Orientador: Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:00:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Contesini_FabianoJares_M.pdf: 1094439 bytes, checksum: 9f9e34abfc4a94978b97e21b2b7168c1 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A isomaltulose é um dissacarídeo redutor, isômero da sacarose, com propriedades interessantes para a indústria de alimentos. Este açúcar apresenta propriedades similares às da sacarose, entretanto, apresenta baixo potencial cariogênico e baixo índice glicêmico. A isomaltulose é produzida industrialmente através da conversão enzimática da sacarose pela enzima glicosiltransferase produzida por certas linhagens de bactérias, como Protoaminobacter rubrum e Erwinia rhapontici. Este trabalho teve por objetivo purificar e caracterizar a glicosiltransferase produzida pela Erwinia sp. D12 e imobilizar a glicosiltransferase bruta em Celite e pectina de baixo teor de metoxilas (BTM). A glicosiltransferase foi purificada por cromatografia em coluna de troca catiônica SP-Sepharose Fast Flow, obtendo-se duas frações com atividade de glicosiltransferase. A enzima da fração n° 17 foi purificada cerca de 17,9 vezes, e a massa molecular foi estimada em 65 kDa, por SDS-PAGE. A glicosiltransferase bruta e as frações purificadas apresentaram atividade ótima em pH de 6,0 a 6,5 e em temperatura de 30 a 35°C e estabilidade na faixa de pH de 5,0 a 7,0 e em temperaturas inferiores a 30°C, sendo que as frações purificadas apresentaram menor estabilidade. As condições ótimas de imobilização da glicosiltransferase bruta em Celite foram pH 4,0 para adsorção da enzima no suporte, e quantidade de enzima de 1700 U. A glicosiltransferase bruta imobilizada em Celite, em processo de batelada e em coluna de leito empacotado, converteu cerca de 50% de sacarose em isomaltulose, porém a conversão diminuiu com o tempo. O tratamento da glicosiltransferase imobilizada em Celite com 0,1% de glutaraldeído não resultou em aumento da retenção e estabilidade da enzima. A glicosiltransferase imobilizada em gel de pectina BTM com adição de gordura manteve maior atividade de glicosiltransferase que as preparações de enzima imobilizada sem gordura e liofilizadas. Quando essa preparação foi aplicada em processo de batelada foi observada conversão inicial em torno de 30% com queda gradativa nas posteriores bateladas. Em colunas de leito empacotado foi observada conversão de sacarose em isomaltulose máxima de 10,5% em 2 horas, sendo que após 60 horas foi igual a 3% / Abstract: Isomaltulose is a reducing disaccharide and an isomer of sucrose. Because of its properties it is interesting for application in the food industry. This sugar shows similar properties to sucrose, but it has low cariogenic potential and low glycemic index. Industrially, isomaltulose is produced by conversion of sucrose using glucosyltransferase. This enzyme is produced by few bacterial strains such as Protoaminobacter rubrum and Erwinia rhapontici. The aims of this research were the purification and characterization of glucosyltransferase produced by Erwinia sp. D12 and the immobilization of the crude enzyme in Celite and low-metoxyl pectin. The glucosyltransferase was purified using cationic exchange column of SPSepharose Fast Flow and it was obtained two fractions with glucosyltransferase activity. The enzyme found in 17th fraction was purified 17.9-fold, and showed a molecular mass of 65 kDa, by SDS-PAGE. The crude glucosyltransferase and the purified fractions showed optimum activity in pH of 6.0 ¿ 6.5 and 30 ¿ 35°C and stability in pH 5.0 to 7.0 and under 30°C, and the purified preparation was less stable than the crude enzyme. The optimum condition of the immobilization of crude glucosyltransferase was using pH 4.0 for the adsorption of the enzyme into the support, and amount of enzyme of 1700 U. The glucosyltransferase immobilized on Celite was applied to the conversion of sucrose into isomaltulose in a batch system and packed-bed reactor. A conversion rate of 50% was observed, but this decreased over a period of hours. The treatment of the immobilized glucosyltransferase on Celite, with 0.1% glutharaldehyde did not increase the stability of the enzyme. The immobilization of crude glucosyltransferase in lowmetoxyl pectin with a fat addition, presented a higher activity when compared to microcapsules without fat or freeze dried. When this preparation was applied to the conversion of sucrose into isomaltulose, in a batch system, it was observed an initial conversion rate of 30%. However this value decreased in further batches. In the packed-bed reactors, the highest conversion value of sucrose to isomaltulose was 10.5% in 2 hours, but after 60 hours the conversion was 3% / Mestrado / Bioquimica de Alimentos / Mestre em Engenharia de Alimentos

