Les écosystèmes aquatiques soumis à des pressions anthropiques sont des lieux d'évolution rapide des communautés microbiennes. Cet environnement participe certainement à l'émergence d'agents infectieux résistants aux antibiotiques. La ville de Montpellier est située dans un petit bassin versant qui subit d’une part des épisodes de pluies brutales et d’autre part de fortes pressions démographiques. Le principal hôpital est situé dans une zone de ruissellement comprenant deux petites rivières urbaines provenant d'eaux souterraines karstiques à quelques kilomètres en amont. L’objectif de cette étude est d'explorer les communautés bactériennes dans les rivières urbaines qui coulent près du centre hospitalier afin d'évaluer l'influence des ruissellements sur la résistance aux antibiotiques dans les communautés bactériennes. Les communautés bactériennes sont également décrites dans les aquifères karstiques en amont. Une section introductive présente les méthodes disponibles pour l'étude de la résistance aux antimicrobiens dans l'environnement et une revue de la littérature expose les données actuelles sur la résistance aux antibiotiques dans l’eau de ruissellement urbain. Cette partie justifie les stratégies expérimentales. La méthode développée ici, appelée détermination de la concentration inhibitrice à l’échelle de la communauté bactérienne (c-IC, pour community inhibitory concentration), est combinée à une description de la richesse taxonomique pour donner une description instantanée des communautés bactériennes résistantes dans les environnements aquatiques. Une stratégie dérivée de l'approche c-IC permet d'explorer la résistance bactérienne dans le système hydrologique urbain près de l'hôpital et dans les aquifères karstiques. Les données microbiologiques recueillies sont complétées par des données hydrologiques, hydrogéologiques, climatiques et physico-chimiques.L'impact de très faibles concentrations d'antibiotiques sur la structure de la communauté bactérienne dans divers environnements hydriques a été démontré et apparaît comme un indicateur de la vulnérabilité des écosystèmes face aux pressions antimicrobiennes. Le répertoire taxonomique des communautés fluviales urbaines a été décrit et sa dynamique a été confrontée aux conditions environnementales. Le voisinage des hôpitaux augmente significativement la prévalence des bactéries résistantes par rapport à une zone urbaine similaire éloignée de l'hôpital. Des bactéries d’intérêt médical résistantes aux céphalosporines et aux carbapénèmes ont été isolées. De façon surprenante, un Escherichia coli producteur de NDM-5, pathogène émergeant hautement résistant, a été signalé pour la première fois dans une rivière française. Le clone a été détecté dans deux échantillons indépendants montrant sa persistance. Le gène blaNDM-5 et son environnement génétique ont été décrits sur un plasmide IncX3 transférable, indiquant un transfert génétique horizontal possible. La résistance aux antimicrobiens dans l'eau souterraine karstique a varié dans le temps et dans l'espace et est difficilement comparable à celle décrite dans les rivières associées. En milieu urbain, la qualité de l'eau et le risque infectieux sont généralement évalués sur les eaux usées et les effluents des stations d'épuration. Cette étude montre que les eaux de ruissellement dans des zones urbanisées contribuent à l'émergence et à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens. Compte tenu de l'épidémiologie inquiétante des maladies infectieuses, cette étude invite à explorer les potentiels réservoirs environnementaux de bactéries résistantes afin de compléter les connaissances sur le cycle épidémiologique de la résistance aux antimicrobiens et essayer de l’interrompre ou de le ralentir. / Aquatic ecosystems subjected to anthropic pressures are places of rapid evolution of microbial communities. They are likely hotspots for emergence of infectious disease agents resistant to antibiotics. The city of Montpellier is located