Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lilian CARLA CARNEIRO Tese.pdf: 936824 bytes, checksum: e49c7ff122a0392ea9e5120fd05064ed (MD5) Previous issue date: 2010-05-31 / A small cryptic plasmid isolated from Salmonella enterica Enteritidis called pVCM04 was sequenced and characterizated. pVCM04 is a 3583 pb circle molecule that showed no homology with other plasmids deposited in the GenBank. 12 ORF with more than 50 aminoacids were predicted using the ORF finder program. ORF1 and ORF2 showed homology with replication proteins of different plasmids. ORF 3-5 showed homology with mobilization proteins present in several plasmids; the others seven ORF showed no homology with genes deposited in GenBank. The pVCM04 possess a region with more than 500 pb that is not associated with none of the predicted proteins. This region is organizated in a G+C rich, A+T rich and two repeat direct sequences. The second repeat direct sequence contains a region of DnaA box connection (TTTACAC). This region is probably associated to the replication origin theta type. The phylogenetic relationship among replicase and mobilization deduced protein showed highest similarity of replicase proteins than mobilization proteins. Conjugation experiments showed that the pVCM04/pUC18 fusion not have a good ability to transfer, the plasmid stability test showed that the cells lost 60% of pVCM04/pUC18 on the first day of cultivation. The characterization suggests that the pVCM04 probably would be a cryptic plasmid from fusion of different ancestral plasmid. / Um pequeno plasmídeo críptico isolado de Salmonella enterica Enteretidis denominado pVCM04 foi sequênciado e caracterizado. O pVCM04 é uma molécula circular com 3583 pb a qual não apresenta homologia com outros plasmídeos depositados no GenBank . 12 ORF ( Open Read Frame ) com mais de 50 aminoácidos foram preditas usando o programa ORFinder. A ORF1 e a ORF2 apresentaram homologia com proteínas de replicação de diferentes plasmídeos. As ORF 3, 4 e 5 apresentaram homologia com proteínas de mobilização presente em vários plasmídeos; as outras sete ORF não apresentaram homologia com genes depositados no GenBank . O pVCM04 possui uma região, com mais de 500 pb, que não está associada a nenhuma das proteínas preditas. Esta região está organizada em uma sequência rica em G+C, A+T e duas sequências repetidas diretas. A segunda sequência repetida direta contém uma sequência de ligação para a proteína DnaA (TTTACAC). Esta região está provavelmente associada com a origem de replicação do tipo theta. As relações filogenéticas para as proteínas deduzidas replicase e de mobilização mostraram maior similaridade para proteínas replicase do que para proteínas de mobilização. Experimentos de conjugação evidenciaram que a fusão pVCM04⁄pUC18 não possui uma boa capacidade de transferência; o teste de estabilidade plasmidial demonstrou que as células perdem 60% do pVCM04⁄pUC18 no primeiro dia de cultivo. A caracterização do pVCM04 sugere que este plasmídeo provavelmente seja um plasmídeo críptico oriundo de diferentes ancestrais.

