Epicoccum nigrum é um fungo ubíquo conhecido por sua capacidade de produzir vários metabólitos secundários bioativos e pelo seu uso potencial como agente de biocontrole contra vários fitopatógenos. Entre os compostos produzidos por E. nigrum, epicolactona é um policetídeo com uma estrutura bastante complexa. O objetivo desta tese foi identificar e caracterizar genes relacionados à biossíntese da epicolactona em E. nigrum. Três mutantes defectivos para a produção de epicolactona anteriormente gerados por mutagênese aleatória foram analisados. Entretanto, os resultados mostraram que o T-DNA provavelmente estava inserido em regiões regulatórias. Usando ferramentas de bioinformática, seis genes de PKSs foram selecionados para deleção. A deleção do gene PKSi12 mostrou que os seus produtos estão relacionados à atividade antagonista. A análise química permitiu a identificação putativa dos preditos precursores da epicolactona, os quais tiveram sua produção afetada no mutante ΔPKSi12. Uma possível via de biossíntese de epicoccona B e epicoccina por E. nigrum foi proposta. / Epicoccum nigrum is a ubiquitous fungus mainly known for its ability to produce many bioactive secondary metabolites and for its potential use as a biocontrol agent against many phytopathogens. Among the compounds produced by E. nigrum, epicolactone is a polyketide with a very complex structure. The aim of this thesis was to identify and characterize genes related to epicolactone biosynthesis in E. nigrum. Three defective epicolactone mutants previously generated by random mutagenesis were analyzed. However, the results showed that the T-DNA was probably inserted in regulatory regions. Using a genome mining approach, six PKS genes were selected for deletion. The deletion of PKSi12 gene showed that its products are related to E. nigrum antagonistic activity against fungal phytopathogens. The chemical analysis allowed a putative identification of the previously proposed epicolactone precursors, which production was affected in the ΔPKSi12 mutant. A proposed biosynthesis of epicoccone B and epicoccine by E. nigrum was suggested.

O fungo endofítico Epicoccum nigrum atua no biocontrole de fitopatógenos e produz uma série de compostos com de interesse biotecnológico como antimicrobianos. Neste trabalho, foi utilizado um conjunto de sequências genômicas previamente montadas. As sequências foram anotadas para compreensão funcional utilizando a plataforma EGene2 incluindo alguns componentes específicos desenvolvido neste trabalho. Foram estimados 10.320 genes codificadores de proteínas, além de tRNAs, rRNAs e ncRNAs. As proteínas preditas foram comparadas aos proteomas de outros fungos e comparadas filogeneticamente. Além disso, foi desenvolvido Synteny Clusters, um programa que compara clusters de genes de metabólitos secundários aos de outros fungos. E. nigrum apresenta grande similaridade com outros fungos com estilo de vida distinto. Foram identificados três clusters de genes relacionados a doenças que estão presentes em fitopatógenos e ausentes em E. nigrum. Os resultados sugerem que as diferenças entre endófitos e fitopatógenos pode estar relacionada a um pequeno número de genes. / The endophytic fungus Epicoccum nigrum has been used for plant pathogen biocontrol in different host plants, since it produces a series of secondary metabolites of biotechnological interest, including antimicrobials. In this regard, we used assembled 454 sequencing dataset was used to perform a comprehensive functional annotation using the EGene2 platform, including some specific components developed in this work. We found 10,320 protein coding genes as well as tRNAs, rRNAs and ncRNAs. The predicted proteins were compared to proteomes of other fungi and used in phylogenetic analyses. In addition, we developed Synteny Clusters, a program that compares gene clusters with others fungi. E. nigrum presents a genome very similar to others fungi with distinct lifestyles. Finally, we identified three disease-related gene clusters that are absent in E. nigrum and present in most plant pathogenic fungi. This result suggests that the lifestyle differences observed between endophytic and pathogenic fungi may rely on a relatively low number of genes.

