI3K/Akt manner in the amygdale similarly to what occurs in the hypothalamus. Besides, data were provided suggesting that obese rats may have low grade inflammation and ER stress in parallel to insulin resistance in the amygdale / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Ciências

Untersuchungen haben gezeigt, dass unterdurchschnittlich leichte Neugeborene für zahlreiche Erkrankungen ein erhöhtes Risiko tragen. Beschrieben ist unter anderem das vermehrte Auftreten psychosozialer Probleme sowie metabolischer und kardiovaskulärer Spätfolgen. Inzwischen sind zahlreiche mögliche Ursachen einer intrauterinen und postnatalen Wachstumsretardierung beschrieben worden. Unter diesen Ursachen finden sich auch genetische Veränderungen von Proteinen der endokrinologischen Wachstumsregulierung. So wurden Mutationen im GH1 Gen, in Entwicklungsgenen von GH produzierenden Zellen, im IGF-I Gen und schließlich auch im IGF-I Rezeptor Gen identifiziert. Mutationen im letztgenannten Gen stellen den neuesten Forschungszweig dar und wurden bisher weltweit bei lediglich 19 Patienten festgestellt. Mit dieser Arbeit wird ein weiterer Patient mit einer heterozygoten IGF-I Rezeptormutation beschrieben. Neben einer ausführlichen klinischen Beschreibung war die Analyse der Kausalzusammenhänge von Mutation und klinischem Bild Hauptziel dieser Studie. Über eine ausgeprägte intrauterine und postnatale Wachstumsretardierung hinaus präsentierte die betroffene Patientin eine mentale Entwicklungsverzögerung. Durch verschiedene molekularbiologische Methoden konnte eine gestörte intrazelluläre Prozessierung des veränderten Rezeptorproteins nachgewiesen werden. Beobachtet wurde eine fehlende Zelloberflächenexpression aufgrund einer Retention von Rezeptorvorstufen im Endoplasmatischen Retikulum. Damit wurde ein neuer Mechanismus der IGF-I Resistenz beschrieben.

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O melanoma é o tipo de câncer de pele mais letal, apesar de ser o menos incidente. Em virtude de sua alta letalidade e de sua crescente incidência, estudos sobre melanoma são de fundamental importância nos dias de hoje. Assim como células tumorais em geral, células de melanoma apresentam características metabólicas diferenciadas, como, por exemplo, altos níveis de espécies reativas de oxigênio e alta taxa de síntese proteica. Essas modificações no metabolismo dispararam vias de resposta a estresse, como a \"Unfolded Protein Response\" (UPR), contudo, essas células se adaptam a esse estresse constante, que não culmina com a morte das mesmas. Além disso, o padrão de glicosilação em células tumorais também é sabidamente alterado, entre outros motivos, pela expressão diferencial de enzimas da via de glicosilação, como a N-acetilglicosaminiltransferase 5 (MGAT5). Relacionando essas duas características de células de melanoma, propusemo-nos a avaliar se a alta expressão de MGAT5A ( e/ou MGAT5B) funcionaria como uma resposta adaptativa de células de melanoma ao estresse de retículo endoplasmático, e seria, portanto, responsável por manter o equilíbrio diferenciado nessas células. Durante o desenvolvimento desse estudo, foi possível comprovar que a indução de estresse de retículo por meio de tratamento com tunicamicina, um inibidor da N-glicosilação e indutor clássico de UPR, sensibilizou as células de melanoma ao posterior tratamento com cisplatina. Contudo, o tratamento com swainsonina, um inibidor do processamento dos N-glicanos que ocorre no complexo de Golgi, não foi capaz nem de disparar \"Unfolded Protein Response\" nem de induzir morte nessas células e, talvez por esse motivo, não apresentou efeito sensibilizador frente à cisplatina. Além disso, foi observado que as linhagens tumorigênicas apresentam maior expressão de MGAT5A em comparação à linhagem não-tumorigênica melan-a. As tentativas de realização de silenciamento de MGAT5A não foram exitosas. Informações relacionando estresse de retículo e N-glicosilação aberrante em células tumorais ainda serão foco de estudo em nosso grupo. Com os resultados apresentados, é possível concluir que o equilíbrio diferencial dos níveis de estresse de retículo em que se encontram as linhagens tumorigênicas do nosso modelo é importante para a sobrevivência das mesmas. Além disso, é de nosso interesse avaliar a dependência de células tumorais das vias ativadas pela superexpressão de MGAT5A, caso ela realmente exista / Melanoma is the most lethal skin cancer, despite being the least prevalent. Due to its lethality and resistance to a variety of known chemotherapeutic drugs, studies on melanoma are paramount. Tumor cells in general, and melanoma cells particularly, commonly present a disturbed metabolic rate, e.g., altered metabolism of reactive oxygen species and increased rates of protein synthesis. Altogether these perturbations trigger the Unfolded Protein Response (UPR); however, tumor cells are adapted to these conditions and are able to survive. Besides, glycosylation of tumor cells is commonly altered, due to differentiated expression rates of N-glycosylation enzymes, like N-acetylglucosaminyltransferase 5 (MGAT5). Considering these information together, we proposed that the sustained overexpression of MGAT5A (and/or MGAT5B) observed in Tm1 and Tm5 melanoma cells is part of an adaptive response to reticulum stress, maintaining an unstable equilibrium in tumor cells. In this work, we observed that the induction of endoplasmic reticulum stress caused by tunicamycin treatment, a N-glycosylation inhibitor and UPR inducer, sensitized melanoma cells to further cisplatin treatment. In contrast, swainsonine treatment, an inhibitor of Golgi N-glycan processing pathway, did not cause cell death nor UPR signaling, and this may be the reason why this treatment did not sensitize cells to cisplatin treatment. MGAT5A silencing was not successful yet. Altogether, the results above show that the unstable equilibrium under which Tm1 and Tm5 tumor cells are seems necessary for their survival. Therefore, it seems that upon malignant transformation, melanoma cells present dependence of MGAT5A expression. Its our interest exploit this melanoma model to understand the concept of oncogenic dependence for MGAT5A expression in the case of melanomas, if it exists