Cancer immune therapy represents a promising alternative to conventional anti tumour therapy like radiation, surgical excision of the tumour or classical chemotherapy. The biggest advantage of cancer immune therapy is specificity, achieved by targeting tumour-associated antigens with the effector arms of the host immune system. This is believed to result in less adverse effects than standard therapy and reaches presumably also metastatic lesions at distant sites from the primary tumour. However, cancer immune therapy by vaccination against tumour antigens failed to translate into clinical success, yet. Furthermore, despite tremendous clinical efforts malignant disease still results in high mortalities giving rise to the need for novel vaccination-based therapies against cancer. An interesting approach in this respect is the use of bacteria like attenuated salmonellae as carriers for heterologous cancer antigens. In numerous preclinical studies Salmonella-based vaccines could elicit cell mediated immune responses of the CD4+ and CD8+ type against own and heterologous antigens which make them ideally suited for anti tumour therapy. Special delivery systems in Salmonella carriers like surface display or secretion of antigens were shown to be advantageous for the immunological outcome. This work focussed on developing novel Salmonella carriers for immune therapy against cancer. In a first project, TolC, a multifunctional outer membrane protein of E. coli was utilized as membrane anchor for 3 heterologous antigens. Respective TolC fusion proteins encoded on plasmids were analysed for expression, functionality and plasmid stability in different engineered Salmonella strains. The amount of membrane localized recombinant TolC was enhanced in tolC-deficient strains. Furthermore, fusion proteins were functional and plasmid stability was very high in vitro and in vivo. Disappointingly, neither specific CD4+/CD8+ T-cell responses against the model antigen ovalbumin nor CD8+ responses against the cancer antigen BRAFV600E were detectable in murine model systems. However, mice immunized with Salmonella strains displaying an immunodominant epitope of the cancer related prostate specific antigen (PSA) were partially protected from subsequent tumour challenge with a PSA expressing melanoma cell line. Tumour growth in mice immunized with the respective strain was significantly decelerated compared to controls, thus indicating that this surface display system confers protective immunity against tumours. In a second study, the approved typhoid vaccine strain Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a (Ty21a) was improved for the hemolysin type I secretion system of E. coli. This secretion system is widely used for heterologous antigen delivery in live bacterial vaccines. It was demonstrated throughout this work that a mutation of rpoS in Ty21a correlated with decreased ability for hemolysin secretion compared to other Salmonella strains. Complementation with rpoS or the presumed downstream target of rpoS, rfaH resulted in enhanced expression and secretion of heterologous hemolysin in Ty21a. Presumably by raising the amount of free antigen, rfaHcomplemented Ty21a elicited higher antibody titres against heterologous hemolysin in immunized mice than controls and even rpoS-positive Ty21a. Therefore, rfaHcomplemented Ty21a could form the basis of a novel generation of vaccines for human use based on (cancer) antigen secretion. / Krebsimmuntherapie ist eine viel versprechende Alternative zu den konventionellen Therapien, wie Bestrahlung, chirurgische Entfernung des Tumors oder klassische Chemotherapie. Der größte Vorteil der Krebsimmuntherapie ist Spezifität, welche durch das Zielen des Immunsystems auf so genannte Tumor-Assoziierte Antigene erreicht wird. Diese Form der Therapie sollte weniger Nebenwirkungen als Standardbehandlungen beinhalten, weiterhin könnte diese Metastasen an Orten fern des eigentlichen Tumors bekämpfen. Krebsimmuntherapie zeigte sich jedoch wenig erfolgreich in späten klinischen Studien. Zusätzlich ist die Mortalitätsrate bei Krebsleiden, trotz allen Fortschritts, immer noch sehr hoch, weshalb die Notwendigkeit der Entwicklung alternativer Immuntherapien besteht. Ein interessanter Ansatz hierzu ist die Verwendung von Bakterien wie attenuierten Salmonellen als Träger heterologer Krebsantigene. Eine Vielzahl präklinischer Studien zeigte, dass Vakzine auf der Basis von Salmonellen CD4 und CD8 positive zelluläre Immunantworten auslösen können, welche für eine Krebsimmuntherapie entscheidend sind. Spezielle Antigenliefersysteme in Salmonellen, wie die oberflächengebundene Expression oder die Sekretion von Antigenen sind von Vorteil für die Immunogenität der Antigene. Diese Arbeit zielte auf die Entwicklung von neuen Salmonella Trägerstämmen für die Immuntherapie gegen Krebs. Im ersten Projekt wurde TolC, ein multifunktionelles Protein der E. coli Außenmembran, als Membrananker für drei heterologe Antigene benutzt um eine oberflächenassoziierte Expression dieser Antigene zu erreichen. Die entsprechenden plasmidkodierten TolC Fusionsproteine wurden hinsichtlich ihrer Expression, Funktionalität und Plasmidstabilität in verschiedenen, rekombinanten Salmonella Stämmen in vivo und in