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-23T14:02:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1255542 bytes, checksum: 80a1a0887eec0d47d3397629b89ddfb2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-23T14:02:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1255542 bytes, checksum: 80a1a0887eec0d47d3397629b89ddfb2 (MD5) Previous issue date: 2015-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A seca dos ponteiros causada por Erwinia psidii é um dos fatores limitantes para a produção de goiaba no Brasil. Recentemente, essa bactéria foi relatada como o agente causal da seca de ponteiros e murcha de Eucalyptus spp. no Brasil, Uruguai e Argentina. Como se trata de uma enfermidade recentemente descoberta, há ainda poucos estudos sobre o patossistema E. psidii - eucalipto, especialmente quanto à variabilidade genética do patógeno e resistência de Eucalyptus à doença. Assim, neste trabalho, compararam-se, por meio de marcadores de DNA, Rep - PCR, a variabilidade genética entre 21 isolados oriundos de eucalipto e cinco de goiabeira e avaliou-se a resistência de Eucalyptus spp. à doença. Baseado em 33 loci amplificados com os três marcadores (REP, ERIC e BOX), observou-se variabilidade genética relativamente baixa, apesar de terem se agrupado de acordo com o hospedeiro de origem (eucalipto e goiaba) e a região geográfica. Dentre as espécies avaliadas quanto à resistência (E. pellita, E. urophylla, E. camaldulensis, E. saligna e E. grandis), E. pellita e um acesso de E. urophylla apresentaram maior frequência de genótipos resistentes e constituem boas fontes de resistência à doença. / Dieback caused by Erwinia psidii is a limiting factor for the production of guava in Brazil. Recently, this bacterium was reported as the causal agent of dieback and wilt in Eucalypus spp. in Argentina, Brazil and Uruguay. As this is a new disease there are few studies regarding the E. psidii-eucalyptus pathosystem, especially about the genetic variability of the pathogen and resistance of Eucalyptus to this disease. In this work, the genetic variability among 21 isolates from eucalyptus and five from guava was compared using DNA markers Rep-PCR and the resistance of Eucalyptus spp. to the disease evaluated. Based on 33 loci amplified by three markers (REP, ERIC and BOX), we observed a relatively low variability for the isolates, however, in the cluster analysis, we observed a split of the isolates according to the source host (eucalyptus and guava) and geographic region. Among species of E. pellita, E. urophylla, E. camaldulensis, E. saligna and E. grandis tested, the first two had a higher frequency of resistant genotypes and are good disease resistance sources, although all presented intra variability specific.

Field experiments were conducted in two different growing environments to evaluate the spread and movement of Dickeya dadantii. A procedure to inoculate seed potatoes with Dickeya dadantii was developed to use during this study. Spread of Dickeya dadantii from inoculated potato seed to healthy potato seed during the handling, cutting and planting procedures was not detected at either location. Spread of Dickeya dadantii from inoculated seed to surrounding progeny tubers in the field was documented in both locations. In Florida, 33% of progeny tubers tested positive for Dickeya using PCR, and in North Dakota, 13% of the progeny tubers tested positive. Stunting was observed in plants grown from Dickeya dadantii inoculated seed tubers in North Dakota, but not in Florida. These results indicate that Dickeya dadantii may spread during the seed handling and cutting processes and can spread in the field from infected seed tubers to progeny tubers.

