Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-06-23T18:11:28Z No. of bitstreams: 1 DissJRFN.pdf: 1477527 bytes, checksum: cb09da4bfdd14f1e2c076f57d365b7a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-06-28T08:18:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJRFN.pdf: 1477527 bytes, checksum: cb09da4bfdd14f1e2c076f57d365b7a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-06-28T08:18:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJRFN.pdf: 1477527 bytes, checksum: cb09da4bfdd14f1e2c076f57d365b7a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T08:24:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissJRFN.pdf: 1477527 bytes, checksum: cb09da4bfdd14f1e2c076f57d365b7a1 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / In recent years, the application of attenuated Salmonella spp. has been investigated for development of several biotechnological products, mainly vaccines. However, the implementation of industrial processes to obtain these products depends on the development of strategies for this microorganism high-cell density cultures (HCDC). One of the HCDC’s greatest challenges is overcoming Salmonella’s metabolic limitations, as it presents a high organic acids production (mainly acetic acid) that inhibits biomass formation. In this context, this work proposes two approaches to deal with this problem and implement Salmonella’s HCDC: studying the cultivation of S. typhimurium using glycerol as carbon source to reduce the generation of organic acids; studying the cultivation of a recombinant strain of S. typhimurium expressing the enzyme acetyl-CoA synthetase (ACS) from E. coli, for improved acetate assimilation). Initially, cultures were grown in agitated flasks in minimal media for two carbon sources (glucose or glycerol) for the wild-type and the recombinant strain. After the preliminary experiments, the recombinant strain was cultivated in bioreactor operated in batch mode with minimal medium formulated with glycerol, glucose or acetic acid as carbon source, to evaluate acetate production and assimilation. The wild-type strain was cultivated in a continuous-mode bioreactor on minimal medium with glycerol at D=0.10; 0.17 and 0.22 h-1 to evaluate the S. typhimurium glycerol metabolism. During the cultivations, samples were collected and analyzed by high-performance liquid chromatography to quantify the production of organic acids and substrate consumption. To quantify the concentration of biomass, optical density (600 nm) readings of culture broth and dry cell weight measurements were performed. Agitated flasks and batch cultivations results indicated that the acetate production is reduced in medium with glycerol for both strains, and that the genetically modified cells present a lower acetate accumulation phenotype compared to the wild-type. Continuous cultures of the wild-type strain showed no acetate accumulation for a 0.1 h-1 dilution rate. At rates of 0.17 h-1 and 0.22 h-1 acetate accumulation was observed, but acetate flux was 2-fold lower than the flux reached in chemostat with glucose-formulated medium. Simulations were performed with the STM_v1.0 model using as input data the glycerol and oxygen fluxes estimated from the experimental results. Good predictions were obtained for the biomass, CO2 and acetate fluxes at the higher dilution rates. The results suggest that fed-batch culture using glycerol as carbon source along with an exponential feed to maintain a 0.1 h-1 specific growth rate as a promising strategy to obtain high cellular concentrations of wild-type S. typhimurium. The efficient acetate uptake observed for the recombinant S. typhimurium cells may allow higher values of specific growth rate to be used for this strain, resulting in a higher productivity of biomass. / Nos últimos anos, a aplicação de linhagens atenuadas de Salmonella spp. vem sendo amplamente investigada para o desenvolvimento de diversos produtos biotecnológicos, principalmente vacinas. No entanto, a implementação de processos industriais para a obtenção destes produtos depende do desenvolvimento de estratégias para o cultivo em alta densidade celular (CADC) deste microrganismo. Para isso, um dos grandes desafios a ser superado se refere às limitações metabólicas da Salmonella, uma vez que esta apresenta elevada produção de ácidos orgânicos (principalmente ácido acético) que inibem a formação de