vitro untersucht. Die Menge an membranständigem rekombinanten TolC war stark erhöht in tolC-deletierten Stämmen. Zusätzlich waren die Fusionsproteine funktionsfähig und die Plasmide wurden in vitro und in vivo äußerst stabil vererbt. Leider konnten weder spezifische CD4+/CD8+ T-Zellantworten gegen das Modelantigen Ovalbumin noch CD8+ Antworten gegen das Krebsantigen BRAFV600E in immunisierten Mäusen detektiert werden. Mäuse, die mit einem Salmonella Stamm immunisiert wurden, der ein immundominantes Epitop des krebsassoziierten Prostata spezifischen Antigens (PSA) in oberflächengebundener Form produziert, waren jedoch partiell vor PSA exprimierenden Melanomzellen geschützt. Das Tumorwachstum in diesen Mäusen verlief signifikant langsamer als in Kontrollgruppen, was indiziert, dass dieses System schützende Immunantworten gegen Krebs auslösen kann. In einem zweiten Projekt wurde der zur Typhusimpfung zugelassene Stamm Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a (Ty21a) für die Hämolysin Sekretion verbessert. Dieses aus E. coli stammende Typ I Sekretionssystem wurde oftmals für die Sekretion von heterologen Antigenen in lebenden bakteriellen Impfstoffträgern verwendet. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Mutation von rpoS in Ty21a mit, im Vergleich zu anderen Salmonellen, verminderter Sekretionsfähigkeit von Hämolysin korreliert. Komplementation von rpoS oder rfaH, einem vermuteten Zielprotein von rpoS in Ty21a, verbesserte die Expression und Sekretion von heterologem Hämolysin. RfaH-rekombinante Salmonellen stimulierten höhere Serumantikörpertiter gegen Hämolysin in immunisierten Mäusen als vergleichbare Kontrollen und sogar rpoS komplementierte Salmonellen, vermutlich durch eine Erhöhung der Menge an freiem Hämolysin. Daher könnte dieser Stamm die Basis einer neuen Generation von Impfstämmen gegen heterologe (Krebs-) Antigene für den humanen Gebrauch bilden.

Konstanz, Univ., Diplomarbeit, 2006.

Techn. Universiẗat, Diss., 2006--München.

No controle da infecção por Salmonella, a correção de fatores de risco tem sido associada a medidas alternativas como a adição de prebióticos às dietas. O mananoligossacarídeo (MOS) é um carboidrato capaz de adsorver bactérias Gram-negativas que possuem fímbria tipo 1, essencial para a colonização do intestino. O presente estudo teve como objetivo: i. avaliar isolados de Salmonella enterica quanto à presença e expressão de fímbria tipo 1 e adsorção ao MOS; ii. avaliar em suínos o efeito do MOS no índice de infecção e excreção de Salmonella; na microbiota entérica e no título de IgA. Um total de 108 isolados de Salmonella, foi avaliado quanto à amplificação dos genes fimA e fimH, hemaglutinação manose-sensível e adsorção ao MOS. Em todos os isolados ambos os genes foram amplificados, 31 expressaram fímbria tipo 1 e, desses, 74,2% adsorveram fortemente ao MOS. Após, 23 suínos desmamados, alocados em grupo tratamento (com MOS) e controle, foram inoculados, com um isolado de S. Typhimurium capaz de adsorver ao MOS, e acompanhados por 28 dias. A quantidade de Salmonella excretada pelos suínos foi baixa, apresentando tendência de menores medianas no grupo tratamento. Não houve diferença significativa no número de infectados nem nas densidades óticas do ELISA IgG e IgA. As amostras de tonsila apresentaram o maior número de isolamentos. Contagens similares de lactobacilos, enterococos e coliformes foram encontradas nos dois grupos. Concluiu-se que a adição de MOS não impediu a infecção dos suínos por Salmonella, porém houve uma tendência de menor excreção no grupo tratado. / In the control of Salmonella infection, correction of risk factors has been associated with alternative measures such as the addition of prebiotics to diets. Mannanoligosaccharide (MOS) is a complex carbohydrate, able to adsorb Gram-negative bacteria that possess type-1 fimbriae, essential for colonization of the intestine. This study aimed to: i, evaluate isolates of Salmonella enterica, the presence and expression of type-1 fimbriae, and agglutination with MOS; and ii, evaluate in pigs the effect of MOS on the rate of infection and excretion of Salmonella, and enteric microbiota and Salmonella IgA titers. A total of 108 strains of Salmonella sp. isolated from carrier pigs were evaluated for the amplification of fimA and fimH genes, agglutination with MOS and hemagglutination. In all strains tested, amplicons of the expected size were detected, 31 expressing type-1 fimbriae; and of these, 74.2% showed a strong agglutination to MOS. A total of 23 weaned pigs were allotted to a treatment group (with MOS) and a control group, were inoculated with a strain of S. Typhimurium able to adsorb to the MOS, and were evaluated for 28 days. The amount of Salmonella excreted by the pigs was low, showing a trend toward a lower median in the treated group. The ELISA IgG and IgA optical density of both groups showed no significant difference. In our study, the tonsils contributed to the highest rate of Salmonella isolation. The medians of coliforms, enterococci and lactobacilli were similar throughout the experiment in both groups. It was concluded that the addition of MOS did not affect the infection of pigs by Salmonella, although the excretion rate was lower in the treated group.