O melanoma é o tipo de câncer de pele mais letal, apesar de ser o menos incidente. Em virtude de sua alta letalidade e de sua crescente incidência, estudos sobre melanoma são de fundamental importância nos dias de hoje. Assim como células tumorais em geral, células de melanoma apresentam características metabólicas diferenciadas, como, por exemplo, altos níveis de espécies reativas de oxigênio e alta taxa de síntese proteica. Essas modificações no metabolismo dispararam vias de resposta a estresse, como a \"Unfolded Protein Response\" (UPR), contudo, essas células se adaptam a esse estresse constante, que não culmina com a morte das mesmas. Além disso, o padrão de glicosilação em células tumorais também é sabidamente alterado, entre outros motivos, pela expressão diferencial de enzimas da via de glicosilação, como a N-acetilglicosaminiltransferase 5 (MGAT5). Relacionando essas duas características de células de melanoma, propusemo-nos a avaliar se a alta expressão de MGAT5A ( e/ou MGAT5B) funcionaria como uma resposta adaptativa de células de melanoma ao estresse de retículo endoplasmático, e seria, portanto, responsável por manter o equilíbrio diferenciado nessas células. Durante o desenvolvimento desse estudo, foi possível comprovar que a indução de estresse de retículo por meio de tratamento com tunicamicina, um inibidor da N-glicosilação e indutor clássico de UPR, sensibilizou as células de melanoma ao posterior tratamento com cisplatina. Contudo, o tratamento com swainsonina, um inibidor do processamento dos N-glicanos que ocorre no complexo de Golgi, não foi capaz nem de disparar \"Unfolded Protein Response\" nem de induzir morte nessas células e, talvez por esse motivo, não apresentou efeito sensibilizador frente à cisplatina. Além disso, foi observado que as linhagens tumorigênicas apresentam maior expressão de MGAT5A em comparação à linhagem não-tumorigênica melan-a. As tentativas de realização de silenciamento de MGAT5A não foram exitosas. Informações relacionando estresse de retículo e N-glicosilação aberrante em células tumorais ainda serão foco de estudo em nosso grupo. Com os resultados apresentados, é possível concluir que o equilíbrio diferencial dos níveis de estresse de retículo em que se encontram as linhagens tumorigênicas do nosso modelo é importante para a sobrevivência das mesmas. Além disso, é de nosso interesse avaliar a dependência de células tumorais das vias ativadas pela superexpressão de MGAT5A, caso ela realmente exista / Melanoma is the most lethal skin cancer, despite being the least prevalent. Due to its lethality and resistance to a variety of known chemotherapeutic drugs, studies on melanoma are paramount. Tumor cells in general, and melanoma cells particularly, commonly present a disturbed metabolic rate, e.g., altered metabolism of reactive oxygen species and increased rates of protein synthesis. Altogether these perturbations trigger the Unfolded Protein Response (UPR); however, tumor cells are adapted to these conditions and are able to survive. Besides, glycosylation of tumor cells is commonly altered, due to differentiated expression rates of N-glycosylation enzymes, like N-acetylglucosaminyltransferase 5 (MGAT5). Considering these information together, we proposed that the sustained overexpression of MGAT5A (and/or MGAT5B) observed in Tm1 and Tm5 melanoma cells is part of an adaptive response to reticulum stress, maintaining an unstable equilibrium in tumor cells. In this work, we observed that the induction of endoplasmic reticulum stress caused by tunicamycin treatment, a N-glycosylation inhibitor and UPR inducer, sensitized melanoma cells to further cisplatin treatment. In contrast, swainsonine treatment, an inhibitor of Golgi N-glycan processing pathway, did not cause cell death nor UPR signaling, and this may be the reason why this treatment did not sensitize cells to cisplatin treatment. MGAT5A silencing was not successful yet. Altogether, the results above show that the unstable equilibrium under which Tm1 and Tm5 tumor cells are seems necessary for their survival. Therefore, it seems that upon malignant transformation, melanoma cells present dependence of MGAT5A expression. Its our interest exploit this melanoma model to understand the concept of oncogenic dependence for MGAT5A expression in the case of melanomas, if it exists