biomassa. Neste contexto, este trabalho propõe duas abordagens para lidar com este problema e implementar CADC de Salmonella: estudar o crescimento de Salmonella typhimurium em glicerol avaliando seu metabolismo como uma fonte de carbono menos propensa à geração de ácidos orgânicos; e estudar a produção destes ácidos por uma cepa de S. typhimurium geneticamente modificada para diminuir o acúmulo de acetato (super-expressão do gene acs, de Escherichia coli, que codifica a enzima acetil-CoA sintetase (ACS) responsável pela assimilação de acetato). Inicialmente foram realizados cultivos em frascos agitados em meio mínimo para duas fontes de carbono (glicose ou glicerol), para a cepa selvagem e para a cepa recombinante. Após os experimentos preliminares, foram realizados cultivos em biorreator operado em modo batelada com a cepa modificada em meio mínimo formulado com glicerol, glicose ou ácido acético, como fonte de carbono, a fim de avaliar a produção e a assimilação de acetato. Foram realizados cultivos em biorreator em modo contínuo com a cepa selvagem em meio mínimo com glicerol com D=0,10; 0,17 e 0,22 h-1 para avaliar o metabolismo do glicerol pela S. typhimurium. Ao longo dos cultivos foram coletadas amostras do caldo e analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência para quantificar a produção de ácidos orgânicos e o consumo de substrato. Para quantificar a biomassa produzida, foram realizadas medidas de densidade ótica (600 nm) e de massa seca. Os resultados dos cultivos em frascos agitados e das bateladas indicam que, para ambas as cepas, a produção de acetato é reduzida em meio formulado com glicerol, e que as células modificadas geneticamente apresentam um fenótipo de menor acúmulo de acetato comparadas à linhagem selvagem. Os cultivos contínuos realizados com a cepa selvagem mostraram que não houve acúmulo de acetato para a taxa de diluição de 0,1 h-1. Já nas taxas de 0,17 h-1 e 0,22 h-1, apesar de haver acúmulo, o fluxo de produção de acetato foi cerca de 2 vezes menor que o observado em quimiostato em meio formulado com glicose. Foram realizadas simulações com o modelo STM_v1.0, tendo como dados de entrada os fluxos de glicerol e de oxigênio estimados a partir dos dados experimentais. O modelo descreveu bem os fluxos de biomassa, CO2 e acetato para as taxas de diluição mais altas. Os resultados obtidos sugerem o cultivo em batelada alimentada com glicerol como fonte de carbono, e alimentação exponencial definida para manter a velocidade específica de crescimento em 0,1 h-1, como uma estratégia promissora para obter altas concentrações celulares de S. typhimurium selvagem. Para a S. typhimurium recombinante, devido à sua eficiente assimilação de acetato, valores ainda maiores de velocidade específica de crescimento poderiam ser impostos, com elevado aumento de produtividade em biomassa.

Os neutrófilos são glóbulos brancos do sangue e primeira linha de defesa contra as bactérias. A proliferação destas células é principalmente controlada pelo Fator Estimulador de Colônia de Granulócito (G-CSF). O G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) é um medicamento amplamente utilizado para tratar a neutropenia, condição caracterizada pela contagem de neutrófilos abaixo de 1.500/mm3. O rhG-CSF já foi obtido no Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan em E. coli como corpos de inclusão (CI), reportando-se instabilidade do plasmídeo e baixo rendimento. Neste trabalho, o plasmídeo pARKAN-I foi avaliado para produzir rhG-CSF em E. coli e viabilizar sua obtenção em biorreator. Esse vetor carrega a sequência pAR, inserida para aumentar sua estabilidade. E. coli BL21 (DE3) Star pLysS transformada com pARKAN-I/rhG-CSF foi cultivada em frascos agitados para avaliação da estabilidade do plasmídeo em meios complexos (2YT e de autoindução) e quimicamente definido (HDF). Avaliou-se a influência de indutores (IPTG e lactose), glicose e antibióticos sobre a estabilidade plasmidial. A fim de se obter material para purificação, foram realizados cultivos em biorreator com meio de autoindução sem antibióticos em modo batelada e HDF com antibióticos em modo batelada alimentada, a 30ºC, 30% de oxigênio e pH 6,8. As etapas de purificação incluíram: lise em homogeneizador contínuo de alta pressão, lavagens, solubilização e renaturação dos CI, e cromatografia de troca catiônica em SP-Sepharose. Avaliaram-se três métodos