No controle da infecção por Salmonella, a correção de fatores de risco tem sido associada a medidas alternativas como a adição de prebióticos às dietas. O mananoligossacarídeo (MOS) é um carboidrato capaz de adsorver bactérias Gram-negativas que possuem fímbria tipo 1, essencial para a colonização do intestino. O presente estudo teve como objetivo: i. avaliar isolados de Salmonella enterica quanto à presença e expressão de fímbria tipo 1 e adsorção ao MOS; ii. avaliar em suínos o efeito do MOS no índice de infecção e excreção de Salmonella; na microbiota entérica e no título de IgA. Um total de 108 isolados de Salmonella, foi avaliado quanto à amplificação dos genes fimA e fimH, hemaglutinação manose-sensível e adsorção ao MOS. Em todos os isolados ambos os genes foram amplificados, 31 expressaram fímbria tipo 1 e, desses, 74,2% adsorveram fortemente ao MOS. Após, 23 suínos desmamados, alocados em grupo tratamento (com MOS) e controle, foram inoculados, com um isolado de S. Typhimurium capaz de adsorver ao MOS, e acompanhados por 28 dias. A quantidade de Salmonella excretada pelos suínos foi baixa, apresentando tendência de menores medianas no grupo tratamento. Não houve diferença significativa no número de infectados nem nas densidades óticas do ELISA IgG e IgA. As amostras de tonsila apresentaram o maior número de isolamentos. Contagens similares de lactobacilos, enterococos e coliformes foram encontradas nos dois grupos. Concluiu-se que a adição de MOS não impediu a infecção dos suínos por Salmonella, porém houve uma tendência de menor excreção no grupo tratado. / In the control of Salmonella infection, correction of risk factors has been associated with alternative measures such as the addition of prebiotics to diets. Mannanoligosaccharide (MOS) is a complex carbohydrate, able to adsorb Gram-negative bacteria that possess type-1 fimbriae, essential for colonization of the intestine. This study aimed to: i, evaluate isolates of Salmonella enterica, the presence and expression of type-1 fimbriae, and agglutination with MOS; and ii, evaluate in pigs the effect of MOS on the rate of infection and excretion of Salmonella, and enteric microbiota and Salmonella IgA titers. A total of 108 strains of Salmonella sp. isolated from carrier pigs were evaluated for the amplification of fimA and fimH genes, agglutination with MOS and hemagglutination. In all strains tested, amplicons of the expected size were detected, 31 expressing type-1 fimbriae; and of these, 74.2% showed a strong agglutination to MOS. A total of 23 weaned pigs were allotted to a treatment group (with MOS) and a control group, were inoculated with a strain of S. Typhimurium able to adsorb to the MOS, and were evaluated for 28 days. The amount of Salmonella excreted by the pigs was low, showing a trend toward a lower median in the treated group. The ELISA IgG and IgA optical density of both groups showed no significant difference. In our study, the tonsils contributed to the highest rate of Salmonella isolation. The medians of coliforms, enterococci and lactobacilli were similar throughout the experiment in both groups. It was concluded that the addition of MOS did not affect the infection of pigs by Salmonella, although the excretion rate was lower in the treated group.

