Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniería en Biotecnología Molecular / Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete que sintetiza astaxantina, un carotenoide de interés biotecnológico. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. La regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles se encuentran relacionadas. A su vez, ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. En el núcleo, los niveles de Sre1N son regulados por la proteína Ofd1 de manera oxígeno-dependiente, ya que esta proteína inhibe la unión de Sre1N al DNA y promueve su degradación proteosómica en presencia de oxígeno. El objetivo de este trabajo fue caracterizar y estudiar el posible gen de Ofd1 de X. dendrorhous mediante la construcción de cepas que carecen de dicho gen y ensayos de complementación en S. pombe. Mediante análisis bioinformático se identificó el posible gen OFD1 de X. dendrorhous, se dedujo la proteína y se realizó un modelo tridimensional por homología. Se comprobó la conservación del motivo HXD/E…H en el sitio activo, característico de las 2-oxoglutarato oxigenasas. Se realizó la deleción del gen OFD1 en tres cepas de X. dendrorhous: CBS-6938 (silvestre), CBS-cyp61- (mutante que no produce ergosterol y sobre produce carotenoides) y CBS-SRE1N (mutante que expresa solo la forma activa del factor de transcripción Sre1). Se evaluó el fenotipo de las mutantes Δofd1 respecto a sus parentales mediante análisis de carotenoides y esteroles totales por espectrofotometría, en tanto la composición de ambos tipos de xii metabolitos se determinó por RP-HPLC. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGR, el cual posiblemente es regulado por Sre1 en X. dendrorhous. Además, se estudió el fenotipo de crecimiento de la levadura en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol, en la presencia de cloruro de cobalto (compuesto que imita las condiciones de hipoxia) y en anaerobiosis. Los resultados indican que el producto génico de OFD1 no regularía los niveles de Sre1N en el núcleo debido a que no hubo cambio de fenotipo en ningún caso, por lo que OFD1 no participaría en la vía SREBP de X. dendrorhous. Adicionalmente, los ensayos de complementación heteróloga del gen OFD1 de X. dendrorhous en una cepa mutante para este gen en S. pombe, también indican que Ofd1 de X. dendrorhous no regularía los niveles de Sre1N, ya que no se observaron cambios en los niveles de Sre1N de S. pombe mediante Western blot. En conclusión, el gen OFD1 de X. dendrorhous no participa en la regulación del factor transcripcional Sre1N como se había planteado. Posiblemente exista otro mecanismo de regulación aún no descrito. / Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes astaxanthin, a carotenoid of biotechnological interest. The astaxanthin synthesis is produced through mevalonate pathway metabolites, which are also necessary for sterol synthesis. The regulation of the carotenoid and sterol biosynthesis is related. At the same time, both pathways have been shown to be regulated by the SREBP pathway, which in mammal cells controls cholesterol levels. In fungi as well as in the yeast Schizosaccharomyces pombe the SREBP pathway is conserved. Particularly in the yeast, the transcription factor Sre1N regulates the sterol synthesis and the hypoxia response. In the nucleus, the levels of Sre1N are controlled by the Ofd1 protein in an oxygen-dependent way, due to the fact that this protein acts inhibiting the binding of Sre1N to DNA and promoting its proteosomal degradation under oxygen availability. The aim of this work was to characterize and study the possible Ofd1 gene in X. dendrorhous through strain construction lacking this gene and complementation assays in S. pombe. Bioinformatic analysis shown the possible X. dendrorhous OFD1 gene, the protein was deduced and a three-dimensional homology model was performed. The 2-oxoglutarate oxygenases characteristic motif HXD/E ... H was identified at the active site. Deletion of the OFD1 gene was done in three X. dendrorhous strains: CBS-6938 (wild-type), CBS-cyp61- (mutant that does not produce ergosterol and over produces carotenoids) and CBS-SRE1N (mutant expressing only the active form of transcription factor Sre1). Carotenoid and total sterol content was measured spectrophotometrically, while carotenoid and total sterol composition was determined by RP-HPLC. Expression analysis of HMGR gene, which is possibly regulated by Sre1 in X. dendrorhous, was also performed by RT-qPCR. In addition, the phenotype of the yeast growing in the xiv presence of the azole clotrimazole and ketoconazole, was studied in the presence of cobalt chloride (simulating hypoxic conditions) and in