de renaturação: diafiltração, diálise e diluição. A estabilidade do plasmídeo foi avaliada pela percentagem de colônias obtidas em placas de LB-ágar com antibiótico em relação às colônias que cresceram nas placas de LB-ágar sem antibiótico. A identidade proteica foi determinada por SDS-PAGE e Western Blotting. A pureza relativa e a produção específica do rhG-CSF foram determinadas por densitometria das bandas da eletroforese. A quantificação proteica foi feita pelo método do ácido bicinconínico. Nos cultivos em frascos com meio 2YT sem glicose, o crescimento foi mais lento, porém a fase exponencial mais prolongada, alcançando concentração celular (Cx) mais elevada (2,56 g/L) do que as culturas com glicose (Cx1,35 g/L), que cresceram mais rápido e chegaram primeiro à fase estacionária. O cultivo com meio de autoindução proporcionou crescimento similar ao do meio 2YT sem glicose. Em meio HDF, os cultivos tiveram o crescimento mais lento e menor Cx (0,94 g/L). Os meios 2YT e de autoindução mostraram 100% de colônias resistentes à canamicina antes e após indução, exceto o 2YT sem antibiótico e sem glicose, com 97,5% e 94,1% após 6 e 8 h de indução, respectivamente, coincidindo com a maior produção de rhG-CSF. Em frascos, o meio HDF com antibiótico teve 93% de colônias resistentes antes da indução dos cultivos em frascos, diminuindo até 85% após 4 h de indução, com baixa produção do rhG-CSF, verificada apenas por Western Blotting. Os cultivos em biorreator mostraram baixa velocidade específica de crescimento (0,30 h-1), porém elevada Cx e produção de rhG-CSF, sendo superior no meio de autoindução, que também resultou mais barato do que o HDF. O método de diluição em tampão tris 20 mM pH 8,0 com EDTA 2 mM, Triton X-100 0,1% e glicerol 10% apresentou maior percentagem de renaturação. Foi estabelecido um processo de purificação que permitiu obter rhG-CSF com 87% de pureza, integridade estrutural e atividade biológica. O plasmídeo pARKAN-I, vetor sem restrições de propriedade intelectual e proteção de patente, mostrou alta estabilidade nos meios complexos avaliados, tanto em frasco como em biorreator, permitindo produzir rhG-CSF em larga escala sem adição de antibióticos ao meio de cultura, o que reduziu o custo do processo de obtenção. / Neutrophils are white blood cells and part of the first line of defense against bacteria. The proliferation of these cells is mainly controlled by the Granulocyte Colony Stimulating Factor (GCSF). Recombinant human G-CSF (rhG-CSF) is widely used to treat neutropenia, condition characterized by a neutrophil count below 1,500/ mm3. The rhG-CSF was already obtained at the Biotechnology Center of the Butantan Institute in E. coli as inclusion bodies (IB), but plasmid instability and low yield were reported. In this work, the plasmid pARKAN-I was evaluated to produce rhG-CSF in E. coli and enable the bioreactor production. This vector carries a Par sequence, inserted to increase its stability. E. coli BL21 (DE3) Star pLysS transformed with pARKAN-I / rhG-CSF was grown in shaken flasks to evaluate the plasmid stability in complex (2YT and autoinduction) and chemically defined (HDF) media. Also, the influence of inducers (IPTG and lactose), the addition of glucose and the presence of antibiotics on the plasmid stability were evaluated. In order to obtain material for rhG-CSF purification, a batch culture with autoinduction medium without antibiotic and fed-batch culture HDF medium with antibiotic were performance in bioreactor at 30º C, 30% oxygen and pH 6.8. The purification steps included: lysis in high pressure continuous homogenizer, wash, solubiliztion and refolding of IB and cation exchange chromatography in SP-Sepharose. Three refolding methods were evaluated: diafiltration, dialysis and dilution. Plasmid stability was evaluated by the percentage of colonies on LB-agar plates with antibiotic in relation to the colonies that grew on LB-agar plates without antibiotics. Protein identity was determined by SDS-PAGE and Western Blotting. Relative purity and specific production of rhG-CSF were determined by densitometry of SDS-PAGE bands. Protein quantification was performed by the bicinchoninic acid method. In shaken flask cultures with 2YT medium without glucose, the growth was slower, but the exponential phase was longer, reaching higher cell concentration (Cx=2.56 g/L) than the cultures in 2YT medium with glucose (Cx≈1.35 g/L), which grew faster and reached the stationary phase earlier. Cultures with autoinduction medium provided similar growth to the 2YT medium without glucose. Cultures with HDF medium displayed slower growth and lower Cx (0.94 g/L). Shaken flask cultures with 2YT and autoinduction media showed 100% of kanamycin resistant colonies before and after induction, except for 2YT without antibiotic and without glucose, which presented 97.5% and 94.1% of kanamycin resistant colonies after 6 and 8 h of induction, respectively, despite being the medium with higher production of rhG-CSF. In flasks, HDF medium with antibiotic presented 93% of kanamycin resistant colonies before induction, decreasing to 85% after 4 h of induction, the rhGCSF production was very low, and could be verified only by Western Blotting. Bioreactor cultivations showed low specific growth rate (0.30 h-1), but high cell density and recombinant protein production. The rhG-CSF production was higher in autoinduction medium, which was cheaper than HDF. The dilution method using 20 mM tris buffer pH 8.0, 2 mM EDTA, 0.1% Triton X-100 and 10% glycerol showed the highest percentage of refolding. A purification process was established and allowed to obtain rhG-CSF with 87% purity, structural integrity and biological activity. The expression vector pARKAN-I, which is free of intellectual property and patent protection, showed high plasmid stability in the complex media evaluated in flask and bioreactor and allowed to produce rhG-CSF in large scale without addition of antibiotics to the culture medium, reducing the cost of the production process.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-30 / Valée S.A. / Swine erysipelas is one of the diseases responsible for the great economic losses in swine-producing areas of the world. The bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae is the causative agent of erysipelas, and the vaccines currently available for prevention of this disease are produced with the whole broth culture containing the inactivated microorganism or its live-attenuated form. A surface protein was identified as the main antigen. It can be found in the culture supernatant or attached to the cell wall through interactions with the choline residues from the teichoic and lipoteichoic acids of this structure. Considering the lack of information in the scientific literature about studies concerning the growth pattern of this pathogen, the company Vallèe S.A, a Brazilian industry of veterinary pharmaceutical products, established a partnership with researchers form the Chemical Engineering Department of UFSCar with the purpose of developing the technology required for the production of the cited vaccine. In this context, the objective of this work was to optimize the growing conditions of E. rhusiopathiae to establish a protocol for production of high cellular concentrations, enough to prepare a vaccine against swine erysipelas offering the same or a higher protection level compared to the commercially available formulations. To achieve this goal, the growth kinetics of this microorganism was investigated under different aeration conditions (aerobiosis, anaerobiosis and microaerophilic condition), changes in the medium nutrient s concentration were analyzed, and mice protection tests using the prepared vaccines were performed. The studies about the aeration influence on the microorganism growth and the antigen expression were made using a 4.0 L stirred-tank bioreactor, with an agitation frequency kept between 100 and 400 rpm and air or N2 flow rate of 1.0 L/min. The studies for the improvement of the medium formulation were carried out in flasks incubated at static condition or under agitation of 200 rpm. The vaccines were prepared using medium harvested in both conditions. The temperature was set at 37°C and the initial pH at 8,0 in all experiments. Samples of culture supernatant and from cell extracts made with choline chloride were analyzed by electrophoresis under denaturating conditions (SDS-PAGE) to evaluate the antigen expression. The preliminary electrophoresis results indicated that the antigen production is associated to the cell growth and its expression is favored in the presence of oxygen. Cellular concentrations around 1,8 g/L were reached, in all different aeration conditions employed, using the stirred-tank bioreactor operating with