Submitted by RODOLFO DOS SANTOS CARRIJO null (rodolfo_carrijo@hotmail.com) on 2018-03-11T15:22:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Rodolfo dos Santos Carrijo.pdf: 2813521 bytes, checksum: fa8e9b21bc15dbfbb018be6a2c56a5e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-03-13T17:53:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carrijo_rs_me_araiq.pdf: 2778305 bytes, checksum: 00ef39cdf6ae435c0ced83a90aa10053 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-13T17:53:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carrijo_rs_me_araiq.pdf: 2778305 bytes, checksum: 00ef39cdf6ae435c0ced83a90aa10053 (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Sistemas toxina-antitoxina (TA) são tipicamente formados por dois genes que codificam uma toxina estável e uma antitoxina lábil. Esses módulos genéticos são diversos e abundantes em procariotos, sendo agrupados em seis tipos (I à VI) com base na natureza da antitoxina e no seu modo de interação com a toxina. O sistema TA GhoT/GhoS (tipo V) foi identificado em Escherichia coli, estando implicado no fenômeno de persistência celular (tolerância temporária à antibióticos). Embora a antitoxina desse sistema (GhoS) tenha sido bem caracterizada, os detalhes que envolvem a estrutura e os mecanismos de ação da toxina GhoT ainda não foram totalmente esclarecidos, sendo apenas demonstrado que a molécula in vivo ocasiona a formação de poros na membrana plasmática bacteriana, interrompendo a produção de ATP. Dessa maneira, considerando o potencial biotecnológico dos sistemas TA como alvos para o desenho de novos bactericidas, o presente trabalho caracterizou funcional e estruturalmente a proteína GhoT de Salmonella enterica e peptídeos derivados com capacidade de interação com membranas biológicas. Para isso, após a obtenção da sequência de aminoácidos da GhoT de S. enterica por BLAST e de sua predição estrutural in silico, a proteína e seus derivados (HN e HC) foram sintetizados pelo método químico em fase sólida, sendo purificados por cromatografia líquida de alta eficiência e identificados por espectrometria de massas. Em seguida, a capacidade de estruturação das moléculas foi avaliada com o auxílio da espectroscopia de dicroísmo circular. Já as suas funções foram investigadas através de ensaios de permeabilização de vesículas lipídicas, expressão heteróloga em bactéria e atividade antimicrobiana. Coletivamente, os estudos demonstraram que os polipeptídeos estão predominantemente enovelados em α-hélice, confirmando a modelagem estrutural realizada. Além disso, constatou-se que as moléculas conservam a mesma atividade lítica verificada para a toxina GhoT de E. coli, destacando-se o peptídeo HN. Ademais, os polipeptídeos foram tóxicos para bactérias tanto intracelularmente (quando expressos heterologamente) quanto extracelularmente (quando adicionados ao meio de cultura). Assim, além de apontar uma possível relação entre o produto do gene ghoT de S. enterica e a formação de células persistentes no gênero Salmonella, os resultados alcançados exibem o potencial uso das moléculas como modelos para o desenvolvimento de novos antibióticos. / Toxin-antitoxin (TA) systems are typically formed by two genes encoding a stable toxin and a labile antitoxin. These genetic modules are diverse and abundant in prokaryotes and are grouped into six types (I to VI) based on the nature of the antitoxin and its mode of interaction with the toxin. The TA GhoT/GhoS system (type V) was identified in Escherichia coli, being implicated in the phenomenon of cell persistence (temporary tolerance to antibiotics). Although the antitoxin of this system (GhoS) has been well characterized, the details surrounding the structure and mechanisms of action of the GhoT toxin have not yet been fully elucidated, and it has only been shown that the molecule in vivo causes the formation of pores in the bacterial plasma membrane, disrupting the production of ATP. In this way, taking into account the biotechnological potential of TA systems as targets for the design of new bactericides, the present work characterized the GhoT protein of Salmonella enterica and derived peptides with interaction capacity with biological membranes. After obtaining the amino acid sequence of S. enterica GhoT by BLAST and its in silico structural prediction, the protein and analogues (HN and HC) were synthesized by the solid phase chemical method and were isolated by high performance liquid chromatography and identified by means of mass spectrometry. Then, the conformations of the molecules were evaluated with the help of circular dichroism (CD) spectroscopy. Its functions were investigated through lipid vesicle permeabilization assays, heterologous expression in bacteria and antimicrobial activity. Thus, collectively, the information revealed