Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-05-02T23:09:42Z No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-05-07T23:08:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T23:08:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / A leishmaniose visceral é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, podendo ser letal quando não há tratamento adequado. Estima-se que existem 12 milhões de pessoas infectadas pela doença, mas infelizmente não há nenhuma vacina capaz de prevenir a doença. Ademais, o tratamento da doença apresenta alto custo e elevada toxicidade. Diante disso, deve-se destacar a pesquisa de componentes antigênicos purificados que possam ser utilizados como ferramenta para obtenção de vacinas ou testes para diagnóstico específico. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a influência da concentração de IPTG durante a indução e a influência da temperatura de cultivo na expressão do antígeno 503 e na estabilidade do plasmídeo pQE-30 em Escherichia coli. Todos os ensaios foram realizados em incubador rotativo e feitos em duplicata. Primeiramente foram realizados cultivos induzidos com IPTG nas concentrações de: 0,01 mM; 0,1 mM; 0,5 mM; 1,0 mM e 1,5 mM na temperatura de 37 °C. A concentração de indutor não afetou a estabilidade do plasmídeo e quando induzido com 1,0 mM, a expressão de antígeno 503 máxima foi de 0,101 ± 0,004 g/L. Foi possível verificar que a menor concentração de IPTG utilizada foi o suficiente para conseguir a expressão da proteína recombinante. Em seguida, a concentração de IPTG foi fixada em 1,0 mM e avaliadas as temperaturas de cultivo de 27, 32 e 42 °C. Estes ensaios foram comparados com o ensaio realizado anterior a 37 °C. A temperatura influenciou a estabilidade do plasmídeo, sendo que quanto menor a temperatura de cultivo, maior estabilidade. De acordo com os resultados, foi possível verificar que a temperatura de 37 °C obteve maior expressão do antígeno 503, sendo considerada portanto, as condições ótimas para produção de antígeno 503 em incubador rotativo. / Visceral leishmaniasis is an infectious-parasitic disease caused by protozoa of the genus Leishmania, which can be lethal when there is no adequate treatment. It is estimated that there are 12 million people infected by the disease, but unfortunately there is no vaccine capable of preventing the disease. In addition, the treatment of the disease presents high cost and high toxicity. Therefore, we must highlight the research of purified antigenic components that can be used as a tool to obtain vaccines or tests for specific diagnosis. In this context, the present work aims to evaluate the influence of the concentration of IPTG during the induction and the influence of culture temperature on 503 antigen expression and on the stability of plasmid pQE-30 in Escherichia coli. All assays were performed in a rotary incubator and made in duplicate. First, IPTG induced cultures were carried out at concentrations of: 0.01 mM; 0.1 mM; 0.5 mM; 1.0 mM and 1.5 mM at 37 °C. The concentration of the inducer did not affect the stability of the plasmid and when induced with 1.0 mM, the 503 antigen expression was maximal 0.101 ± 0.004 g / L. It was possible to verify that the lowest concentration of IPTG used was enough to achieve expression of the recombinant protein. Thereafter, the concentration of IPTG was fixed at 1.0 mM and the cultivation temperatures of 27, 32 and 42 °C were evaluated. These assays were compared with the previous assay performed at 37 °C. Temperature influenced the stability of the plasmid, and the lower the culture temperature, the greater the stability. According to the results, the temperature of 37 °C obtained the highest expression of 503 antigen, being considered therefore, the optimal conditions for 503 antigen production in a rotary incubator.

Os neutrófilos são glóbulos brancos do sangue e primeira linha de defesa contra as bactérias. A proliferação destas células é principalmente controlada pelo Fator Estimulador de Colônia de Granulócito (G-CSF). O G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) é um medicamento amplamente utilizado para tratar a neutropenia, condição caracterizada pela contagem de neutrófilos abaixo de 1.500/mm3. O rhG-CSF já foi obtido no Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan em E. coli como corpos de inclusão (CI), reportando-se instabilidade do plasmídeo e baixo rendimento. Neste trabalho, o plasmídeo pARKAN-I foi avaliado para produzir rhG-CSF em E. coli e viabilizar sua obtenção em biorreator. Esse vetor carrega a sequência pAR, inserida para aumentar sua estabilidade. E. coli BL21 (DE3) Star pLysS transformada com pARKAN-I/rhG-CSF foi cultivada em frascos agitados para avaliação da estabilidade do plasmídeo em meios complexos (2YT e de autoindução) e quimicamente definido (HDF). Avaliou-se a influência de indutores (IPTG e lactose), glicose e antibióticos sobre a estabilidade plasmidial. A fim de se obter material para purificação, foram realizados cultivos em biorreator com meio de autoindução sem antibióticos em modo batelada e HDF com antibióticos em modo batelada alimentada, a 30ºC, 30% de oxigênio e pH 6,8. As etapas de purificação incluíram: lise em homogeneizador contínuo de alta pressão, lavagens, solubilização e renaturação dos CI, e cromatografia de troca catiônica em SP-Sepharose. Avaliaram-se três métodos de renaturação: diafiltração, diálise e diluição. A estabilidade do plasmídeo foi avaliada pela percentagem de colônias obtidas em placas de LB-ágar com antibiótico em relação às colônias que cresceram nas placas de LB-ágar sem antibiótico. A identidade proteica foi determinada por SDS-PAGE e Western Blotting. A pureza relativa e a produção