pH automatic control and using the culture medium with nutrients concentrations increased in 50 % from the Feist medium described in literature. The vaccines prepared in aerobic and microaerophilic condition led to higher protection levels in the challenge-exposure tests, and a formulation made from an aerobic culture in bioreactor having a cellular concentration over 2,0 x 109 CFU/mL showed the same immunizing power as the three commercial vaccines used for comparison purposes. Observations about the inhibitory effects of metabolites accumulation and substrate saturation on the microorganism growth pointed the fed-batch as a promising operation mode to produce larger amounts of biomass. Cellular concentrations reached in the experiment ran under these condition were increased around five times. / A erisipela suína está entre as enfermidades que causam os maiores prejuízos na suinocultura mundial. O agente patogênico associado a esta doença é a bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae, e as vacinas disponíveis atualmente para a prevenção da erisipela são produzidas com o caldo de cultivo deste microrganismo inativado ou atenuado. O principal antígeno identificado é uma proteína de superfície da bactéria encontrada no sobrenadante do caldo de cultivo ou aderida à parede celular através de interações com resíduos de colina dos ácidos teicóico e lipoteicóico desta estrutura. Diante da escassez de informações na literatura científica sobre estudos a respeito do crescimento deste patógeno, a empresa Vallèe S.A, indústria brasileira de produtos farmacêuticos de uso veterinário, firmou uma parceria com pesquisadores do Departamento de Engenharia Química da UFSCar para o desenvolvimento da tecnologia de produção dessa vacina. Assim, o presente trabalho teve como objetivo otimizar as condições de cultivo de E. rhusiopathiae de forma a estabelecer um protocolo de produção de altas concentrações celulares deste microrganismo, suficientes para produzir uma vacina contra a erisipela suína que oferecesse grau de proteção igual ou superior às formulações disponíveis no mercado. Para tanto, o crescimento do microrganismo foi estudado em diferentes condições de aeração (aerobiose, microaerofilia e anaerobiose), foram avaliadas alterações nas concentrações dos nutrientes do meio de cultivo e foram realizados testes de imunização em camundongos com as vacinas preparadas. Os estudos sobre o efeito da aeração no crescimento do microrganismo e na expressão do antígeno foram realizados em biorreator de 4,0 L, com uma faixa de agitação entre 100 e 400 rpm e vazão de ar ou N2 de 1,0 L/min. Os experimentos de aprimoramento do meio de cultivo foram conduzidos em câmara incubadora estática ou com agitação de 200 rpm. Já as vacinas foram preparadas em ambas as condições. A temperatura utilizada foi de 37°C e o pH inicial foi de 8,0 em todos os ensaios realizados. A expressão do antígeno foi avaliada por eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) utilizando amostras do sobrenadante dos cultivos ou a partir de extratos das células preparados com solução de cloreto de colina. Os resultados destas análises revelaram que a produção do antígeno acompanha o crescimento celular e sua expressão é favorecida na presença de oxigênio. Concentrações celulares de até 1,8 g/L foram atingidas, nas três diferentes condições de aeração empregadas, nos cultivos realizados em biorreator com controle automático de pH e utilizando o meio de cultivo com as concentrações de nutrientes aumentadas em 50% em relação ao meio Feist modificado descrito na literatura. As vacinas preparadas com os cultivos aeróbio e microaerófilo proporcionaram um maior grau de proteção nos testes de imunização realizados, e a formulação preparada a partir de um cultivo aeróbio realizado em biorreator com concentração celular superior a 2,0 x 109 UFC/mL conferiu o mesmo nível de proteção que três vacinas comerciais utilizadas para fins de comparação. Observações sobre os efeitos de inibição do crescimento provocadas por acúmulo de metabólitos ou excesso de substrato, indicaram o modo de operação do biorreator em batelada alimentada como promissor para obtenção de maior concentração celular. Em um experimento realizado nesta condição a biomassa foi aproximadamente quintuplicada em relação aos ensaios em batelada simples.