by the studies demonstrated that the polypeptides are predominantly anchored in α-helix, confirming the structural modeling performed. In addition, it was observed that the molecules retain the same lytic activity verified for the E. coli GhoT toxin, especially the HN peptide. In addition, polypeptides were toxic to bacteria both intracellularly (when expressed heterologously) and extracellularly (when added to the culture medium). Therefore, in addition to pointing out a possible relationship between the product of the S. enterica ghoT gene and the formation of persistent cells in the Salmonella genus, the results show the potential use of the molecules as models for the development of new antibiotics. / CNPq: 131219/2016-2

No controle da infecção por Salmonella, a correção de fatores de risco tem sido associada a medidas alternativas como a adição de prebióticos às dietas. O mananoligossacarídeo (MOS) é um carboidrato capaz de adsorver bactérias Gram-negativas que possuem fímbria tipo 1, essencial para a colonização do intestino. O presente estudo teve como objetivo: i. avaliar isolados de Salmonella enterica quanto à presença e expressão de fímbria tipo 1 e adsorção ao MOS; ii. avaliar em suínos o efeito do MOS no índice de infecção e excreção de Salmonella; na microbiota entérica e no título de IgA. Um total de 108 isolados de Salmonella, foi avaliado quanto à amplificação dos genes fimA e fimH, hemaglutinação manose-sensível e adsorção ao MOS. Em todos os isolados ambos os genes foram amplificados, 31 expressaram fímbria tipo 1 e, desses, 74,2% adsorveram fortemente ao MOS. Após, 23 suínos desmamados, alocados em grupo tratamento (com MOS) e controle, foram inoculados, com um isolado de S. Typhimurium capaz de adsorver ao MOS, e acompanhados por 28 dias. A quantidade de Salmonella excretada pelos suínos foi baixa, apresentando tendência de menores medianas no grupo tratamento. Não houve diferença significativa no número de infectados nem nas densidades óticas do ELISA IgG e IgA. As amostras de tonsila apresentaram o maior número de isolamentos. Contagens similares de lactobacilos, enterococos e coliformes foram encontradas nos dois grupos. Concluiu-se que a adição de MOS não impediu a infecção dos suínos por Salmonella, porém houve uma tendência de menor excreção no grupo tratado. / In the control of Salmonella infection, correction of risk factors has been associated with alternative measures such as the addition of prebiotics to diets. Mannanoligosaccharide (MOS) is a complex carbohydrate, able to adsorb Gram-negative bacteria that possess type-1 fimbriae, essential for colonization of the intestine. This study aimed to: i, evaluate isolates of Salmonella enterica, the presence and expression of type-1 fimbriae, and agglutination with MOS; and ii, evaluate in pigs the effect of MOS on the rate of infection and excretion of Salmonella, and enteric microbiota and Salmonella IgA titers. A total of 108 strains of Salmonella sp. isolated from carrier pigs were evaluated for the amplification of fimA and fimH genes, agglutination with MOS and hemagglutination. In all strains tested, amplicons of the expected size were detected, 31 expressing type-1 fimbriae; and of these, 74.2% showed a strong agglutination to MOS. A total of 23 weaned pigs were allotted to a treatment group (with MOS) and a control group, were inoculated with a strain of S. Typhimurium able to adsorb to the MOS, and were evaluated for 28 days. The amount of Salmonella excreted by the pigs was low, showing a trend toward a lower median in the treated group. The ELISA IgG and IgA optical density of both groups showed no significant difference. In our study, the tonsils contributed to the highest rate of Salmonella isolation. The medians of coliforms, enterococci and lactobacilli were similar throughout the experiment in both groups. It was concluded that the addition of MOS did not affect the infection of pigs by Salmonella, although the excretion rate was lower in the treated group.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-30T12:16:36Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2727260 bytes, checksum: 31158917bcec0d8108896d64e8eca79d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-30T12:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2727260 bytes, checksum: 31158917bcec0d8108896d64e8eca79d (MD5) Previous issue date: 2017-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Salmonella é um dos principais patógenos que causam infecções relacionadas ao consumo de alimentos contaminados. Salmonella enterica sorotipo Enteritidis (Salmonella Enteritidis) é mais comumente associado a surtos clínicos em vários países, incluindo no Brasil. Por meio do mecanismo de quorum sensing (QS), esse patógeno é capaz de coordenar seu perfil de expressão gênica com