específica do rhG-CSF foram determinadas por densitometria das bandas da eletroforese. A quantificação proteica foi feita pelo método do ácido bicinconínico. Nos cultivos em frascos com meio 2YT sem glicose, o crescimento foi mais lento, porém a fase exponencial mais prolongada, alcançando concentração celular (Cx) mais elevada (2,56 g/L) do que as culturas com glicose (Cx1,35 g/L), que cresceram mais rápido e chegaram primeiro à fase estacionária. O cultivo com meio de autoindução proporcionou crescimento similar ao do meio 2YT sem glicose. Em meio HDF, os cultivos tiveram o crescimento mais lento e menor Cx (0,94 g/L). Os meios 2YT e de autoindução mostraram 100% de colônias resistentes à canamicina antes e após indução, exceto o 2YT sem antibiótico e sem glicose, com 97,5% e 94,1% após 6 e 8 h de indução, respectivamente, coincidindo com a maior produção de rhG-CSF. Em frascos, o meio HDF com antibiótico teve 93% de colônias resistentes antes da indução dos cultivos em frascos, diminuindo até 85% após 4 h de indução, com baixa produção do rhG-CSF, verificada apenas por Western Blotting. Os cultivos em biorreator mostraram baixa velocidade específica de crescimento (0,30 h-1), porém elevada Cx e produção de rhG-CSF, sendo superior no meio de autoindução, que também resultou mais barato do que o HDF. O método de diluição em tampão tris 20 mM pH 8,0 com EDTA 2 mM, Triton X-100 0,1% e glicerol 10% apresentou maior percentagem de renaturação. Foi estabelecido um processo de purificação que permitiu obter rhG-CSF com 87% de pureza, integridade estrutural e atividade biológica. O plasmídeo pARKAN-I, vetor sem restrições de propriedade intelectual e proteção de patente, mostrou alta estabilidade nos meios complexos avaliados, tanto em frasco como em biorreator, permitindo produzir rhG-CSF em larga escala sem adição de antibióticos ao meio de cultura, o que reduziu o custo do processo de obtenção. / Neutrophils are white blood cells and part of the first line of defense against bacteria. The proliferation of these cells is mainly controlled by the Granulocyte Colony Stimulating Factor (GCSF). Recombinant human G-CSF (rhG-CSF) is widely used to treat neutropenia, condition characterized by a neutrophil count below 1,500/ mm3. The rhG-CSF was already obtained at the Biotechnology Center of the Butantan Institute in E. coli as inclusion bodies (IB), but plasmid instability and low yield were reported. In this work, the plasmid pARKAN-I was evaluated to produce rhG-CSF in E. coli and enable the bioreactor production. This vector carries a Par sequence, inserted to increase its stability. E. coli BL21 (DE3) Star pLysS transformed with pARKAN-I / rhG-CSF was grown in shaken flasks to evaluate the plasmid stability in complex (2YT and autoinduction) and chemically defined (HDF) media. Also, the influence of inducers (IPTG and lactose), the addition of glucose and the presence of antibiotics on the plasmid stability were evaluated. In order to obtain material for rhG-CSF purification, a batch culture with autoinduction medium without antibiotic and fed-batch culture HDF medium with antibiotic were performance in bioreactor at 30º C, 30% oxygen and pH 6.8. The purification steps included: lysis in high pressure continuous homogenizer, wash, solubiliztion and refolding of IB and cation exchange chromatography in SP-Sepharose. Three refolding methods were evaluated: diafiltration, dialysis and dilution. Plasmid stability was evaluated by the percentage of colonies on LB-agar plates with antibiotic in relation to the colonies that grew on LB-agar plates without antibiotics. Protein identity was determined by SDS-PAGE and Western Blotting. Relative purity and specific production of rhG-CSF were determined by densitometry of SDS-PAGE bands. Protein quantification was performed by the bicinchoninic acid method. In shaken flask cultures with 2YT medium without glucose, the growth was slower, but the exponential phase was longer, reaching higher cell concentration (Cx=2.56 g/L) than the cultures in 2YT medium with glucose (Cx≈1.35 g/L), which grew faster and reached the stationary phase earlier. Cultures with autoinduction medium provided similar growth to the 2YT medium without glucose. Cultures with HDF medium displayed slower growth and lower Cx (0.94 g/L). Shaken flask cultures with 2YT and autoinduction media showed 100% of kanamycin resistant colonies before and after induction, except for 2YT without antibiotic and without glucose, which presented 97.5% and 94.1% of kanamycin resistant colonies after 6 and 8 h of induction, respectively, despite being the medium with higher production of rhG-CSF. In flasks, HDF medium with antibiotic presented 93% of kanamycin resistant colonies before induction, decreasing to 85% after 4 h of induction, the rhGCSF production was very low, and could be verified only by Western Blotting. Bioreactor cultivations showed low specific growth rate (0.30 h-1), but high cell density and recombinant protein production. The rhG-CSF production was higher in autoinduction medium, which was cheaper than HDF. The dilution method using 20 mM tris buffer pH 8.0, 2 mM EDTA, 0.1% Triton X-100 and 10% glycerol showed the highest percentage of refolding. A purification process was established and allowed to obtain rhG-CSF with 87% purity, structural integrity and biological activity. The expression vector pARKAN-I, which is free of intellectual property and patent protection, showed high plasmid stability in the complex media evaluated in flask and bioreactor and allowed to produce rhG-CSF in large scale without addition of antibiotics to the culture medium, reducing the cost of the production process.

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.