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3950.pdf: 2965296 bytes, checksum: 1e00d517bd464f272b8c1a2c9f67ca9c (MD5) Previous issue date: 2011-10-11 / Valée S.A. / Swine erysipelas is among the diseases that causes great economic losses in swine cultures worldwide. The disease is caused by the bacterium Erysipelothrix rhusiopathiae, and the surface protein SpaA is one of its main antigens. Herein, we report studies concerning the development of recombinant vaccines against swine erysipelas based on the SpaA antigen. Protein production for a subunit vaccine formulation was studied in shaken flasks and 5.0 L bioreactors. For this propose, a 1026 bp fragment of the spaA gene was cloned in Escherichia coli cells under the lac promoter control. The recombinant organism (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) was cultivated in fed batch using complex medium with glycerol as carbon source. Nonconventional induction strategies were evaluated and high protein yield (198 mgprot/gDCW) and productivity values (0.4 gprot/L.h) were reached. The same antigen was cloned for expression and secretion in attenuated Salmonella typhimurium cells to obtain a live bacterial vector for the SpaA antigen. The recombinant lineage was able to express and secrete the SpaA fragment fused to the alpha-hemolysin secretion signal both in vitro and in vivo. High plasmid maintenance was observed in both conditions. The vaccinal vehicle showed to be able to colonize the Peyer patches and to invade the gut epithelial barrier in the inoculated animals. Immunization tests in murine model showed that the recombinant antigen delivered by Salmonella cells inoculated by oral route induced the production of seric IgG antibodies anti-SpaA. According to the literature, these antibodies must be able to promote pathogen opsonization in case of infection, contributing to confer a protective immunity against swine erysipelas to the vaccinated animals. In summary, this work presents contributions to development of subunit vaccines against swine erysipelas, in the form of recombinant protein formulations, or SpaA antigen delivery by attenuated S. typhimurium cells. / A erisipela suína é uma das enfermidades que causam grandes prejuízos na suinocultura em todo o mundo. A doença é causada pela bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae, e a proteína de superfície SpaA desse microrganismo é um de seus principais antígenos. Neste trabalho, estudou-se o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a erisipela suína a partir do antígeno SpaA. Avaliou-se a produção de uma vacina de subunidade composta pelo antígeno recombinante, a qual foi estudada em frascos agitados e em biorretores de bancada de 5,0 L. Para isso, um fragmento de 1026 pb do gene spaA foi clonado em células de Escherichia coli sob controle do promotor lac e o organismo recombinante (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) foi cultivado em batelada alimentada, utilizando-se meio complexo contendo glicerol como fonte de carbono. Estratégias não convencionais de indução foram avaliadas e altos valores de rendimento (198 mgprot/gDCW) e produtividade (0,4 gprot/L.h) da proteína recombinante foram alcançados. O mesmo antígeno foi clonado em um plasmídeo que possibilita a expressão e secreção da proteína recombinante em Salmonella typhimurium atenuada, a fim de se obter um vetor bacteriano vivo para o antígeno em questão. A linhagem recombinante foi capaz de expressar e secretar o fragmento da proteína SpaA fusionado ao sinal de secreção da alfa-hemolisina tanto in vitro quanto in vivo, apresentando alta taxa de manutenção plasmidial nas duas condições. Além disso, o veículo vacinal se mostrou capaz de colonizar as placas de Peyer e de invadir a barreira epitelial do intestino dos animais inoculados. Ensaios de imunização em modelo murino mostraram que a veiculação do antígeno pelas células de Salmonella inoculadas por via oral induziu a produção de anticorpos IgG séricos anti-SpaA, que de acordo com a literatura, devem ser capazes de promover a opsonização do patógeno em caso de infecção, contribuindo para conferir uma imunidade protetora contra a erisipela suína aos animais vacinados. Em suma, este trabalho apresenta contribuições para o desenvolvimento de vacinas de subunidade contra a erisipela suína na forma de uma vacina de proteína recombinante, ou por veiculação do antígeno SpaA por linhagens atenuadas de S. typhimurium.