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La bactérie Erwinia amylovora est responsable de la maladie du feu bactérien des Maleae (pommier, poirier…). Le pouvoir pathogène de cette bactérie dépend d'une seringue moléculaire appelé système de sécrétion de type 3 (SSTT). Ce SSTT permet à la bactérie d’injecter des effecteurs dans les cellules de la plante. Parmi les effecteurs injectés, DspA/E est l'effecteur indispensable au pouvoir pathogène d’E. amylovora. Cet effecteur est à lui seul capable de provoquer la mort des cellules chez le pommier et le tabac et permet à la bactérie de se multiplier de manière transitoire chez A. thaliana. L’objectif de ce travail de thèse était de comprendre la fonction de DspA/E dans la cellule végétale et d’identifier des facteurs végétaux impliqués dans la toxicité de DspA/E. Afin de répondre à cette question, des plantes transgéniques exprimant DspA/E sous contrôle d’un promoteur inductible à l’estradiol ont été construites.Dans un premier temps, la caractérisation phénotypique des lignées exprimant DspA/E a été effectuée. Les résultats obtenus montrent que DspA/E est toxique lorsqu'il est exprimé in planta (il provoque la mort des cellules, inhibe la germination, la croissance racinaire et la traduction) et permet la multiplication in planta d’un mutant dspA/E. Un crible de mutants suppresseurs de la toxicité de l'effecteur DspA/E a été effectué sur une lignée transgénique exprimant DspA/E dans le but d'identifier un ou plusieurs gènes impliqués dans la toxicité de DspA/E. Ce crible suppresseur a permis d'identifier un candidat potentiel impliqué dans la photo-respiration, la glycolate oxydase 2 (GOX2). L’analyse fonctionnelle réalisée sur le mutant gox2-2 a permis de montrer que le gène GOX2 est un régulateur positif des réponses de défense d’A. thaliana en réponse à l’infection par E. amylovora.Enfin, la caractérisation du stress oxydant a permis de montrer que plusieurs formes actives de l’oxygène (H2O2 et O2.-) s’accumulent au cours de l’interaction entre A. thaliana et E. amylovora. Ceci a permis également de comprendre le rôle de DspA/E sur ce stress oxydant. Nos résultats suggèrent que la glycolate oxydase 2 participerait à l’induction du stress oxydant en perturbant le métabolisme des sucres. / The bacterium E. amylovora is responsible for the fire blight disease of Maleae (apple, pear…). The pathogenicity of this bacterium relies on a molecular syringe, the type three secretion system (TTSS). This TTSS allows the bacterium to inject effector proteins into the plant cell. Among these effectors, DspA/E is essential for the pathogenicity of E. amylovora. This effector can provoke cell death on apple and tobacco and allows the bacterium to multiply transiently in A. thaliana.The purpose of the thesis was to understand the function of DspA/E in the plant cell and to identify plant factors involved in the toxicity of DspA/E. To answer this question, transgenic plants which express DspA/E under an estradiol-inducible promoter were built.At first, phenotypical characterization of DspA/E transgenic lines was performed. Our results showed that DspA/E is toxic when expressed in planta (it provokes cell death, inhibits germination, root growth and translation) and allows in planta multiplication of dspA/E bacterial mutant. A screening for suppressor mutants of DspA/E toxicity was performed on a DspA/E transgenic line in order to identify one or several genes involved in the toxicity of DspA/E. This screening allowed us to identify a potential candidate involved in photorespiration, the glycolate oxidase 2 (GOX2). Functional analysis performed on the gox2-2 mutant allowed us to show that the GOX2 gene is a positive regulator of A. thaliana responses against E. amylovora.Finally, characterization of oxidative stress allowed us to show that several reactive oxygen species (H2O2 et O2.-) accumulate during A. thaliana and E. amylovora interaction. This allowed us to understand the role of DspA/E in the oxidative stress. Our results suggest that the glycolate oxidase 2 could be involved in the induction of the oxidative stress by disrupting sugar metabolism.