O fungo endofítico Epicoccum nigrum atua no biocontrole de fitopatógenos e produz uma série de compostos com de interesse biotecnológico como antimicrobianos. Neste trabalho, foi utilizado um conjunto de sequências genômicas previamente montadas. As sequências foram anotadas para compreensão funcional utilizando a plataforma EGene2 incluindo alguns componentes específicos desenvolvido neste trabalho. Foram estimados 10.320 genes codificadores de proteínas, além de tRNAs, rRNAs e ncRNAs. As proteínas preditas foram comparadas aos proteomas de outros fungos e comparadas filogeneticamente. Além disso, foi desenvolvido Synteny Clusters, um programa que compara clusters de genes de metabólitos secundários aos de outros fungos. E. nigrum apresenta grande similaridade com outros fungos com estilo de vida distinto. Foram identificados três clusters de genes relacionados a doenças que estão presentes em fitopatógenos e ausentes em E. nigrum. Os resultados sugerem que as diferenças entre endófitos e fitopatógenos pode estar relacionada a um pequeno número de genes. / The endophytic fungus Epicoccum nigrum has been used for plant pathogen biocontrol in different host plants, since it produces a series of secondary metabolites of biotechnological interest, including antimicrobials. In this regard, we used assembled 454 sequencing dataset was used to perform a comprehensive functional annotation using the EGene2 platform, including some specific components developed in this work. We found 10,320 protein coding genes as well as tRNAs, rRNAs and ncRNAs. The predicted proteins were compared to proteomes of other fungi and used in phylogenetic analyses. In addition, we developed Synteny Clusters, a program that compares gene clusters with others fungi. E. nigrum presents a genome very similar to others fungi with distinct lifestyles. Finally, we identified three disease-related gene clusters that are absent in E. nigrum and present in most plant pathogenic fungi. This result suggests that the lifestyle differences observed between endophytic and pathogenic fungi may rely on a relatively low number of genes.

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After a wild-type isolate of Epicoccum purpurascens was exposed to shortwave ultraviolet light, several new strains were recovered which were improved in sporulation, fungicide tolerance, and performance in suppression of white mold caused by Sclerotinia sclerotiorum. The efficacy of E. purpurascens in controlling white mold of snap bean (Phaseolus vulgaris) was assessed in greenhouse and field trials. White mold was significantly reduced in both greenhouse and field trials when 2-4 sprays of E. purpurascens conidial suspensions (in 1% malt extract) were sprayed onto the plant surface during the flowering period. Germination of E. purpurascens conidia on senescent petals was greater than on younger flowers. Addition of malt extract to conidial suspensions improved germination on flowers and increased colonization of emerging flowers. Application of E. purpurascens did not accelerate senescence of bean leaves or affect pod yield of bean in greenhouse trials. Mycoparasitism of S. sclerotiorum by E. purpurascens was found only rarely in in vitro tests and was not observed on flower disks. Production of inhibitory compounds by E. purpurascens was the most important mechanism in suppression of white mold but competition for nutrients also appeared to play a role in biocontrol. The influence of nutrients on conidial germination, growth, sporulation and production of antifungal compounds by E. purpurascens were also investigated.

A cultura de sorgo granífero no país é amplamente utilizada na alimentação animal. Através deste estudo, decidimos avaliar a micobiota e a ocorrência de ácido tenuazônico em grãos de sorgo cultivados em duas safras. Além disso, através de abordagem polifásica, caracterizamos cepas de E. sorghinum, bem como avaliamos os aspectos ecofisiológicos desta espécie. E. sorghinum foi o fungo mais prevalente nos de grãos de sorgo. O ácido tenuazônico foi detectado na totalidade das amostras avaliadas, com maiores níveis nos grãos cultivados na safra verão. Foi possível verificar considerável variabilidade genética nas cepas de E. sorghinum, apresentando-se como complexo de espécies filogenéticas. Avaliando os fatores abióticos ocorridos no campo, bem como acessando a ecofisiologia de E. sorghinum, foi possível verificar que condições quentes e úmidas são favoráveis a produção de ácido tenuazônico. Estes resultados alertam para presença de compostos tóxicos em grãos de sorgo cultivados no país, bem como contribuem com informações aplicáveis para o manejo desta cultura. / The culture of sorghum in Brazil is widely used in animal feed. The aim of this study was evaluate the mycobiota and occurrence of tenuazonic acid in sorghum grains cultivated in two sowing periods. In addition, through a polyphasic approach, we characterized strains of Epicoccum sorghinum, as well as evaluated the ecophysiological of this species. E. sorghinum was the most prevalent fungus in sorghum grains. Tenuazonic acid was detected in all the samples, with higher levels in the grains grown in the summer crop. It was possible to verify considerable genetic variability in the strains of E. sorghinum, presenting as a complex of phylogenetic species. By evaluating the abiotic factors occurring in the field, as well as the access to an ecophysiology of E. sorghinum, it was possible to verify that hot and wet conditions are favorable for tenuazonic acid production. These results indicate the presence of toxic compounds in sorghum grains cultivated in Brazil, as well as contribute with information for crop management.