in a small watershed that undergoes brutal rainfall episodes and strong demographic pressures. A hospital is located in a runoff area including two small urban rivers originating from karstic groundwater few kilometers upstream. The aim of the study is to explore bacterial communities in urban rivers flowing near hospital settings in order to evaluate the influence of runoffs on antibiotics resistance in the bacterial communities. Bacterial communities are also described in upstream karstic aquifers.An introductive section presents the methods available for studying antimicrobial resistance in environment and then reviews comprehensively bibliography on antibiotics resistance in urban runoffs. This part supports the experimental strategies. The method developed herein, called community Inhibitory Concentration (c-IC) determination is combined to taxonomic richness description to provide a tool that gives a rapid snapshot of resistant bacterial communities in aquatic environments. A strategy derived from c-IC approach allows the exploration of bacterial resistance in the urban hydrologic system near the hospital and in karstic aquifers. The collected microbiological data has been completed by hydrological, hydrogeological, climatic and physico-chemical data.The impact of very low concentration of antibiotics on the bacterial community structure in various water bodies was demonstrated and appeared as an indicator of the vulnerability of ecosystems to antimicrobial pressures. The taxonomic repertory of the urban river communities was described and its dynamics was compared to environmental conditions. Hospital vicinity significantly increase the prevalence of resistant bacteria compared to a similar urban area remote from hospital. Diverse clinically relevant cephalosporins and carbapenems resistant bacteria have been isolated. Surprisingly, a NDM-producing Escherichia coli, which is a highly resistant and emerging pathogen was reported for the first time in a French River. The clone was detected in two independent sampling showing its persistence. The blaNDM-5 gene and its surrounding sequences were described on a transferable IncX3 plasmid, indicating possible genetic transfer to other bacteria. The antimicrobial resistance in karst groundwater varied in time and space and was hardly compared with that described in related rivers.In urban settings, water quality and infectious risk is generally assessed on sewers and wastewater treatment plants effluents. This study shows that runoff waters in urbanized area contribute to the emergence and dissemination of antimicrobial resistance. Considering the worrisome epidemiology of infectious diseases, it urges to decipher all environmental reservoirs for resistant bacteria in order to complete knowledges about the epidemiological cycle of antimicrobial resistance and try to break or slow down it.

Einleitung: Das Auftreten von multiresistenten Bakterien in der Bevölkerung und in Kran-kenhäusern sowie in der Tierhaltung hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen. Die weltweite Zunahme multiresistenter gramnegativer Bakterien, insbesondere Entero-bakterien wie Klebsiella (K.) pneumoniae und Escherichia (E.) coli, gibt Anlass zu wach-sender Besorgnis und ist Gegenstand zahlreicher Studien. Ziele der Untersuchungen: Im Rahmen der vorliegenden Studie sollte die Prävalenz von Extended-Spectrum-Beta-Lactamase (ESBL)-produzierenden Enterobakterien (ESBL-E) bei Milchkälbern untersucht und Risikofaktoren für deren Auftreten unter Verwendung von Daten zu Antibiotikaeinsatz, Betriebshygiene und Tiergesundheit identifiziert werden. Tiere, Material und Methoden: Zehn Betriebe mit einem Median von 781 Milchkühen (319-1701) nahmen an der Studie Teil. Die Betriebe wurden zweimal im Abstand von 7-11 Monaten besucht und Kotproben von jeweils 10 neugeborenen Kälbern gesammelt. Alle untersuchten Kälber waren jünger als zwei Wochen mit einem Durchschnittsalter von 6,8 (±3,9) Tagen. Die Kotproben wurden 