A L- asparaginase é uma enzima aplicada no tratamento de Leucemia Linfoide Aguda, que atua na hidrólise da L- asparagina, privando a célula tumoral de um aminoácido essencial para o seu crescimento. A L- asparaginase, como outros biofármacos, deve ser estável, manter sua atividade específica e formar poucos agregados. A fim de manter a integridade do biofármaco, são utilizados adjuvantes nas formulações farmacêuticas, e dentre os mais importantes estão os osmólitos. Essas moléculas protegem a estrutura nativa da proteína, sendo capazes de interferir na formação de agregados e garantir a estabilidade proteica. O presente trabalho teve o objetivo de estudar o efeito dos osmólitos sacarose, sorbitol, arginina e glicina na atividade específica, estabilidade, cinética e caracterização de agregados na solução de L- asparaginase II de Erwinia chrysanthemi. Os resultados mostraram que a maioria dos osmólitos testados aumentou a atividade específica e a estabilidade da enzima, o que pode estar relacionado com o aumento da velocidade máxima e do kcat observados no ensaio cinético realizado com sacarose e sorbitol. Um perfil diferente de agregados foi encontrado para cada tipo de osmólito. A presença de sacarose ou sorbitol resultou na menor quantidade de agregados na faixa de, respectivamente, 100 a 200 e 200 a 300 nm em relação a enzima sem osmólito. Por outro lado, aumento no número total de agregados e presença de moléculas de alto peso molecular (300 a 500 nm) foram observados nas soluções enzimáticas contendo, respectivamente, glicina e arginina. Dessa forma, os resultados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na produção e escolha da formulação de biofármacos, e, consequentemente, melhorar o tratamento medicamentoso de pacientes. / L L-Asparaginase is an enzyme applied in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, which acts on the hydrolysis of L- asparagine, depriving the tumor cell of an essential amino acid for its growth. L-asparaginase, as other biopharmaceuticals, must be stable, maintain its specific activity and form few aggregates. In order to maintain the integrity of the biopharmaceutical, adjuvants are used in the pharmaceutical formulations, and among the most importants adjuvants are the osmolytes. These molecules protect the native structure of the protein, being able of interfering in the formation of aggregates and guarantee protein stability. The present work had the objective of studying the effect of the osmolytes sucrose, sorbitol, arginine and glycine in the specific activity, stability, kinetic and aggregates characterization, in L- asparaginase II solution of Erwinia chrysanthemi. The results showed that the majority of the tested osmolytes increased the specific activity of the enzyme and its stability, which may be related to the augment of maximum velocity and kcat observed in the kinetic assay performed with sucrose and sorbitol. A different profile of aggregates was found for each type of osmolyte. The presence of sucrose or sorbitol resulted in the least amount of aggregates in the range of, respectively, 100-200 and 200-300nm in relation to the enzyme without osmolyte. On the other hand, increase in the total number of aggregates and the presence of high molecular weight molecules (300 to 500 nm) were observed in the enzymatic solutions containing, respectively, glycine and arginine. Thus, the results obtained in this work may help in the production and choice of the formulation of biopharmaceuticals and, consequently, improve the drug treatment of patients.

A mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorriza Bancroft.) é uma raiz tuberosa que apresenta um curto período de conservação pós-colheita, de 3 a 5 dias, devido a uma fitopatologia conhecida como apodrecimento-mole ou mela, causada por bactérias do gênero Erwinia. Essas bactérias liberam enzimas que degradam a pectina da parede celular, fazendo com que o tecido perca a sua rigidez característica. Atualmente, vários métodos de conservação têm sido estudados na tentativa de prolongar a conservação pós-colheita, porém, a combinação de processos parece ser a melhor alternativa. Esse trabalho teve como objetivo estudar a interação entre processos de conservação (refrigeração, embalagem a vácuo e irradiação) para estender o período pós-colheita das raízes. Foram estudadas a combinação de duas temperaturas (25°C e 4°C), duas embalagens (caixas e vácuo) e três doses de irradiação gama obtendo um total de 16 grupos. Estes foram analisados diariamente, por um período de 30 dias, utilizando parâmetros de textura (energia de penetração), microbiologia e atividade de enzimas pectinolíticas (pectato liase, poligalacturonase e pectinesterase). A exposição às doses de 2 e 3kGy, com as amostras conservadas a 4°C a vácuo, prolongaram o período de conservação de 5 para 28 dias, ocorrendo uma diminuição da população microbiana, porém havendo uma diminuição da rigidez das raízes (p<0,05). Os tratamentos afetaram o perfil de atividade das enzimas pectinolíticas, porém a grande dispersão dos resultados e o pequeno número de raízes analisadas por dia, além da complexidade dos fatores que afetam a atividade das enzimas e as múltiplas origens possíveis - endógenas, bacterianas ou fungicidas - limitam a discussão mais aprofundada dos resultados. / Peruvian carrot (Arracacia xanthorriza Bancroft.) is a tuber root that presents a short post-harvest period of conservation, 3 to 5 days, due to a phytopathology known as soft rot or \"mela\", caused by bacteria of the genus Erwinia. This bacteria release enzymes that decay the cellular wall, causing the lost of the characteristic rigidity. At present, many conservation methods have been studied in the attempt of prolonging the post harvest conservation, but the combination of processes seems to be the best alternative. The aim of this work was to study the interaction between the conservation processes (refrigeration, vacuum packaging and irradiation) to extend the post-harvest period of the roots. It was studied the combination of two temperatures (25°C e 4°C), with two packages (boxes and vacuum) and three gamma irradiation doses (1, 2 e 3kGy), obtaining a total of 16 sample groups. The samples were daily analized, for a 30 day period, using texture parameters (penetration energy), microbiology and pectinolitic enzymes activities (pectate lyase, polygalactunoronase and pectin methyl esterase). The samples irradiated in doses of 2 and 3kGy, vacuum packed and conserved at 4°C extend the post-harvest period of 5 to 28 days, with a decrease of the microbiologic population, but with decreased in the rigidity of the roots (p<0.05). The treatments affected the pectinolitic enzymes profile, however the amplitude of the results and the low number of analysed samples per day, besides the complexity of factors affecting the enzyme activity and the multiple possible sources(endogenous, bacterial or fungous), limits the carefully discussion of the results.