Neste estudo, o extrato bruto obtido da cultura do fungo E. nigrum foi extraído com hexano (HEX), diclorometano (DCM) e acetato de etila (AE). Após fracionamento por HPLC, a atividade antifúngica das frações foi avaliada pelo ensaio de concentração inibitória mínima (CIM) contra Candida albicans (CA), Trychophyton rubrum (TR), Cryptococcus neoformans (CN) e Aspergillus fumigatus (AF). O extrato de AE não foi efetivo, e os extratos HEX e DCM inibiram os patógenos na faixa de 31,25 a 250 µg/mL. Das frações hexânicas, apenas HEX-F9 apresentou atividade antifúngica, com CIM entre 31,25 e 250 mg/mL, exceto sobre AF. As frações DCM-F3, F5, F6, F9 e F10 apresentaram atividade antifúngica com CIM de 31,25 a 500 mg/mL contra todos os patógenos testados. A fração DCM-F9 foi efetiva com CIM entre 62,5 e 250 mg/mL contra CA, TR e CN. As frações DCM-F9 e DCM-F11 estão em fase final de purificação para posterior caracterização físico-química. / The aim of this study was to purify the crude extract produced from E. nigrum and characterize antifungal isolated molecules. E. nigrum was cultivated and the culture supernatant extracted with hexane (HEX), dichloromethane (DCM) and ethyl acetate (AE). Fractions were obtained by HPLC. The antifungal activity were evaluated by minimal inhibitory concentration (CIM) against C. albicans (CA), T. rubrum (TR), C. neoformans (CN) and A. fumigatus (AF). The HEX extract inhibited all pathogens with CIM from 31,25 to 62,5 mg/mL while DCM from 62,5 to 250 mg/mL. From HEX fractions only HEX-F9 showed antigungal activity with CIM from 31,25 to 250 mg/mL, except AF. The DCM-F3, F5, F6, F9 and F10 fractions showed antifungal activity, mainly DCM-F6 (CIM from 31,25 to 62,5 mg/mL against all pathogens) and DCM-F9 (CIM from 62,5 to 250 mg/mL against CA, TR and CN). DCM-F6 was not produced anymore by the fungus in subsequent cultures. DCM-F9 LC/MS, CG/MS and RMN results suggested impure fraction, making difficult to determine the main compound. New approaches are being considered.