1:10 verdünnt und im Doppelansatz auf Brilli-anceTM ESBL-Agar plattiert. Nach 24 Stunden bei 37 °C wurden die Kolonien gezählt und die Gesamtanzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu)/ml berechnet. Die Bakterien-spezies wurde biochemisch identifiziert. Die ESBL-Produktion wurde mittels MICRONAUT-S β-Lactamase-Platten phänotypisch bestätigt. Zusätzlich wurden weitere Resistenztest mit der VITEK® 2 Technologie durchgeführt. Die Bestimmung der Phy-logruppen der E. coli-Isolate und das Screening auf bla-Gene wurde mittels PCR durch-geführt. Der Hygienestatus der Betriebe wurde mit Hilfe eines standardisierten Fragebo-gens erfasst und bewertet und Daten zu Tiergesundheit und Antibiotikaeinsatz wurden über Tier-Scoring und das Herdemanagementprogramm gesammelt. Ergebnisse: ESBL-E konnten in allen Betrieben und 96,5 % der Kotproben nachgewiesen werden. Der dominierende Anteil der ESBL-produzierenden Isolate waren E. coli (92,9 %), gefolgt von Enterobacter (E.) cloacae (5,1 %) und K. pneumoniae subsp. pneumoniae (2,0 %). Die Mehrheit der E. coli-Isolate wurde eindeutig der Phylogruppe C zugeordnet (25,0 %), gefolgt von den Phylogruppen A (15,2 %) und E (14,1 %). Die CTX-M-Gruppe 1 wurde am häufigsten nachgewiesen (80,4 %). Neben der Resistenz gegenüber Penicillinen und Cephalosporinen war die Mehrheit der Isolate zusätzlich ge-genüber einer oder mehrerer weiterer Substanzklassen resistent, wobei ein hoher Anteil gegenüber Fluorchinolonen resistent war. 52,5 % der Isolate wurden außerdem als drei-fach multiresistente gramnegative Bakterien (3MRGN) gemäß der Kommission für Kran-kenhaushygiene und Infektionsprävention charakterisiert. Keines der Isolate war 4MRGN, d.h. keines zeigte eine Carbapenem-Resistenz. Penicilline wurden bei Kälbern in den meisten Betrieben am häufigsten verabreicht und stellten auf Herdenebene in al-len Betrieben die vorherrschende Substanzklasse dar. Insgesamt war die Anzahl der Kälber, die vor der Probenahme behandelt wurden, eher gering (11,7 %). Analysen der Daten zum Betriebsmanagement ergaben Schwächen bei der Biosicherheit und der Rei-nigung und Desinfektion. Neben Beta-Laktam-Antibiotika als den am häufigsten verwen-deten Antibiotika konnten keine weiteren Risikofaktoren identifiziert werden. Schlussfolgerungen: Die Prävalenz von ESBL-E in unserer Studie war außergewöhnlich hoch. Obwohl die Prävalenz mit zunehmendem Alter der Rinder nachgewiesenermaßen abnimmt, sollten unsere Ergebnisse Anlass zur Entwicklung von Strategien sein, die den Eintrag von ESBL-E in das Kälberaufzuchtsystem frühzeitig verhindern. Dies können beispielsweise der verantwortungsbewusste Einsatz antibiotischer Trockensteller und ei-ne sorgfältige Hygiene in Abkalbeboxen und Kälberställen sein. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den/die Eintrittspunkt(e) von ESBL-E in die Kälberaufzucht zu defi-nieren.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Antimikrobielle Resistenzen 2.1.1 Entstehung antimikrobieller Resistenzen 2.1.2 Resistenzmechanismen 2.1.3 Verbreitung von Resistenzen 2.2 Beta-Laktamantibiotika 2.2.1 Penicilline 2.2.2 Cephalosporine 2.2.3 Carbapeneme und Monobactame 2.2.4 ß-Laktamasehemmer 2.2.5 Bakterielle Resistenzmechanismen gegenüber Beta-Laktamen 2.3 Beta-Laktamasen 2.3.1 Klassifikation 2.3.2 Extended-Spectrum-Beta-Laktamasen 2.4 Vorkommen und Verteilung von ESBL bei Nutztieren und ihr zoonotisches Potenzial 2.5 Nachweis und Identifikation von ESBL 2.5.1 Phänotypischer Nachweis 2.5.2 Genotypische Identifikation 3 Veröffentlichung 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Danksagung / Introduction: The occurrence of multidrug-resistant bacteria in the community and in hospi-tals as well as in animal husbandry has increased rapidly over the last decades. The in-creasing occurrence of multidrug-resistant gram-negative bacteria, especially enterobac-teria such as Klebsiella (K.) pneumoniae and Escherichia (E.) coli, is of growing concern and has been subject to many studies worldwide. Study aims: We studied the prevalence of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae in dairy calves as part of a routine health check protocol. In addition, data regarding antimicrobial use (AMU), farm hygiene, and farm manage-ment were collected in order to identify possible risks for ESBL occurrence. Animals, material and methods: Ten farms participated in the study with a median of 781 milking cows (319-1701). All calves investigated were younger than two weeks with an average age of 6.8 (±3.9) days. The farms were visited and samples were collected twice at an interval of 7-11 months. Faecal samples diluted 1:10, were plated onto Bril-lianceTM ESBL agar in duplicates. After 24 hours at 37 °C, colonies were counted and to-tal colony forming units (cfu)/ml calculated. Bacteria species were identified biochemical-ly. ESBL-production was phenotypically confirmed using the MICRONAUT-S β-Lactamases system. Additionally, antimicrobial susceptibility was tested using VITEK® 2 technology. Phylotyping of E. coli isolates and screening for bla genes was performed by PCR. The hygienic status of the farms was recorded and rated using a standardized questionnaire developed for dairy cattle and data on animal health and antimicrobial treatment were collected through animal scoring and the herd management program. Results: ESBL-producing enterobacteria were detected on all farms and 96.5 % of calves investigated shed ESBL-positive bacteria. Of all ESBL-producing isolates, the majority were E. coli (92.9 %), followed by Enterobacter cloacae (5.1 %) and Klebsiella pneu-moniae subsp. pneumoniae (2.0 %). The majority of E. coli isolates was clearly assigned to phylogroup C (25.0 %), followed by phylogroups A (15.2 %) and E (14.1 %). CTX-M group 1 was most frequently detected (80.4 %). Besides resistance to penicillins and cephalosporins, the majority of isolates was also resistant to one or more antibiotic clas-ses, with a high proportion being resistant against fluoroqinolones. 52.5 % of isolates were further characterised as threefold multidrug resistant gram-negative bacteria (3MDR-GNB) according to the German Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention. None of the isolates were 4MDR-GNB, i.e. none revealed carbapenem-resistance. Penicillins were the most frequently administered antibiotics to calves on most farms and were the predominant substance class at herd level on all farms. Over-all, the number of calves treated prior to sampling was rather low (11.7 %). Analyses of data regarding the farm management identified weaknesses in biosecurity and cleaning and disinfection. Besides beta-lactam antibiotics being the most commonly used antibiot-ics no other risk factors could be identified. Conclusions: The prevalence of ESBL-carriers in dairy calves in our study was exceptional-ly high. Although ESBL-E-prevalence has been described to decrease with increasing age of cattle, our findings should be motivation to develop strategies to prevent the entry of ESBL-E into the calf rearing system at an early stage such as prudent use of antimi-crobials during drying off and diligent hygiene in calving pens and calf housing. Further investigation is needed, to define the entry point(s) of ESBL-E into calf rearing.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Antimikrobielle Resistenzen 2.1.1 Entstehung antimikrobieller Resistenzen 2.1.2 Resistenzmechanismen 2.1.3 Verbreitung von Resistenzen 2.2 Beta-Laktamantibiotika 2.2.1 Penicilline 2.2.2 Cephalosporine 2.2.3 Carbapeneme und Monobactame 2.2.4 ß-Laktamasehemmer 2.2.5 Bakterielle Resistenzmechanismen gegenüber Beta-Laktamen 2.3 Beta-Laktamasen 2.3.1 Klassifikation 2.3.2 Extended-Spectrum-Beta-Laktamasen 2.4 Vorkommen und Verteilung von ESBL bei Nutztieren und ihr zoonotisches Potenzial 2.5 Nachweis und Identifikation von ESBL 2.5.1 Phänotypischer Nachweis 2.5.2 Genotypische Identifikation 3 Veröffentlichung 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Danksagung