A L- asparaginase é uma enzima aplicada no tratamento de Leucemia Linfoide Aguda, que atua na hidrólise da L- asparagina, privando a célula tumoral de um aminoácido essencial para o seu crescimento. A L- asparaginase, como outros biofármacos, deve ser estável, manter sua atividade específica e formar poucos agregados. A fim de manter a integridade do biofármaco, são utilizados adjuvantes nas formulações farmacêuticas, e dentre os mais importantes estão os osmólitos. Essas moléculas protegem a estrutura nativa da proteína, sendo capazes de interferir na formação de agregados e garantir a estabilidade proteica. O presente trabalho teve o objetivo de estudar o efeito dos osmólitos sacarose, sorbitol, arginina e glicina na atividade específica, estabilidade, cinética e caracterização de agregados na solução de L- asparaginase II de Erwinia chrysanthemi. Os resultados mostraram que a maioria dos osmólitos testados aumentou a atividade específica e a estabilidade da enzima, o que pode estar relacionado com o aumento da velocidade máxima e do kcat observados no ensaio cinético realizado com sacarose e sorbitol. Um perfil diferente de agregados foi encontrado para cada tipo de osmólito. A presença de sacarose ou sorbitol resultou na menor quantidade de agregados na faixa de, respectivamente, 100 a 200 e 200 a 300 nm em relação a enzima sem osmólito. Por outro lado, aumento no número total de agregados e presença de moléculas de alto peso molecular (300 a 500 nm) foram observados nas soluções enzimáticas contendo, respectivamente, glicina e arginina. Dessa forma, os resultados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na produção e escolha da formulação de biofármacos, e, consequentemente, melhorar o tratamento medicamentoso de pacientes. / L L-Asparaginase is an enzyme applied in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, which acts on the hydrolysis of L- asparagine, depriving the tumor cell of an essential amino acid for its growth. L-asparaginase, as other biopharmaceuticals, must be stable, maintain its specific activity and form few aggregates. In order to maintain the integrity of the biopharmaceutical, adjuvants are used in the pharmaceutical formulations, and among the most importants adjuvants are the osmolytes. These molecules protect the native structure of the protein, being able of interfering in the formation of aggregates and guarantee protein stability. The present work had the objective of studying the effect of the osmolytes sucrose, sorbitol, arginine and glycine in the specific activity, stability, kinetic and aggregates characterization, in L- asparaginase II solution of Erwinia chrysanthemi. The results showed that the majority of the tested osmolytes increased the specific activity of the enzyme and its stability, which may be related to the augment of maximum velocity and kcat observed in the kinetic assay performed with sucrose and sorbitol. A different profile of aggregates was found for each type of osmolyte. The presence of sucrose or sorbitol resulted in the least amount of aggregates in the range of, respectively, 100-200 and 200-300nm in relation to the enzyme without osmolyte. On the other hand, increase in the total number of aggregates and the presence of high molecular weight molecules (300 to 500 nm) were observed in the enzymatic solutions containing, respectively, glycine and arginine. Thus, the results obtained in this work may help in the production and choice of the formulation of biopharmaceuticals and, consequently, improve the drug treatment of patients.

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