Mouse polyomavirus is a member and model virus of Polyomaviridae family. In order to infect cells and produce viral progeny, the viral chromosome must be transported to the nucleus. Several studies suggest that virions are transporeted to the endoplasmic reticulum, from which they are transferred to the cytosol with assistace of host proteins. Two of these proteins are the chaperon, BiP (binding immunoglobulin protein) and the cochaperone, DNAJ B14. Polyomaviruses probably enter the nucleus through nuclear pores with the assistence of importins. These processes were mainly studied with SV40. In this work, we show that MPyV infection induces a change in distribution of the DNAJ B14 protein, which became clustered into foci, where it co-localizes with the viral capsid protein, VP1. The occurrence of foci varies during infection. With use of proximity ligation assay, we have shown that during an early fase of MPyV infection, DNAJ B14 and BiP get in the close proximity with VP1. It is suggested that negatively charged amino acids at the N-terminus of the minor capsid protein, VP2, are required for targeting virions to translocon and proteins associated with ERAD. We created MPyV with VP2 mutated in these amino acids. The negatively charged amino acid at position 17 is not necessary for successful...

Untersuchungen haben gezeigt, dass unterdurchschnittlich leichte Neugeborene für zahlreiche Erkrankungen ein erhöhtes Risiko tragen. Beschrieben ist unter anderem das vermehrte Auftreten psychosozialer Probleme sowie metabolischer und kardiovaskulärer Spätfolgen. Inzwischen sind zahlreiche mögliche Ursachen einer intrauterinen und postnatalen Wachstumsretardierung beschrieben worden. Unter diesen Ursachen finden sich auch genetische Veränderungen von Proteinen der endokrinologischen Wachstumsregulierung. So wurden Mutationen im GH1 Gen, in Entwicklungsgenen von GH produzierenden Zellen, im IGF-I Gen und schließlich auch im IGF-I Rezeptor Gen identifiziert. Mutationen im letztgenannten Gen stellen den neuesten Forschungszweig dar und wurden bisher weltweit bei lediglich 19 Patienten festgestellt. Mit dieser Arbeit wird ein weiterer Patient mit einer heterozygoten IGF-I Rezeptormutation beschrieben. Neben einer ausführlichen klinischen Beschreibung war die Analyse der Kausalzusammenhänge von Mutation und klinischem Bild Hauptziel dieser Studie. Über eine ausgeprägte intrauterine und postnatale Wachstumsretardierung hinaus präsentierte die betroffene Patientin eine mentale Entwicklungsverzögerung. Durch verschiedene molekularbiologische Methoden konnte eine gestörte intrazelluläre Prozessierung des veränderten Rezeptorproteins nachgewiesen werden. Beobachtet wurde eine fehlende Zelloberflächenexpression aufgrund einer Retention von Rezeptorvorstufen im Endoplasmatischen Retikulum. Damit wurde ein neuer Mechanismus der IGF-I Resistenz beschrieben.