a densidade populacional. O mecanismo de QS mediado pelo autoindutor-1 (AI-1) acil homoserina lactona (AHL) em Salmonella é incompleto, uma vez que não há síntese dessa molécula. Entretanto, esse patógeno é capaz de detectar AHLs produzidas por outras espécies e regular funções celulares. Neste trabalho, foi avaliada a influência de n-dodecanoilhomoserina lactona (C12-HSL) no consumo de glicose e no metabolismo de Salmonella Enteritidis PT4 578 cultivada em condições anaeróbias. A análise do sobrenadante do meio de cultura de Salmonella por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) revelou que a absorção de glicose após 4 e 6 h de cultivo na presença de 50 nmol L -1 de C12-HSL foi 26 e 29% menor, respectivamente, do que o constatado na ausência de C12-HSL. Este AI-1 também influenciou na abundância de alguns metabólitos intracelulares, analisados em cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas (GC-MS). Os metabólitos detectados estão relacionados com as vias de metabolismo de glicerolipídios, purinas, aminoácidos e biossíntese de aminoacil-tRNA. A análise do sobrenadante por cromatografia líquida de ultra desempenho acoplada a um sistema de espectrômetro de massa do tipo triploquadrupolo (UPLC-QqQ /MS) revelou que houve aumento de 1,64 vezes na concentração de C12-HSL até 7 h no meio de cultura em que essa molécula foi adicionada. Os dados obtidos demonstraram a influência de C12-HSL exógena no metabolismo de Salmonella Enteritidis PT4 578 e, além disso, evidenciaram uma possível síntese de C12-HSL por este patógeno. Por se tratar de resultado ainda não observado anteriormente, esta informação deverá ser confirmada por análises futuras. / Salmonella is one of the major pathogens that cause infections related to the consumption of contaminated food. Salmonella enterica serotype Enteritidis (Salmonella Enteritidis) is most commonly associated with clinical outbreaks in several countries, including Brazil. By means of the quorum sensing (QS) mechanism, this pathogen is able to coordinate its gene expression profile with the population density. The mechanism of QS mediated by the autoinducer-1 (AI-1) acyl homoserine lactone (AHL) in Salmonella is incomplete as there is no synthesis of this molecule. However, this pathogen is capable of detecting AHLs produced by other species and regulating cellular functions. In this work, the influence of n-dodecanoilhomoserine lactone (C12-HSL) on glucose consumption and the metabolism of Salmonella Enteritidis PT4 578 cultured under anaerobic conditions was evaluated. Supernatant analysis of the Salmonella culture medium by high performance liquid chromatography (HPLC) showed that glucose uptake after 4 and 6 h of cultivation in the presence of 50 nmol L -1 C12-HSL was 26 and 29% lower, respectively, than that found in the absence of C12-HSL. This AI-1 also influenced the abundance of some intracellular metabolites, analyzed in gas chromatograph coupled to mass spectrometer (GC-MS). The metabolites detected are related to glycerolipid, purine, amino acid and aminoacyl-tRNA biosynthesis pathways. Analysis of the supernatant by ultra-performance liquid chromatography coupled to a triple- quadrupole mass spectrometer system (UPLC-QqQ / MS) revealed that there was a 1.64-fold increase in C12-HSL concentration up to 7 h of cultivation in the culture medium in that this molecule was added. The data obtained demonstrated the influence of exogenous C12-HSL on the metabolism of Salmonella Enteritidis PT4 578 and, in addition, evidenced a possible synthesis of C12-HSL by this pathogen. As this result was not previously observed, this information should be confirmed by future analyzes.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Cryptosporidium sp. y Salmonella enterica son dos agentes zoonóticos que producen infección intestinal, siendo transmitidos por la vía fecal-oral, donde tanto el agua como los alimentos juegan un rol epidemiológico importante. Ambos patógenos, han sido detectados en aguas marinas y se ha determinado que infectan a mamíferos marinos en distintas partes del mundo, no existiendo antecedentes nacionales relacionados. Con el objetivo de detectar estos patógenos en pinnípedos de Chile, en este estudio se tomaron muestras a partir de tórulas rectales y heces frescas de animales provenientes de distintas regiones del país, albergados en el centro de rehabilitación de Buin Marino. En dos de las muestras obtenidas a partir de lobos marinos comunes (Otaria flavescens) se aisló S. enterica, lo que constituye la primera evidencia de su presencia en pinnípedos de nuestras costas. No se detectó Cryptosporidium sp. en ninguna de las muestras analizadas, requiriéndose nuevos estudios para dilucidar la presencia de este agente en animales marinos de nuestro país / Proyecto FIV 19102003