anaerobiosis. The results indicate that the OFD1 gene product would not regulate the levels of Sre1N in the nucleus because there was no change in yeast phenotype, so that OFD1 would not participate in the X. dendrorhous SREBP pathway. In addition, heterologous complementation assays of X. dendrorhous OFD1 gene in a mutant strain for this gene in S. pombe also indicate that X. dendrorhous Ofd1 would not regulate Sre1N levels, due to the fact that no changes were observed in the levels of S. pombe Sre1N by Western blot. In conclusion, the OFD1 gene of X. dendrorhous does not participate in the regulation of Sre1N transcription factor as was previously proposed. There may be another regulation mechanism not described yet. / Proyecto FONDECYT 1160202

Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs) son nutrientes esenciales altamente demandados por las industrias acuícola, nutracéutica y alimentaria. Actualmente, el principal recurso que abastece de LC-PUFAs a la industria es el aceite de pescado. Sin embargo, las diversas problemáticas asociadas a su producción hacen necesaria la búsqueda de recursos alternativos. Ciertas microalgas marinas producen naturalmente estos compuestos por lo que surgen como una fuente alternativa prometedora de LC-PUFAs. Además, su síntesis puede modificarse manipulando las condiciones de crecimiento y, frente a condiciones de baja temperatura, ciertas especies responden sintetizando aún más LC-PUFAs. Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo de esta Tesis fue aislar microalgas nativas del estuario de Bahía Blanca y desarrollar estrategias de cultivo que involucren el estrés por baja temperatura. Se plantearon como objetivos específicos aislar potenciales especies productoras de PUFAs e identificarlas morfológica y molecularmente; caracterizar su crecimiento a escala de laboratorio; cultivarlas en fotobiorreactor bajo condiciones óptimas y estresantes en términos de temperatura determinando su efecto sobre parámetros de crecimiento, producción de biomasa y cantidad, calidad y producción lipídica, con especial énfasis en LC-PUFAs, y de otros compuestos de alto valor como esteroles, pigmentos y/o proteínas. De las tres especies de diatomeas aisladas, se seleccionó a Cylindrotheca closterium por presentar los mejores resultados en cuanto crecimiento y producción de biomasa. Se corroboró la identidad de la cepa mediante análisis del gen cloroplástico rcbl. Se realizaron cultivos en fotobiorreactor de C. closterium a 20°C (control), y disminuyendo abruptamente la temperatura a 10oC durante la fase exponencial de crecimiento (EBTEx) y la fase estacionaria de crecimiento (EBTEs). La condición EBTEs, fue la estrategia de cultivo más adecuada para incrementar la producción de biomasa, lípidos y LC-PUFAs esenciales, particularmente en términos de ácidos eicosapentaenoico (EPA) y araquidónico (ARA). A su vez, la presencia de esteroles y aminoácidos esenciales para organismos acuáticos revelaron el valor de la biomasa para su posible uso en acuicultura. Por otra parte, otra especie aislada fue identificada como Pavlova gyrans (Haptophyta) a partir de sus características morfológicas y estudios moleculares en base al gen nuclear 18s rARN. P. gyrans mostró ser robusta para el crecimiento bajo las condiciones empleadas en el laboratorio. Se ensayaron cultivos en fotobiorreactor a una temperatura óptima (20oC) y bajo EBTEs. Ésta última condición demostró ser efectiva para incrementar la producción de biomasa y LC-PUFAs, particularmente los ácidos grasos EPA y docosapentaenoico (DPA). Además, la presencia de fitoesteroles y pigmentos otorgaron aún más valor a la biomasa. Finalmente, se analizó la calidad de los lípidos teniendo en cuenta indicadores de calidad nutricional de los mismos. P. gyrans mostró valores similares a los reportados para diferentes aceites de pescado por lo que puede considerarse una especie para uso alimentario. En conjunto, estos resultados evidencian el potencial de las cepas nativas C. closterium y P. gyrans como una posible fuente alternativa de LC-PUFAs. / Long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) are essential nutrients highly demanded by aquaculture, nutraceutical and food industries. Currently, the main source that supplies LC-PUFAs to the industry is fish oil. However, various problems associated with its production make it necessary to search for alternative resources. Certain marine microalgae naturally produce these compounds, emerging as promising alternative sources of LC-PUFA. Furthermore, its synthesis can be modify by manipulating their growth conditions and faced with low temperature conditions, certain species respond by synthesizing even more