Neste estudo, o extrato bruto obtido da cultura do fungo E. nigrum foi extraído com hexano (HEX), diclorometano (DCM) e acetato de etila (AE). Após fracionamento por HPLC, a atividade antifúngica das frações foi avaliada pelo ensaio de concentração inibitória mínima (CIM) contra Candida albicans (CA), Trychophyton rubrum (TR), Cryptococcus neoformans (CN) e Aspergillus fumigatus (AF). O extrato de AE não foi efetivo, e os extratos HEX e DCM inibiram os patógenos na faixa de 31,25 a 250 µg/mL. Das frações hexânicas, apenas HEX-F9 apresentou atividade antifúngica, com CIM entre 31,25 e 250 mg/mL, exceto sobre AF. As frações DCM-F3, F5, F6, F9 e F10 apresentaram atividade antifúngica com CIM de 31,25 a 500 mg/mL contra todos os patógenos testados. A fração DCM-F9 foi efetiva com CIM entre 62,5 e 250 mg/mL contra CA, TR e CN. As frações DCM-F9 e DCM-F11 estão em fase final de purificação para posterior caracterização físico-química. / The aim of this study was to purify the crude extract produced from E. nigrum and characterize antifungal isolated molecules. E. nigrum was cultivated and the culture supernatant extracted with hexane (HEX), dichloromethane (DCM) and ethyl acetate (AE). Fractions were obtained by HPLC. The antifungal activity were evaluated by minimal inhibitory concentration (CIM) against C. albicans (CA), T. rubrum (TR), C. neoformans (CN) and A. fumigatus (AF). The HEX extract inhibited all pathogens with CIM from 31,25 to 62,5 mg/mL while DCM from 62,5 to 250 mg/mL. From HEX fractions only HEX-F9 showed antigungal activity with CIM from 31,25 to 250 mg/mL, except AF. The DCM-F3, F5, F6, F9 and F10 fractions showed antifungal activity, mainly DCM-F6 (CIM from 31,25 to 62,5 mg/mL against all pathogens) and DCM-F9 (CIM from 62,5 to 250 mg/mL against CA, TR and CN). DCM-F6 was not produced anymore by the fungus in subsequent cultures. DCM-F9 LC/MS, CG/MS and RMN results suggested impure fraction, making difficult to determine the main compound. New approaches are being considered.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-21T09:27:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_FranciscaDianadaSilva_D.pdf: 5387746 bytes, checksum: ae8110c020cf470d09fb0e22f670508f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Aspectos distintos da ecologia química de bactéria, fungo e abelha foram investigados e abordados em três capítulos. O primeiro capítulo descreve o estudo das moléculas sinalizadoras envolvidas no processo de quorum-sensing da bactéria Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.), que resultou na identificação de três acil-homosserina lactonas (acil-HSLs): (S)-(-)-N-heptanoil-HSL, (S)-(-)-N-dodecanoil-HSL e (S)-(-)-N-tetradecanoil-HSL. Estes semioquímicos foram degradados por enzimas de Bacillus cereus. No segundo capítulo o estudo do fungo Epicoccum nigrum possibilitou o isolamento de meleína, 4,5-dimetil-resorcinol, flavipina e de um novo metabólito, denominado epicolactona. O monitoramento destas substâncias em três mutantes de E. nigrum apontou para a produção de 5-hidroxi-meleína, ausente no fungo selvagem, indicando que a rota biossintética de policetídeos em E. nigrum foi alterada, ativando a ação de uma mono-oxigenase responsável pela oxidação da meleína. No terceiro capítulo, foram investigados feromônios produzidos por diferentes castas da abelha social Tetragonisca angustula. Bioensaios com as rainhas indicaram que lipídios cuticulares são possíveis responsáveis pela indução da cópula nos machos. Operárias fundadoras e guardas foram diferenciadas quimicamente por compostos presentes em seus extratos cefálicos e abdominais. Extratos cefálicos de machos em diferentes ciclos de vida mostraram-se semelhantes / Abstract: Different aspects of bacteria, fungus and bee chemical ecology were investigated and discussed in three chapters. First chapter describes the study of signaling molecules involved in the Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) quorum sensing process that resulted in the identification of three acyl-homoserine lactones (acyl-HSLs): (S)-(-)-N-heptanoyl-HSL, (S)-(-)-N-dodecanoyl-HSL and (S)-(-)-N-tetradecanoyl-HSL. These semiochemicals were modified by Bacillus cereus enzymes. Second chapter describes the study of Epicoccum nigrum (fungus) revealing the isolation of mellein, 4,5-dimethylresorcinol, flavipin and of a novel metabolite, named epicolactone. Monitoring these compounds in three E. nigrum mutants pointed to the production of 5-hydroxymellein, absent in wild fungus strain, indicating that biosynthetic route of polyketides in E. nigrum has been modified, activating a monooxygenase responsible for mellein oxidation. Third chapter describes pheromones produced by different castes of Tetragonisca angustula social bee. Bioassays with queens indicated that cuticular lipids might be responsible for copulation induction in males. Cephalic and abdominal extracts of founded and guard workers were chemically different, while cephalic extracts of males at different life cycles were similar / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências