Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst. / Härtill 5 uppsatser.

Inaug.-diss.-Bern. / At head of title: Arbeit aus Reichsseruminstitut zu Rotterdam ... "Literatur": p. [158]-163.

Thesis (M.S.)--University of Wisconsin--Madison, 1966. / eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Call number: LD2668 .T4 1934 T31

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1961. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 135-138).

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Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-30 / Valée S.A. / Swine erysipelas is one of the diseases responsible for the great economic losses in swine-producing areas of the world. The bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae is the causative agent of erysipelas, and the vaccines currently available for prevention of this disease are produced with the whole broth culture containing the inactivated microorganism or its live-attenuated form. A surface protein was identified as the main antigen. It can be found in the culture supernatant or attached to the cell wall through interactions with the choline residues from the teichoic and lipoteichoic acids of this structure. Considering the lack of information in the scientific literature about studies concerning the growth pattern of this pathogen, the company Vallèe S.A, a Brazilian industry of veterinary pharmaceutical products, established a partnership with researchers form the Chemical Engineering Department of UFSCar with the purpose of developing the technology required for the production of the cited vaccine. In this context, the objective of this work was to optimize the growing conditions of E. rhusiopathiae to establish a protocol for production of high cellular concentrations, enough to prepare a vaccine against swine erysipelas offering the same or a higher protection level compared to the commercially available formulations. To achieve this goal, the growth kinetics of this microorganism was investigated under different aeration conditions (aerobiosis, anaerobiosis and microaerophilic condition), changes in the medium nutrient s concentration were analyzed, and mice protection tests using the prepared vaccines were performed. The studies about the aeration influence on the microorganism growth and the antigen expression were made using a 4.0 L stirred-tank bioreactor, with an agitation frequency kept between 100 and 400 rpm and air or N2 flow rate of 1.0 L/min. The studies for the improvement of the medium formulation were carried out in flasks incubated at static condition or under agitation of 200 rpm. The vaccines were prepared using medium harvested in both conditions. The temperature was set at 37°C and the initial pH at 8,0 in all experiments. Samples of culture supernatant and from cell extracts made with choline chloride were analyzed by electrophoresis under denaturating conditions (SDS-PAGE) to evaluate the antigen expression. The preliminary electrophoresis results indicated that the antigen production is associated to the cell growth and its expression is favored in the presence of oxygen. Cellular concentrations around 1,8 g/L were reached, in all different aeration conditions employed, using the stirred-tank bioreactor operating with pH automatic control and using the culture medium with nutrients concentrations increased in 50 % from the Feist medium described in literature. The vaccines prepared in aerobic and microaerophilic condition led to higher protection levels in the challenge-exposure tests, and a formulation made from an aerobic culture in bioreactor having a cellular concentration over 2,0 x 109 CFU/mL showed the same immunizing power as the three commercial vaccines used for comparison purposes. Observations about the inhibitory effects of metabolites accumulation and substrate saturation on the microorganism growth pointed the fed-batch as a promising operation mode to produce larger amounts of biomass. Cellular concentrations reached in the experiment ran under these condition were increased around five times. / A erisipela suína está entre as enfermidades que causam os maiores prejuízos na suinocultura mundial. O agente patogênico associado a esta doença é a bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae, e as vacinas disponíveis atualmente para a prevenção da erisipela são produzidas com o caldo de cultivo deste microrganismo inativado ou atenuado. O principal antígeno identificado é uma proteína de superfície da bactéria encontrada no sobrenadante do caldo de cultivo ou aderida à parede celular através de interações com resíduos de colina dos ácidos teicóico e lipoteicóico desta estrutura. Diante da escassez de informações na literatura científica sobre estudos a respeito do crescimento deste patógeno, a empresa Vallèe S.A, indústria brasileira de produtos farmacêuticos de uso veterinário, firmou uma parceria com pesquisadores do Departamento de Engenharia Química da UFSCar para o desenvolvimento da tecnologia de produção dessa vacina. Assim, o presente trabalho teve como objetivo otimizar as condições de cultivo de E. rhusiopathiae de forma a estabelecer um protocolo de produção de altas concentrações celulares deste microrganismo, suficientes para produzir uma vacina contra a erisipela suína que oferecesse grau de proteção igual ou superior às formulações disponíveis no mercado. Para tanto, o crescimento do microrganismo foi estudado em diferentes condições de aeração (aerobiose, microaerofilia e anaerobiose), foram avaliadas alterações nas concentrações dos nutrientes do meio de cultivo e foram realizados testes de imunização em camundongos com as vacinas preparadas. Os estudos sobre o efeito da aeração no crescimento do microrganismo e na expressão do antígeno foram realizados em biorreator de 4,0 L, com uma faixa de agitação entre 100 e 400 rpm e vazão de ar ou N2 de 1,0 L/min. Os experimentos de aprimoramento do meio de cultivo foram conduzidos em câmara incubadora estática ou com agitação de 200 rpm. Já as vacinas foram preparadas em ambas as condições. A temperatura utilizada foi de 37°C e o pH inicial foi de 8,0 em todos os ensaios realizados. A expressão do antígeno foi avaliada por eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) utilizando amostras do sobrenadante dos cultivos ou a partir de extratos das células preparados com solução de cloreto de colina. Os resultados destas análises revelaram que a produção do antígeno acompanha o crescimento celular e sua expressão é favorecida na presença de oxigênio. Concentrações celulares de até 1,8 g/L foram atingidas, nas três diferentes condições de aeração empregadas, nos cultivos realizados em biorreator com controle automático de pH e utilizando o meio de cultivo com as concentrações de nutrientes aumentadas em 50% em relação ao meio Feist modificado descrito na literatura. As vacinas preparadas com os cultivos aeróbio e microaerófilo proporcionaram um maior grau de proteção nos testes de imunização realizados, e a formulação preparada a partir de um cultivo aeróbio realizado em biorreator com concentração celular superior a 2,0 x 109 UFC/mL conferiu o mesmo nível de proteção que três vacinas comerciais utilizadas para fins de comparação. Observações sobre os efeitos de inibição do crescimento provocadas por acúmulo de metabólitos ou excesso de substrato, indicaram o modo de operação do biorreator em batelada alimentada como promissor para obtenção de maior concentração celular. Em um experimento realizado nesta condição a biomassa foi aproximadamente quintuplicada em relação aos ensaios em batelada simples.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3049.pdf: 2440029 bytes, checksum: f8b9ee5d47547364d040e6797729060f (MD5) Previous issue date: 2010-03-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / Pork is one of the most widely eaten meats in the world and pig farming is an economic activity booming in Brazil and the world. Several efforts have been made to develop more effective vaccines for major diseases that are affecting livestock such as swine erysipelas, caused by the bacterium Erysipelothrix rhusiopathiae. The currently available vaccines for the prevention of erysipelas are produced with culture broth of this microorganism inactivated or attenuated. The main antigenic agent identified is an protein fraction of 64-69 kDa, present in cell wall of bacteria and the supernatant of the culture. Given the accumulated knowledge of the studies conducted by Silva (2007), this study aimed to: i) study the conditions employed in the preparation of cell suspension for freezing and formation of culture stocks in crytubes and the stage of their activation; ii) studying the growth of E. rhusiopathiae, the formation of lactic acid and expression of antigen in culture media containing carbon sources alternative to glucose and in culture media containing nitrogen sources of plant origin; iii) to study the behavior of the microorganism in the new culture medium, animal-free, in a bioreactor. The studies for the improvement of the medium formulation were carried out in flasks incubated at static condition or under agitation of 200 rpm. The temperature was set at 37°C and the initial pH at 8,0 in all experiments. The studies in bioreactor were made using a 4.0 L stirred-tank bioreactor, with an agitation frequency kept between 100 and 700 rpm and air flow rate of 1.0 L/min. Samples of cell extracts made with choline chloride were analyzed by electrophoresis under denaturating conditions (SDS-PAGE) to evaluate the antigen expression. Studies of activation of the criotubes containing frozen cell suspensions led to the standardization of this step, with high reproducibility, and reduced activation time by 50%. The studies were grew with different carbon sources, showing that E. rhusiopathiae is able to assimilate galactose, lactose, and glucose. However, there was no assimilation of glycerol. The replacement of proteose peptone, a nitrogen source animal widely used in the cultivation of E. rhusiopathiae to produce bacterins, by Soytone, a soy peptone, animal-free, was a promising alternative for the production of the inactivated vaccine, helping to increase the specific growth rate and substrate conversion of cells in relation to values obtained in conventional medium. In batch cultivation performed in a bioreactor with medium containing glucose and Soytone, it was reached a biomass concentration of 10 g / L at 5 hours of cultivation. For the conventional medium, containing proteose peptone, the maximum cell concentration reported for the test batch in a bioreactor was approximately 2 g / L, which was reached after 7 hours of culture. Note also that a higher level of expression of antigenic protein in relation to those observed with peptone of animal origin was achieved in cultures performed with medium containing soytone.This result shows that could be incorporate the best practices of manufacturing practices for pharmaceutical and veterinary products, subject to the productivity of the process and with significant cost reduction. / A carne suína é a mais consumida no mundo e a suinocultura é uma atividade econômica em franca expansão no Brasil e no mundo. Diversos esforços vêm sendo realizados para o desenvolvimento de vacinas mais eficientes para as principais doenças que afetam os rebanhos, como a erisipela suína, causada pela bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae. As vacinas disponíveis atualmente para a prevenção da erisipela são produzidas com o caldo de cultivo deste microrganismo inativado ou atenuado. O principal agente antigênico identificado é uma fração protéica de 64-69 kDa, presente tanto na parede celular da bactéria quanto no sobrenadante do cultivo. Diante do conhecimento acumulado ao longo dos estudos conduzidos por Silva (2007), o presente trabalho teve como objetivos: i) estudar as condições empregadas na preparação das suspensões celulares para armazenamento na forma de cultura estoque em criotubos assim como a etapa de ativação dos mesmos; ii) estudar o crescimento de E. rhusiopathiae, a formação de ácido lático e a expressão do antígeno SpaA em meios de cultivo contendo fontes de carbono alternativas à glicose e fontes de nitrogênio de origem vegetal; iii) estudar o comportamento do microrganismo no meio de cultura novo, livre de substratos de origem animal, em biorreator. Os experimentos foram conduzidos em câmara incubadora, em cultivos estáticos ou com agitação de 50 ou de 200 rpm. A temperatura utilizada foi de 37°C e o pH inicial foi de 8,0 em todos os ensaios realizados. Os estudos em biorreator foram realizados em biorreator de 5,0 L, com agitação entre 100 a 700 rpm e vazão de ar de 1,0 a 2 L/min. Amostras retiradas durante os cultivos foram empregadas para análise da densidade ótica (a 420 nm) e das concentrações de glicose, biomassa e metabólitos. A expressão do antígeno foi avaliada por eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) a partir de extratos das células preparados com solução de cloreto de colina. Os estudos envolvendo a ativação dos criotubos contendo as suspensões celulares congeladas levaram à padronização desta etapa, com alta reprodutibilidade, e à diminuição do tempo de ativação em 50 %. Os cultivos realizados com diferentes fontes de carbono, mostraram que E. rhusiopathiae é capaz de assimilar galactose e lactose, além de glicose. No entanto, não foi verificada assimilação de glicerol. A substituição da proteose peptona, fonte de nitrogênio de origem animal amplamente utilizada nos cultivos de E. rhusiopathiae para produção de bacterinas, pela peptona de soja hidrolisada Soytone, de origem vegetal, mostrou-se um alternativa promissora para a produção da vacina de células inativadas, contribuindo para aumento da velocidade específica de crescimento e da conversão de substrato em células em relação aos valores obtidos no meio convencional. Em cultivo descontínuo realizado em biorreator de bancada com o meio contendo glicose e Soytone, foi alcançada uma concentração de biomassa de 10 g/L em 5 horas de cultivo. Para o meio convencional, contendo proteose peptona, a máxima concentração celular relatada para ensaio em batelada em biorreator de bancada foi aproximadamente 2 g/L, a qual foi atingida após 7 horas de cultivo. Destaca-se ainda que um nível superior de expressão da proteína antigênica em relação aos observados com a peptona de origem animal foi alcançado nos cultivos realizados com o meio contendo soytone. Esse resultado mostra ser possível incorporar as boas práticas de manufatura recomendadas para produtos farmacêuticos e veterinários, sem prejuízo à produtividade do processo e com significativa redução do custo do meio.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3950.pdf: 2965296 bytes, checksum: 1e00d517bd464f272b8c1a2c9f67ca9c (MD5) Previous issue date: 2011-10-11 / Valée S.A. / Swine erysipelas is among the diseases that causes great economic losses in swine cultures worldwide. The disease is caused by the bacterium Erysipelothrix rhusiopathiae, and the surface protein SpaA is one of its main antigens. Herein, we report studies concerning the development of recombinant vaccines against swine erysipelas based on the SpaA antigen. Protein production for a subunit vaccine formulation was studied in shaken flasks and 5.0 L bioreactors. For this propose, a 1026 bp fragment of the spaA gene was cloned in Escherichia coli cells under the lac promoter control. The recombinant organism (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) was cultivated in fed batch using complex medium with glycerol as carbon source. Nonconventional induction strategies were evaluated and high protein yield (198 mgprot/gDCW) and productivity values (0.4 gprot/L.h) were reached. The same antigen was cloned for expression and secretion in attenuated Salmonella typhimurium cells to obtain a live bacterial vector for the SpaA antigen. The recombinant lineage was able to express and secrete the SpaA fragment fused to the alpha-hemolysin secretion signal both in vitro and in vivo. High plasmid maintenance was observed in both conditions. The vaccinal vehicle showed to be able to colonize the Peyer patches and to invade the gut epithelial barrier in the inoculated animals. Immunization tests in murine model showed that the recombinant antigen delivered by Salmonella cells inoculated by oral route induced the production of seric IgG antibodies anti-SpaA. According to the literature, these antibodies must be able to promote pathogen opsonization in case of infection, contributing to confer a protective immunity against swine erysipelas to the vaccinated animals. In summary, this work presents contributions to development of subunit vaccines against swine erysipelas, in the form of recombinant protein formulations, or SpaA antigen delivery by attenuated S. typhimurium cells. / A erisipela suína é uma das enfermidades que causam grandes prejuízos na suinocultura em todo o mundo. A doença é causada pela bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae, e a proteína de superfície SpaA desse microrganismo é um de seus principais antígenos. Neste trabalho, estudou-se o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a erisipela suína a partir do antígeno SpaA. Avaliou-se a produção de uma vacina de subunidade composta pelo antígeno recombinante, a qual foi estudada em frascos agitados e em biorretores de bancada de 5,0 L. Para isso, um fragmento de 1026 pb do gene spaA foi clonado em células de Escherichia coli sob controle do promotor lac e o organismo recombinante (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) foi cultivado em batelada alimentada, utilizando-se meio complexo contendo glicerol como fonte de carbono. Estratégias não convencionais de indução foram avaliadas e altos valores de rendimento (198 mgprot/gDCW) e produtividade (0,4 gprot/L.h) da proteína recombinante foram alcançados. O mesmo antígeno foi clonado em um plasmídeo que possibilita a expressão e secreção da proteína recombinante em Salmonella typhimurium atenuada, a fim de se obter um vetor bacteriano vivo para o antígeno em questão. A linhagem recombinante foi capaz de expressar e secretar o fragmento da proteína SpaA fusionado ao sinal de secreção da alfa-hemolisina tanto in vitro quanto in vivo, apresentando alta taxa de manutenção plasmidial nas duas condições. Além disso, o veículo vacinal se mostrou capaz de colonizar as placas de Peyer e de invadir a barreira epitelial do intestino dos animais inoculados. Ensaios de imunização em modelo murino mostraram que a veiculação do antígeno pelas células de Salmonella inoculadas por via oral induziu a produção de anticorpos IgG séricos anti-SpaA, que de acordo com a literatura, devem ser capazes de promover a opsonização do patógeno em caso de infecção, contribuindo para conferir uma imunidade protetora contra a erisipela suína aos animais vacinados. Em suma, este trabalho apresenta contribuições para o desenvolvimento de vacinas de subunidade contra a erisipela suína na forma de uma vacina de proteína recombinante, ou por veiculação do antígeno SpaA por linhagens atenuadas de S. typhimurium.