LC-PUFA. Based on this background, the objective of this Thesis was to isolate native microalgae from the Bahía Blanca Estuary and develop culture strategies involving low temperature stress. The specific objectives were to isolate possible PUFA- producing species and identify them morphologically and molecularly; characterize their growth on a laboratory scale; cultivate them in a photobioreactor under optimal and stressful conditions in terms of temperature, determining their effect on growth parameters, biomass production and quantity, quality and lipid production, with special emphasis on LC-PUFA, and other high-value compounds such as sterols, pigments and/or proteins. Of the three isolated diatom species, a Cylindrotheca closterium was selected as it showed the best results in terms of growth and biomass production. The identity of the strain was confirmed by analysis of the rcbl chloroplast gene. C. closterium cultures were performed in a photobioreactor at 20°C (control), and the temperature was abruptly decreased to 10oC during the exponential growth phase (EBTEx) and the stationary growth phase (EBTEs). The EBTEs condition was the most suitable culture strategy to increase the production of biomass, lipids and LC-PUFAs, particularly in terms of eicosapentaenoic (EPA) and arachidonic (ARA) acids. In turn, the presence of sterols and essential amino acids for aquatic organisms revealed the value of the biomass for its possible use in aquaculture. On the other hand, another isolated species was identified as Pavlova gyrans (Haptophyta) based on its morphological characteristics and molecular studies based on the nuclear 18s rRNA gene. P. gyrans was shown to be robust for growth under laboratory conditions. Cultures were also performed in a photobioreactor at optimal temperature (20oC) and under EBTEs. This last condition proved to be effective in increasing the production of biomass and LC-PUFAs, particularly EPA and docosapentaenoic (DPA) fatty acids. In addition, the presence of phytosterols and pigments added even more value to the biomass. Finally, lipids were analyzed taking into account indicators of nutritional quality. P. gyrans showed similar values to those reported for different fish oils, so it can be considered a species for food use. Taken together, these results show the potential of two native strains, C. closterium and P. gyrans, as alternative sources of LC-PUFAs.

El objetivo global de esta tesis consiste en mejorar el control de las fermentaciones a bajas temperaturas a partir de los cambios en el metabolismo lipídico. En el primer capítulo, observamos que el almacenamiento en condiciones inadecuadas de una levadura seca activa tenía como consecuencias una menor vitalidad y contenido lipídico. Estos efectos desaparecían tras una recuperación en medio de cultivo óptimo. En el segundo capítulo, la cepa híbrida S. cerevisiae/S. bayanus presentó la mejor cinética fermentativa sin necesidad de aclimatación. Sin embargo, el resto de especies analizadas mostraron una modificación en la composición lipídica y una mejora de su actividad fermentativa a 13 ºC al hacer coincidir la temperatura de fermentación con la de precultivo. En el tercer trabajo, nos centramos en la nutrición lipídica de la levadura consiguiendo una reducción del tiempo de fermentación a bajas temperaturas mediante la adición de ácido palmitoleico en el medio de precultivo. Finalmente, en el último capítulo se analizó el efecto de la supresión de genes del metabolismo de los fosfolípidos sobre la vitalidad a bajas temperaturas y la composición en fosfolípidos. / The global aim of this thesis consists in improving the control of low temperature fermentations by considering the changes in lipid metabolism. In the first chapter, we reported that poor ADWY storage conditions resulted in an impairment of the vitality and a decrease in the lipid content. These effects disappeared after a recovery in optimal medium. In the second chapter, we analysed the strain and specific-response to fermentation temperature, showing that the hybrid S. cerevisiae/S. bayanus presented the highest sugar consumption whatever the preculture temperature used. The rest of the species needed a preadaptation at low temperature involving a change in their lipid composition to improve their fermentation rate at 13 ºC. In the third chapter, we focused on the lipid nutrition of yeast and we saw that palmitoleic acid supplementation reduced significantly the fermentation length at low temperature. In the last chapter various phospholipid mutants were tested to ascertain whether the suppression of some genes could modify the vitality at low temperature and the phospholipid composition.