Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-02-23T14:32:27Z No. of bitstreams: 1 TeseBP.pdf: 10262484 bytes, checksum: fba14b7c525ee723da7badf4144c7db2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-03-13T19:29:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBP.pdf: 10262484 bytes, checksum: fba14b7c525ee723da7badf4144c7db2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-03-13T19:29:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBP.pdf: 10262484 bytes, checksum: fba14b7c525ee723da7badf4144c7db2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-13T19:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseBP.pdf: 10262484 bytes, checksum: fba14b7c525ee723da7badf4144c7db2 (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Technological development and market pressure turned polymers into widely used structural materials for several different applications, being manufactured by a wide range of monomers. However, traditional polymers usually show some drawbacks regarding environmental aspects, as most used polymers are produced with nonrenewable feedstock and generate huge amounts of non-biodegradable residues. Therefore it is imperative the sustainable development of new bio-based and biodegradable polymeric materials. The use of microorganisms for obtaining biopolymers is a very promising reality. However, in order to achieve viable production in industrial scale it is necessary to overcome economic barriers, by using microbes with good assimilation of low-cost substrates and high biopolymer yields. As such, the objective of this work was the isolation and identification of bacteria associated with the insect Diabrotica speciosa, as well as the evaluation microbial capacity of biopolymer production. The insect presented great microbial diversity, identified as an underexplored niche with tremendous biotechnological potential for the investigation of novel species and/or strains. In an attempt to find bacterial isolates effective on the production of two classes of biopolymers, polyhydroxyalkanoates (PHA) and exopolysaccharides (EPS), it was obtained 73 strains of bacteria associated with Diabrotica speciosa. These bacteria were identified at genus level by genetic techniques using 16S rDNA sequencing and by proteomic techniques using MALDI-TOF MS. Both characterization methods yielded 100% convergence on results. It was found 17 different bacterial genera, which were submitted to qualitative screening assays in order to identify strains producing PHA using Nile Red dye method, as well as for EPS by using the bacterial spot test. Promising strains on both assays were selected for further quantitative studies and structural characterization of the obtained biopolymers. Quantitative analyses for PHA production corroborated satisfactorily with qualitative results, especially to bacteria from genera Aurantimonas and Delftia which demonstrated high PHA production capacity with 50 and 90% polymer yield on dry mass, both strains being strains able to use substrates such as glucose, acetate and glycerol. GC-MS analyses indicated that Aurantimonas sp. produced mostly a homopolymer of polyhydroxybutyrate (PHB), while Delftia sp. was able to produce a copolymer having butyrate and valerate (PHBV), with up to 10% (w/w) of valerate. Regarding EPS production, the screening showed that the isolates were able to produce polymers in variable amounts, with vast and complex structural variations. Strains from genera Acidovorax, Aurantimonas and Luteibacter were further selected for quantitative analysis of EPS production and analytical characterization of the obtained biopolymer. After analyses using NMR, MALDI-TOF, SEC-UV-ELSD and GC-MS, bacteria from genus Luteibacter produced a highly complex polymer rich in mannose, glucose, fucose and xylose; genus Acidovorax produced a glucomannan-type EPS with a high degree of branching; and genus Aurantimonas was able to produce up to 2 g.L-1 of a water insoluble EPS. In face of these results, it was possible to conclude that D. speciosa microbiota showed to be extremely rich in bacterial species viable for exploratory studies with biotechnological context of biopolymer production. Investigated strains showed promising characteristics to be further evaluated in larger scale (fermenters), especially the bacteria Aurantimonas sp., able to produce PHBV and EPS. / O desenvolvimento tecnológico e a pressão de mercado fizeram com que os polímeros se tornassem materiais estruturais amplamente utilizados em uma grande variedade de aplicações, sendo manufaturados a partir de uma ampla gama de monômeros. Entretanto, estes materiais geralmente apresentam algumas desvantagens do ponto de vista ambiental, pois os polímeros mais utilizados são produzidos com matérias-primas não renováveis e geram grandes volumes de resíduos não biodegradáveis. Assim, torna-se necessário o desenvolvimento sustentável de novos materiais biobaseados e biodegradáveis. O uso de microorganismos para a obtenção deste tipo de polímero é uma realidade bastante promissora. Todavia, para a produção viável em escala industrial é necessário superar barreiras econômicas, através do uso de cepas com boa assimilação de substratos de baixo custo, proporcionando uma alta produtividade. Assim, este trabalho teve por objetivo o isolamento e identificação de bactérias associadas ao inseto Diabrotica speciosa, bem como a avaliação da capacidade microbiana de produção de biopolímeros. O inseto apresentou uma grande diversidade em sua microbiota, mostrando ser este um nicho subexplorado e com enorme potencial para a investigação de novas espécies e/ou isolados. Com o propósito de encontrar isolados eficientes na produção de duas classes de biopolímeros, polihidroxialcanoatos (PHAs) e exopolissacarídeos (EPS), foram obtidos 73 isolados bacterianos do inseto praga Diabrotica speciosa. Todas as cepas foram identificadas em nível de gênero pelo uso de técnicas genéticas, através do sequenciamento de 16S rDNA parcial e por análises proteômicas, avaliando-se o perfil proteico obtido via MALDI-TOF MS. Ambas as técnicas de identificação apresentaram 100% de convergência entre os resultados. Foram encontrados no total 17 gêneros de bactérias, que foram submetidas a ensaios qualitativos de triagem para identificação de isolados produtores de PHAs pelo método do corante vermelho de Nilo, bem como para EPS pelo método do teste de ponto bacteriano. Isolados promissores em ambos os ensaios foram selecionados para estudos quantitativos e caracterização estrutural dos polímeros obtidos. As análises quantitativas para a produção de PHA corroboraram satisfatoriamente com os resultados qualitativos, com destaque para as bactérias do gênero Aurantimonas e Delftia que apresentaram alta capacidade de produção de PHA, com rendimentos de 50 e 90% de polímero em massa seca, respectivamente, sendo ambas as cepas capazes de utilizar substratos como glicose, acetato e glicerol. Análises por GC-MS realizadas após metanólise do polímero indicaram que Aurantimonas sp. produziu majoritariamente homopolímero de polihidroxibutirato (PHB), enquanto Delftia sp. foi capaz de produzir um copolímero contendo monômeros do tipo butirato e valerato (PHBV), contendo até 10% em massa de valerato. Com relação à produção de EPS, a triagem indicou que os isolados se mostraram capazes de produzir polímeros em quantidade variáveis, com uma grande e complexa variação estrutural. Isolados dos gêneros Acidovorax, Aurantimonas e Luteibacter foram selecionados para avaliação quantitativa da produção de EPS e caracterização estrutural do biopolímero. Após análises por NMR, MALDI-TOF, SEC-UV-ELSD e GC-MS, o gênero Luteibacter produziu um polímero altamente complexo contendo manose, glicose, fucose e xilose, o gênero Acidovorax produziu um EPS do tipo glucomanana altamente ramificado;= e o gênero Aurantimonas foi capaz de produzir até 2 g.L-1 de um EPS insolúvel em água. Deste modo, foi possível concluir que a microbiota de D. speciosa se apresentou extremamente rica em isolados microbianos viáveis para estudos exploratórios no contexto biotecnológico de produção de biopolímeros. Os isolados investigados apresentaram características promissoras para serem futuramente avaliadas em escalas maiores (fermentadores), especialmente a bactéria Aurantimonas sp., que foi capaz de produzir tanto PHBV, quanto EPS.

Este trabalho teve como foco principal a caracterização espectroscópica dos haletos de berílio, BeCl, BeBr e BeI. O conhecimento acerca dessas espécies foi ampliado significativamente através do cálculo de parâmetros de difícil caracterização experimental. Como os poucos trabalhos experimentais realizados para esses haletos apresentam resultados inconclusivos para a transição C 2Σ+ - X 2Σ+, através do cálculo acurado de probabilidades de transição foi possível oferecer uma nova interpretação para os dados existentes, apresentando inclusive resultados para as outras transições eletrônicas até o presente desconhecidas. Cálculos utilizando o método de Interação de Configurações Multirreferencial (MRCI) com um conjunto de funções de base consistentes na correlação de qualidade quintupla-zeta foram utilizados para se obter as curvas de energia potencial associadas ao primeiro e segundo canais de dissociação para os estados dubleto e quarteto dessas espécies. Parâmetros espectroscópicos como as constantes vibracionais we, wexe, a constante rotacional Be e a distância de equilíbrio foram determinados para os estados de mais baixa energia. Além disso, foram calculadas a energia de excitação (Te) e a energia de dissociação (De) com e sem a inclusão de efeitos spin-órbita. Os resultados obtidos expandiram significativamente nosso conhecimento sobre os estados eletrônicos dessa espécies. Para os estados já investigados experimentalmente, houve boa coerência entre os parâmetros calculados e experimentais. As diferenças de energia entre os dois canais no limite de dissociação para as moléculas BeCl, BeBr e BeI obtidas neste trabalho foram, respectivamente: 21835, 21889 e 21998 cm-1, em concordância com o respectivo resultado experimental das três espécies (21980 cm-1). A determinação teórica da energia de dissociação D0 foi bastante satisfatória. Obtivemos 92,24; 72,77 e 51,75 kcal·mol-1, respectivamente, para as moléculas BeCl, BeBr e BeI incluindo os efeitos spin-órbita, comparados a 91,78, 71 e 57 kcal·mol-1. Para uma análise mais completa das curvas de energia potencial, elas também foram obtidas considerando-se os efeitos relativísticos. A constante de acoplamento spin-órbita calculada na região de equilíbrio de cada uma das moléculas BeCl, BeBr e BeI foi, respectivamente: 41, 207 e 324 cm-1, em boa concordância com os resultados experimentais: 52,8, 198 e 361,1 cm-1, respectivamente. A separação spin-órbita no limite de dissociação calculada foi de 823, 3446 e 6975 cm-1 (BeCl, BeBr e BeI), também coerentes com resultados experimentais: 882, 3685,24 e 7603,15 cm-1, respectivamente. Foi ainda realizada uma análise detalhada sobre os canais de dissociação das moléculas HBeP e BePH. A construção de um diagrama de energias relativas permitiu obter um conjunto de dados importantes a respeito de todos os possíveis canais de dissociação. Em particular é mostrado a estabilidade relativa e a energia no limite de dissociação. Para a energia no limite de dissociação obtivemos resultados consistentes com os valores experimentais. Nossos cálculos para os três primeiros canais de dissociação HBeP = H + Be resultaram nos seguintes valores: H (2Sg) + Be (X 4Σ+), 0 cm-1; H (2Sg) + Be (a 2π), 426 cm-1 (exp. 502 cm-1); H (2Sg) + Be (b 2Σ-), 1896 cm-1 (exp. 1976 cm-1). Por fim, pela primeira vez na literatura, o calor de formação e de atomização foram calculados para estas espécies. Para os isômeros HBeP e BePH, a energia de atomização a 298,15 K calculada foi de 119,02 kcal·mol-1 e 107,40 kcal·mol-1, respectivamente; para o calor de formação a 298,15 K, obtivemos 86,14 e 97,76 kcal·mol-1 para as espécies HBeP e BePH, respectivamente. / This work has mainly focused on the spectroscopic characterization of the beryllium halides, BeCl, BeBr and BeI. Knowledge about these species was substantially increased through the calculation of parameters that are difficult to access in an experimental characterization. As the few experimental works carried out for these halides presented inconclusive results for the C 2Σ+ - X2Σ+ transition, we carried out accurate calculations of transition probabilities, thus offering a new interpretation about the existing data, including also results for other electronic transitions as yet unknown. Calculations using the method Multireference Configuration Interaction (MRCI) along with correlation-consistent basis set functions of quintuple-zeta quality were used to obtain the potential energy curves associated with the first and second dissociation channels for the doublet and quartet states of these species. Spectroscopic parameters such as vibrational constants We, WeXe, the rotational constant Be and the equilibrium distance were determined for the low-lying states. Furthermore, we also calculated the excitation energy (Te) and the dissociation energy (De) with and without the inclusion of spin-orbit effects. The obtained results significantly expanded our knowledge about the electronic states of this species. For states already investigated experimentally, there was good consistency between the calculated and the experimental parameters. The energy differences between the two channels in the dissociation limit for BeCI, BeBr and Bel molecules obtained in this work were: 21835, 21889 and 21998 cm-1, in agreement with the corresponding experimental results of the three species (21 980 cm-1). The theoretical determination of the dissociation energy D0 was very satisfactory. We obtained 92.24, 72.77, and 51.75 kcal·mol-1, respectively, for the BeCl, BeBr and BeI molecules including spin-orbit effects, compared to 91.78, 71 and 57 kcal . mol-1. For a more complete analysis of the potential energy curves, they also were obtained considering relativistic effects. The calculated spin-orbit coupling constants in the equilibrium region of BeCl, BeBr and BeI molecules were respectively 41, 207 and 324 cm-1, in good agreement with the experimental results: 52.8, 198, and 361.1 cm-1, respectively. The calculated spin-orbit splitting in the dissociation limit was 823, 3446 and 6975 cm-1 (BeCl, BeBr and BeI) also consistent with the experimental results: 882, 3685.24 and 7603.15 cm-1, respectively. Additionally, a detailed analysis of the dissociation channels of HBeP and BePH molecules was performed. The construction of a relative energies diagram allowed us to derive a set of important data for all the possible dissociation channels. In particular, it is shown the relative stability and the energy in the dissociation limit. For the energy in the dissociation limit, we obtained results consistent with the experimental values. Our calculations for the first three dissociation channels HBeP = H + Be resulted in the following values: H (2Sg) + Be (X 4Σ+), 0 cm-1; H (2Sg) + Be (a 2π), 426 cm-1 (exp. 502 cm-1); H (2Sg) + Be (b 2Σ-), 1896 cm-1 (exp. 1976 cm-1). Finally, for the first time in the literature, the heat of formation and the atomization energy were calculated for these species. For the HBeP and BePH isomers, the atomization energy calculated at 298.15 K was 119.02 and 107.40 kcal . mol-1, respectively; for the heat of formation at 298.15 K, we obtained 86.14 and 97.76 kcal· mol-1 for HBeP and BePH species, respectively.

Recentemente, a dopagem de semicondutores (envolvendo compostos II-VI, IV-VI, III-V, e do grupo-IV) com espécies magnéticas tem sido extensivamente investigada em função do seu potencial em spintrônica. Neste contexto, semicondutores magnéticos baseados no Si e no Ge são atraentes devido à sua compatibilidade com a indústria de semicondutores existente. Entretanto, a solubilidade das espécies magnéticas nestes materiais em forma cristalina é muito baixa e, consequentemente, sua atividade magnética é limitada. Este não é o caso para o silício amorfo (a-Si) e o germânio amorfo (a-Ge), que podem conter elementos magnéticos além do limite de solubilidade de seus análogos cristalinos, e apresentar propriedades magnéticas notáveis. Motivado por estes fatos, este trabalho apresenta uma investigação abrangente de filmes finos de Si e Ge contendo diferentes quantidades de Mn e Co, trazendo informações úteis no entendimento das propriedades desta classe de materiais. As amostras foram preparadas por co-sputtering, e possuíram concentrações de Mn na faixa de ~ 0.1-24 at.%, e de Co na faixa de ~ 1-10 at.%. Após a deposição, os filmes foram submetidos a tratamentos térmicos cumulativos até 900 oC, e foram investigados por: espectroscopia de energia dispersiva de raios-x (EDS); espalhamento Raman; difração de raios-x; transmissão óptica; microscopias eletrônica de varredura (SEM), de força atômica (AFM) e de força magnética (MFM); magnetometria SQUID; método de van der Pauw; etc. Para fins comparativos, amostras puras também foram preparadas, tratadas e caracterizadas de forma similar. Os presentes resultados indicam que os átomos de Mn e Co foram incorporados de forma efetiva e homogênea nas matrizes amorfas. Além disso, os filmes sem tratamento (puros ou contendo impurezas) são essencialmente amorfos. Ao contrário, tratamentos em altas temperaturas induzem a cristalização das amostras, e alterações em suas demais características, dependentes da introdução de dopantes. Desta forma: suas propriedades estruturais, ópticas, morfológicas, elétricas, e magnéticas, são notadamente afetadas pela inserção de Mn e Co, e pela temperatura de tratamento térmico. Estas observações foram sistematicamente investigadas e serão apresentadas e discutidas em detalhe. / Along the last few years, the doping of semiconductors (either II-VI, IV-VI, III-V, and group-IV compounds) with magnetic species have been extensively studied due to their potential applications in spintronics. Among them, Si- and Ge-based magnetic semiconductors are very attractive because of their total compatibility with the well-established current semiconductor technology. In the crystalline form, however, these materials exhibit a low solubility limit to magnetic species and, consequently, limited magnetic activity. This is not the case for amorphous (a-)Si and a-Ge, which can contain magnetic elements beyond the solubility limit of their crystalline counterparts, and present improved magnetic properties. Motivated by these facts, this work contains a comprehensive investigation of Si and Ge thin films containing different amounts of Mn and Co, providing useful information concerning the properties of this class of materials. The samples were prepared by co-sputtering, rendering Mn concentrations in the ~ 0.1-24 at.% range, and Co contents in the ~ 1-10 at.% range. After deposition, the films were submitted to isochronal thermal annealing treatments up to 900 oC and investigated by: energy dispersive x-ray spectrometry (EDS); Raman scattering spectroscopy; x-ray diffraction; optical transmission measurements; scanning electron (SEM), atomic force (AFM) and magnetic force (MFM) microscopy techniques; SQUID magnetometry; van der Pauw technique; etc. For comparison purposes, pure samples were also prepared, annealed and characterized in a similar way. The present experimental results indicate that the Mn and Co atoms were effectively and homogenously incorporated into the amorphous hosts. Moreover, the as-deposited films (either pure or doped) are essentially amorphous. On the contrary, thermal annealing at increasing temperatures induces the crystallization of the samples, and changes in their further characteristics, that are dependent of the doping. In this way: their structural, optical, morphological, electrical, and magnetic properties, etc., are notably affected by the insertion of Mn and Co, and by the temperature of thermal annealing. These experimental observations were systematically studied and will be presented and discussed in detail.

[ES] Esta tesis se ha centrado en el modelado, diseño y demostración experimental de un sensor espectroscópico integrado basado en un AWG (del inglés Arrayed Waveguide Grating). El dispositivo ha sido diseñado y fabricado en una nueva plataforma de nitruro de silico (Si3N4) en oxido de silico (SiO2) desarrollada en España. El trabajo realizado en esta tesis se puede dividir en dos secciones principalmente. En la primera parte, se describe el panorama general de las plataformas de Si3N4 existentes y su estado del arte, junto con la descripción de los procesos de fabricación y caracterización de nuestra plataforma de Si3N4 con 300 nm de altura en la capa de guiado. En la segunda parte, se presenta el dispositivo bautizado como Integrated Optical Spectroscopic Sensor (IOSS). El IOSS consiste en un AWG cuyo conjunto de guías de onda está dividido en dos subgupos diseñados para replicar los canales del AWG. Las guías de uno de los subgrupos contienen ventanas de sensado, que están definidas por secciones en las que el núcleo de las guías está al descubierto y, por tanto, en contacto con el medio que las rodea. De esta manera, el sensado se lleva a cabo mediante la interacción del campo evanescente con la muestra depositada. Las guías del segundo subconjunto permanecen inalteradas. Por lo tanto, el dispositivo proporciona al mismo tiempo los espectros de sensado y de referencia. El modelo matemático del IOSS, su procedimiento de diseño y la prueba de concepto del sensor configurado para espectroscopía de absorción se describen en esta tesis. / [CAT] La present tesi s'ha centrat en el modelatge, disseny i demostració experimental d'un sensor espectroscòpic integrat basat en un AWG (de l'anglès Arrayed Waveguide Grating). El dispositiu ha sigut dissenyat i fabricat en una nova plataforma de nitrur de silici (Si3N4) en òxid de silici (SiO2) desenvolupada a Espanya. El treball realitzat en aquesta tesi es pot dividir en dues seccions principalment. En la primera part, es descriu el panorama general de les plataformes de Si3N4 existents i el seu estat de l'art, juntament amb la descripció dels processos de fabricació i caracterització de la nostra plataforma de Si3N4 amb 300 nm d'altura en la capa de guiat. En la segona part, es presenta el dispositiu batejat com Integrated Optical Spectroscopic Sensor (IOSS). El IOSS consisteix en un AWG en el que el seu conjunt de guies d'ona està dividit en dos subgrups dissenyats per a replicar els canals del AWG. Les guies d'un dels subgrups conté finestres de detecció, que estan definides per seccions en les quals el nucli de les guies d'ona està al descobert i en contacte amb el mitjà que li envolta. D'aquesta manera, la detecció es duu a terme mitjançant la interacció del camp evanescent amb la mostra depositada. Les guies del segon subconjunt romanen inalterades. Per tant, el dispositiu proporciona al mateix temps els espectres de detecció de referència. El model matemàtic del IOSS, el seu procediment de disseny i la prova de concepte del sensor configurat per a espectroscopia d'absorció es descriuen en aquesta tesi. / [EN] This thesis is focused on the model, design and experimental demonstration of an integrated spectroscopic sensor based on a modified Arrayed Waveguide Grating (AWG). The device has been designed and fabricated in a new silicon nitride (Si3N4) on silicon oxide (SiO2) platform developed in Spain. The work performed for this thesis can be then divided into two main sections. In the first part, an overview of the existing Si3N4 platforms and their state of art is described, alongside the report on the fabrication and characterization of our 300 nm guiding film height Si3N4 platform. On the second part, the device named Integrated Optical Spectroscopic Sensor (IOSS) is presented. The IOSS consists of an AWG which arrayed waveguides are divided into two sub-sets engineered to replicate the AWG channels. The waveguides of one of the sub-sets contain sensing windows, defined as waveguides sections which core is in contact with the surrounding media. Thus, the sensing is performed through evanescent field interaction with the sample deposited. The waveguides from the second sub-set remain isolated. Therefore, the device provides both sensing and reference spectra. The IOSS mathematical model, design procedure and proof of concept configured for absorption spectroscopy are reported in this thesis. / Micó Cabanes, G. (2020). Integrated Spectroscopic Sensor fabricated in a novel Si3N4 platform [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/159381 / TESIS

O mecanismo de ação da Histatina-5 (Hst-5), um peptídeo antimicrobiano da saliva humana com ação fungicida, não está esclarecido. Dicroísmo circular (CD), fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram empregados para examinar as propriedades conformacionais de Hst-5 e seu análogo contendo o aminoácido paramagnético TOAC N-terminal (TOAC0-Hst-5) em solução aquosa, em função do pH, de TFE, e de íons metálicos, e em presença de membranas modelo de composição. Foi examinada a atividade dos dois peptídeos em membranas lipídicas planas, na permeabilização de membranas modelo e frente o fungo Candida albicans e eritrócitos humanos, com o objetivo de estabelecer correlações entre a atividade e a estrutura dos peptídeos. Estudos de fluorescência mostraram a capacidade de TOAC de suprimir a fluorescência e que o pK dos resíduos de Tyr foram deslocados. Espectros de CD mostraram pequenas flutuações conformacionais, mas foram mantidas estruturas ao acaso. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 mostraram a coexistência de duas populações, protonada e desprotonada, em troca lenta. A partir de medidas de desdobramento hiperfino (aN), foram calculados pKs de TOAC; a relação de altura dos picos de campo central e alto também foi sensível à titulação do peptídeo. Em TFE os peptídeos adotaram conformação α-helicoidal (CD). Espectros de fluorescência de Hst-5 mostraram aumento da fluorescência, e os de TOAC0-Hst-5 mostraram supressão, indicando aproximação de TOAC dos resíduos de Tyr. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 também refletiram as mudanças conformacionais. Estudos de fluorescência mostraram a interação de Hst-5 e TOAC0-Hst-5 com Cu2+, Mn2+ e Zn2+, permitindo o cálculo de constantes de ligação. Espectros de CD refletiram pequenas variações conformacionais, sem aquisição de estrutura secundária. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 na presença dos íons paramagnéticos Cu2+ e Mn2+ indicaram interações spin-spin, permitindo o cálculo das distâncias metal-nitróxido. Curvas de tempo de correlação rotacional em função da concentração dos íons permitiram calcular constantes de ligação da mesma ordem de grandeza daquelas obtidas por fluorescência. Hst-5 e TOAC0-Hst-5 ligaram-se em maior extensão a micelas negativas do que a zwitteriônicas num processo pH-dependente. Estudos de supressão de fluorescência por acrilamida confirmaram esses resultados, indicando a modulação por interações eletrostáticas. Espectros de CD mostraram que os peptídeos adotam conformação em dobra β tipo I. Estudos de RPE da interação de TOAC0-Hst-5 com vesículas de composição lipídica mimetizando membranas de E. coli e C. albicans (carga líquida negativa) e eritrócitos (carga líquida zero) confirmaram essa modulaçao. Na presença das membranas negativamente carregadas os espectros apresentaram extremos externos e internos, indicando que o eixo z do nitróxido orienta-se paralelamente à normal à bicamada. Estudos funcionais utilizando bicamadas lipídicas planas mostraram que TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, forma poros. Também, TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, permeabiliza vesículas carregadas negativamente. Ainda, a atividade fungicida de TOAC0-Hst-5 foi maior do que a de Hst-5 na ausência de íons, porém foi a mesma na presença de Mn2+ e Zn2+. Finalmente, TOAC0-Hst-5 mostrou maior atividade hemolítica que Hst-5. Esses resultados sugerem uma possível diferença nos mecanismos de ação de Hst-5 e seu análogo marcado, apesar da semelhança no comportamento conformacional dos peptídeos. / The mechanism of action of histatin-5 (Hst-5), an antifungal antimicrobial peptide from human saliva is not completely clarified. Circular dichroism (CD), fluorescence, and electron paramagnetic resonance (EPR) were used to examine the conformational behavior of Hst-5 and its analogue containing the paramagnetic amino acid TOAC at the N-terminus (TOAC0-Hst-5). Conformational properties were investigated in aqueous solution, as a function of pH, TFE, and addition of metal ions, and in the presence of model membranes of variable lipid composition. The activity of both peptides was examined in planar lipid membranes and with regard to permeabilization of model membranes. Activity was also tested towards the fungus Candida albicans and human erythrocytes, with the scope of establishing structure-function correlations. Fluorescence studies showed that TOAC0-Hst-5 is able to quench the peptide fluorescence and that the pK of the Tyr residues was shifted to lower values. CD spectra indicated that small conformational fluctuations occurred with increasing pH, but the overall unordered structure of the peptides was kept. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 showed the coexistence of two populations, one protonated and one unprotonated, in slow exchange. The pK of TOAC was calculated from measurements of the isotropic hyperfine splitting (aN); the ratios of heights of the mid-field line and the high-field line were also sensitive to the peptide titration. In TFE, the peptides acquired -helical conformation (CD). Fluorescence spectra of Hst-5 showed an increase of fluorescence, while those of TOAC0-Hst-5 revealed quenching, indicating that, on the average, the TOAC residue becomes closer to the Tyr residues as a consequence of the peptide acquiring α-helical conformation. EPR spectra also reflected the conformational changes undergone by the peptide. Fluorescence studies indicated that Hst-5 and its spin labeled analogue interacted with Cu2+, Zn2+, and Mn2+ ions, allowing the calculation of binding constants. CD spectra reflected the occurrence of small conformational fluctuations, without acquisition of stable secondary structure. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 in the presence of the paramagnetic ions Cu2+ and Mn2+ evinced the occurrence of spin-spin interactions, allowing the calculation of metal-nitroxide distances. Curves of rotational correlation times as a function of ion concentration yielded values for the binding constants of the same order of magnitude as those calculated from fluorescence measurements. Hst-5 and TOAC0-Hst-5 bound to a larger extent to negatively charged than to zwitterionic micelles, in a pH-dependent process. Studies of fluorescence quenching by water soluble acrylamide confirmed these results, pointing to the fact that binding is largely modulated by electrostatic interactions. CD spectra indicated that, upon binding to micelles, the peptides acquire a type I β-turn conformation. EPR studies of the interaction between TOAC0-Hst-5 and lipid vesicles whose composition mimicked those of E. coli and C. albicans (both with net negative surface charge) and erythrocytes (net zero surface charge) confirmed this modulation. In the presence of negatively charged membranes, the spectra presented outer and inner extrema, indicating that the nitroxide z axis is oriented parallel to the bilayer normal. Functional studies with planar lipid bilayers showed that TOAC0-Hst-5, but not the native peptide, forms pores. Also, TOAC0-Hst-5, but not Hst-5, permeabilizes negatively charged vesicles. Moreover, the fungicidal activity of TOAC0-Hst-5 was greater than that of Hst-5 in the absence of metal ions. However, in contrast with the native peptide, whose activity increased in the presence of Zn2+ and Mn2+, that of the analogue was the same in the absence and presence of the ions. Finally, TOAC0-Hst-5 had a more pronounced hemolytic activity than Hst-5. These results suggest a possible difference in the mechanisms of action of Hst-5 and its spin labeled analogue, in spite of the similarity of their conformational behavior.

O mecanismo de ação da Histatina-5 (Hst-5), um peptídeo antimicrobiano da saliva humana com ação fungicida, não está esclarecido. Dicroísmo circular (CD), fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram empregados para examinar as propriedades conformacionais de Hst-5 e seu análogo contendo o aminoácido paramagnético TOAC N-terminal (TOAC0-Hst-5) em solução aquosa, em função do pH, de TFE, e de íons metálicos, e em presença de membranas modelo de composição. Foi examinada a atividade dos dois peptídeos em membranas lipídicas planas, na permeabilização de membranas modelo e frente o fungo Candida albicans e eritrócitos humanos, com o objetivo de estabelecer correlações entre a atividade e a estrutura dos peptídeos. Estudos de fluorescência mostraram a capacidade de TOAC de suprimir a fluorescência e que o pK dos resíduos de Tyr foram deslocados. Espectros de CD mostraram pequenas flutuações conformacionais, mas foram mantidas estruturas ao acaso. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 mostraram a coexistência de duas populações, protonada e desprotonada, em troca lenta. A partir de medidas de desdobramento hiperfino (aN), foram calculados pKs de TOAC; a relação de altura dos picos de campo central e alto também foi sensível à titulação do peptídeo. Em TFE os peptídeos adotaram conformação α-helicoidal (CD). Espectros de fluorescência de Hst-5 mostraram aumento da fluorescência, e os de TOAC0-Hst-5 mostraram supressão, indicando aproximação de TOAC dos resíduos de Tyr. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 também refletiram as mudanças conformacionais. Estudos de fluorescência mostraram a interação de Hst-5 e TOAC0-Hst-5 com Cu2+, Mn2+ e Zn2+, permitindo o cálculo de constantes de ligação. Espectros de CD refletiram pequenas variações conformacionais, sem aquisição de estrutura secundária. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 na presença dos íons paramagnéticos Cu2+ e Mn2+ indicaram interações spin-spin, permitindo o cálculo das distâncias metal-nitróxido. Curvas de tempo de correlação rotacional em função da concentração dos íons permitiram calcular constantes de ligação da mesma ordem de grandeza daquelas obtidas por fluorescência. Hst-5 e TOAC0-Hst-5 ligaram-se em maior extensão a micelas negativas do que a zwitteriônicas num processo pH-dependente. Estudos de supressão de fluorescência por acrilamida confirmaram esses resultados, indicando a modulação por interações eletrostáticas. Espectros de CD mostraram que os peptídeos adotam conformação em dobra β tipo I. Estudos de RPE da interação de TOAC0-Hst-5 com vesículas de composição lipídica mimetizando membranas de E. coli e C. albicans (carga líquida negativa) e eritrócitos (carga líquida zero) confirmaram essa modulaçao. Na presença das membranas negativamente carregadas os espectros apresentaram extremos externos e internos, indicando que o eixo z do nitróxido orienta-se paralelamente à normal à bicamada. Estudos funcionais utilizando bicamadas lipídicas planas mostraram que TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, forma poros. Também, TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, permeabiliza vesículas carregadas negativamente. Ainda, a atividade fungicida de TOAC0-Hst-5 foi maior do que a de Hst-5 na ausência de íons, porém foi a mesma na presença de Mn2+ e Zn2+. Finalmente, TOAC0-Hst-5 mostrou maior atividade hemolítica que Hst-5. Esses resultados sugerem uma possível diferença nos mecanismos de ação de Hst-5 e seu análogo marcado, apesar da semelhança no comportamento conformacional dos peptídeos. / The mechanism of action of histatin-5 (Hst-5), an antifungal antimicrobial peptide from human saliva is not completely clarified. Circular dichroism (CD), fluorescence, and electron paramagnetic resonance (EPR) were used to examine the conformational behavior of Hst-5 and its analogue containing the paramagnetic amino acid TOAC at the N-terminus (TOAC0-Hst-5). Conformational properties were investigated in aqueous solution, as a function of pH, TFE, and addition of metal ions, and in the presence of model membranes of variable lipid composition. The activity of both peptides was examined in planar lipid membranes and with regard to permeabilization of model membranes. Activity was also tested towards the fungus Candida albicans and human erythrocytes, with the scope of establishing structure-function correlations. Fluorescence studies showed that TOAC0-Hst-5 is able to quench the peptide fluorescence and that the pK of the Tyr residues was shifted to lower values. CD spectra indicated that small conformational fluctuations occurred with increasing pH, but the overall unordered structure of the peptides was kept. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 showed the coexistence of two populations, one protonated and one unprotonated, in slow exchange. The pK of TOAC was calculated from measurements of the isotropic hyperfine splitting (aN); the ratios of heights of the mid-field line and the high-field line were also sensitive to the peptide titration. In TFE, the peptides acquired -helical conformation (CD). Fluorescence spectra of Hst-5 showed an increase of fluorescence, while those of TOAC0-Hst-5 revealed quenching, indicating that, on the average, the TOAC residue becomes closer to the Tyr residues as a consequence of the peptide acquiring α-helical conformation. EPR spectra also reflected the conformational changes undergone by the peptide. Fluorescence studies indicated that Hst-5 and its spin labeled analogue interacted with Cu2+, Zn2+, and Mn2+ ions, allowing the calculation of binding constants. CD spectra reflected the occurrence of small conformational fluctuations, without acquisition of stable secondary structure. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 in the presence of the paramagnetic ions Cu2+ and Mn2+ evinced the occurrence of spin-spin interactions, allowing the calculation of metal-nitroxide distances. Curves of rotational correlation times as a function of ion concentration yielded values for the binding constants of the same order of magnitude as those calculated from fluorescence measurements. Hst-5 and TOAC0-Hst-5 bound to a larger extent to negatively charged than to zwitterionic micelles, in a pH-dependent process. Studies of fluorescence quenching by water soluble acrylamide confirmed these results, pointing to the fact that binding is largely modulated by electrostatic interactions. CD spectra indicated that, upon binding to micelles, the peptides acquire a type I β-turn conformation. EPR studies of the interaction between TOAC0-Hst-5 and lipid vesicles whose composition mimicked those of E. coli and C. albicans (both with net negative surface charge) and erythrocytes (net zero surface charge) confirmed this modulation. In the presence of negatively charged membranes, the spectra presented outer and inner extrema, indicating that the nitroxide z axis is oriented parallel to the bilayer normal. Functional studies with planar lipid bilayers showed that TOAC0-Hst-5, but not the native peptide, forms pores. Also, TOAC0-Hst-5, but not Hst-5, permeabilizes negatively charged vesicles. Moreover, the fungicidal activity of TOAC0-Hst-5 was greater than that of Hst-5 in the absence of metal ions. However, in contrast with the native peptide, whose activity increased in the presence of Zn2+ and Mn2+, that of the analogue was the same in the absence and presence of the ions. Finally, TOAC0-Hst-5 had a more pronounced hemolytic activity than Hst-5. These results suggest a possible difference in the mechanisms of action of Hst-5 and its spin labeled analogue, in spite of the similarity of their conformational behavior.