La degradació de proteïnes mitjançant el sistema de les ubiquitines i el proteasoma (UPS) és un procés altament regulat, en el qual diverses famílies enzimàtiques s'encarreguen de la correcte conjugació i deconjugació de molècules d'ubiquitina a un determinat substrat. Una d'aquestes famílies és la dels enzims deubiquitinitzants (DUBs), de la qual se n'han descrit, en humans, més de 90 membres. USP25 (21q11.2) codifica per un enzim deubiquitinitzant i produeix tres isoformes per splicing alternatiu. Una d'elles, generada per la inclusió de l'exó 19a entre el 18 i el 19b, presenta una expressió restringida a múscul esquelètic i cor (USP25m). Mitjançant un assaig de dos híbrids en llevat varem determinar que USP25m interacciona amb una proteïna d'unió a la miosina (MyBPC1), amb l'actina 1 (ACTA1) i amb la filamina C (FLNC). Totes aquestes proteïnes són sarcomèriques, regulen la diferenciació i el manteniment de les cèl.lules musculars i han estat implicades en diverses patologies humanes.Assajos bioquímics realitzats per aprofundir en la rellevància funcional d'aquestes interaccions ens mostren que els nivells de MyBPC1 estan regulats pel proteasoma, i que USP25m és capaç d'abolir seva degradació. En canvi, ACTA1 i FLNC són proteïnes estables, suggerint que la seva interacció amb USP25m està relacionada amb mecanismes reguladors de l'estructura i la funció del sarcòmer, i no amb la seva degradació. USP25 conté tres dominis d'unió a ubiqüitina implicats en el reconeixement de substrats i pot ser modificada per diversos tipus de modificació posttraduccional com la ubiqüitinació, la sumoïlació, la fosforilació i l'acetilació. El fet que sigui una proteïna multimodificada suggereix que la seva activitat enzimàtica ha d'estar finament regulada.Per últim, la sobreexpressió d'USP25 és capaç d'induïr una aturada en el cicle cel·lular, per mecanismes encara desconeguts. / USP25 is a deubiquitinating enzyme (DUB) that generates a muscle-specific isoform, USP25m, by alternative splicing. USP25m interacts with several sarcomeric proteins, but similarly to most DUBs, the contribution of different protein domains to enzymatic activity and substrate recognition remains to be ascertained. In silico analysis revealed the position of the catalytic signatures and predicted three ubiquitin binding domains (UBDs): one ubiquitin-associated domain (UBA) and 2 ubiquitin-interacting motifs (UIMs). By generating serial and combinatorial deletions of these domains, we analyzed their contribution to USP25m catalytic activity, substrate recognition, subcellular localization, and post-translational modifications, such as ubiquitination and sumoylation. Our results indicate that ablation of these motifs do not abrogate USP25 deubiquitinating activity, neither promoted any significant alteration in subcellular localization of the enzyme nor ubiquitin. However, USP25 UBDs contribute to specific substrate recognition, as interaction with each substrate requires a different combination or number of UBDs, in an additive or synergistic manner. USP25m is sumoylated in vitro and ubiquitinated, although the UBDs are not required for these post-translational modifications. In addition, USP25m is phosphorylated in Tyr, Ser/Thr residues and acetylated. The physiological relevance of all these modifications remains to be ascertained. USP25 overexpression causes cell cycle arrest, most probably at the G1/S transition.

S'ha caracterizat l'estructura de la regió genòmica del gen "Adh" a quatre espècies del gènere "Drosophila", pertanyents al subgrup "obscura": "D. ambigua", "D. subobscura", "D. madeirensis" i "D. guanche" amb els objectius d'analitzar l'organització i l'evolució d'aquesta regió genòmica dins d'aquest gènere i clarificar les relacions filogenètiques d'aquestes espècies. Per assolir aquestes fites, es van construir llibreries genòmiques de cada espècie que es van crivellar amb una sonda que contenia el gen "Adh" de "D. melanogaster", per tal d'aïllar seqüències homòlogues a aquest gen. Els clons positius es van caracteritzar primer per restricció i desprès per seqüenciació. També es va analitzar la seva localització citogenètica mitjançant hibridacions "in situ" sobre cromosomes politènics.En aquestes quatre espècies, el gen "Adh" és un gen de còpia única, d'expressió regulada per dos promotors diferents, amb una estructura comparable a la que presenta "D. melanogaster": tres exons de mida diferent separats per dos petits introns. A més, la seva seqüència es troba molt conservada en totes elles. Per altra part, immediatament adjacent a 3' del gen "Adh", es troba un altre gen, l' "Adh-dup", d'estructura també molt conservada inter-específicament, però que presenta la particularitat de una diferent localització del codó de terminació en diferents espècies, i per tant, la longitud de la proteïna codificada varia. Donada l'elevada similitud tant d'estructura com de seqüència entre els gens "Adh" i "Adh-dup", es confirma que ambdós gens haurien divergit a partir de la duplicació d'un gen ancestral.De les comparacions inter-específiques de seqüències es dedueix que no totes les regions evolucionen al mateix ritme, ja que es detecten diferències significatives en les taxes de divergència no només entre regions codificants i regions no codificants, sino també dins de cada tipus de regions. A les regions codificants, les substitucions silencioses són més frequents que les de reemplaçament, corn és d'esperar degut al constrenyiment funcional. Però, la distribució de les substitucions de reemplaçament no és a l'atzar al llarg de la regió codificant: quan es compara qualsevol espècie del subgrup "obscura" amb una del subgrupo "melanogaster", les substitucions de reemplaçament del gen "Adh" s'acumulen significativament en el tercer exó, mentre que, de forma inversa, quan es comparen espècies dins del subgrup "obscura", són les substitucions de reemplaçament del gen "Adh-dup" les que no es distribueixen a l'atzar. Aquests trets només es dóna quan en la comparació d'espècies s'empra el subgrup "obscura" i no quan es consideren espècies d'altres radiacions més llunyanes i, per tant, constituiria un tret de l'evolució d'aquest grup. Resumint, doncs, les posicions de reemplaçament del gen "Adh", serien la regió que s'hauria vist més afectada pels processos que es van produir en la radiació del grup "obscura" de la radiación "melanogaster". Inversament, la regió que reflecteix millor els canvis produïts dins de la pròpia radiació "obscura", són les posicions de reemplaçament del gen "Adh-dup". Podria tractar-se d'uns bons marcadors moleculars, informatius de les corresponents radiacions.S'han aïllat i caracteritzat seqüències addicionals al gen funcional, però que presenten homologia amb el gen "Adh", en el genoma de "D. subobscura", "D .madeirensis" i "D. guanche". Fet que concorda amb d'altres resultats, com ara la detecció de vàries localitzacions cromosòmiques i vàries bandes sobre "Southerns" de DNA genòmic total, amb homologia al gen "Adh". Les característiques que presenten aquestes seqüències addicionals són definitòries de retroseqüències, també anomenades gens processats, ja que no posseeixen introns, que han estat perfectament escindits, ni tampoc regions promotores reconeixibles, i en canvi, presenten "leader" i "trailer". De les seves característiques es dedueix que es tractaria de trànscrits del gen "Adh" que s'haurien retrotranscrit i integrat en el genoma, i posteriorment, han sofert un procés de multiplicació que ha afectat també a les regions genòmiques adjacents. També s'han detectat retrosequències en els genomes de "D. madeirensis" i "D. guanche". Immediatament adjacent a totes les retroseqüències aillades, s'ha trobat un DNA moderadament repetit en el genoma de "D. subobscura" que conté una repetició invertida de 196 pb i una regió intermèdia amb palíndroms i repeticions directes.Amb les dades moleculars obtingudes, s'ha intentat clarificar les relacions filogenètiques entre aquestes espècies. "D. guanche"," D. madeirensis" i "D. subobscura" formen una tríade estretament relacionada, éssent les dues últimes les més properes entre sí, amb una gran similitud de seqüència no només a les regions codificants, sino també en les no codificants. "D .guanche" sembla ésser l'espècie que està divergint més ràpidament dins d'aquest tríade i aquest fet concordaria amb la seva distribució geogràfica restringida, amb un nombre efectiu d'individus petit i que sofreix frequents colls d'ampolla. "D. ambigua" té una posició poc clara dins del subgrup "obscura", la seva filogènia varia segons les dades emprades, però semblaria situar-se més aprop de les espècies europees que de les americanes. A més, relativament, sembla divergir molt ràpidament dins d'aquest subgrup i això explicaria la dificultat de determinar la seva posció filogenètica, ja que estaria distorsionant la seva filogènia. / The structure of the genomic region of the "Adh" (alcohol dehydrogenase) gene has been analyzed and characterized in four species of the genus "Drosophila" belonging to the "obscura" subgroup: "D. ambigua","D. subobscura", "D. madeirensis and "D.guanche". Two different genes are located in this region, the "Adh" and the "Adh-dup" and both genes have diverged from a common ancestor. The inter-specific comparisons of the sequences of the two genes, which are very well conserved, have allowed detect differences in the divergence rates not only between, but rather within coding and non-coding regions. Furthermore, the distribution of the replacement substitutions along the coding sequence is significantly deviated from random. Additional sequences, homologous to the "Adh" gene, have been isolated and analyzed in the "D. subobscura" genome. Their features are definitory traits of retrosequences (processed genes). They have also been detected in the "D. madeirensis" and "D. guanche" genomes. This report, together with a very recent one from other authors, is the first to acknowledge the presence of these genetic elements in the genome of invertebrates. On the other hand, a middle repetitive DNA, which is located immediately adjacent of these retrosequences and contains an inverted repeat, has been characterized in the "D. subobscura" genome. Phylogenetically, "D. guanche", "D. madeirensis" and "D. subobscura" constitute a tightly related triad, being the latest two, the closest. "D. ambigua", instead, would have a less dear position in the subgroup "obscura". Eventually, it seems to locate nearer the European rather than the American species, although its rapid relative degree of divergence would distort its phylogeny."

Els elements insulator són seqüències al genoma que aïllen i separen regions reguladores. Clàssicament han estat definits per presentar dues propietats característiques: d’una banda són capaços d’aïllar un transgèn dels efectes posicionals de l’entorn cromosòmic —com mantenir-lo aïllat dels efectes silenciadors si el transgèn està situat en una regió heterocromàtica—, i per altra són capaços d’impedir l’activació d’un promotor per part d’un enhancer si l’insulator es troba entremig de tots dos (enhancer-blocking). A la regió reguladora del gen homeòtic Abdominal-B s’hi troben alguns dels insulators més ben estudiats de Drosophila melanogaster (Mcp, Fab-7 o Fab-8) que separen dominis reguladors (cadascun dirigint l’expressió d’Abdominal-B en un segment diferent). Al laboratori s’havien identificat prèviament zones d’hipersensibilitat a DNAsaI entre els dominis iab-5 i iab-6. Nosaltres hem les hem caracteritzat i n’hem identificat una (Fab-6) com a insulator, i que a més també té propietats de PRE (Polycomb response element). El Fab-6, situat en un transgèn entre un enhancer i un gen mini-white, atenua l’efecte activador de l’enhancer sobre el promotor. La manca de CP190 (proteïna necessària pels insulators) fa disminuir aquesta atenuació, demostrant que l’efecte és degut a una seqüència insulator. També hem demostrat que el Fab-6 es transcriu malgrat no ser codificant, i ho fa en el mateix sentit que el gen al qual regula, Abdominal-B. En canvi aquesta transcripció no té lloc en cèl•lules on Abdominal-B està silenciat. Hem vist que l’efecte enhancer-blocking d’alguns insulators també disminueix en mosques mutants de JIL-1. JIL-1 és una quinasa que fosforila la serina 10 de la histona H3 a interfase i que està relacionada amb activació de la transcripció i amb cromatina localment descondensada. Així, la participació de JIL-1 en l’activitat insulator pot venir donada per la necessitat d’aquests de transcriure’s. Per tal d’identificar més proteïnes que puguin estar involucrades en l’activitat insulator vam realitzar una purificació del complex format per CP190. CP190 és una proteïna que es troba a la major part d’insulators identificats fins el moment, i que és comú a tot els tipus d’insulator de Drosophila. Un cop purificat el complex en vam analitzar els components per espectrometria de masses. Entre les proteïnes identificades amb més robustesa hi havia les proteïnes ja conegudes d’insulator (CTCF, Su(Hw), Mod(mdg4)). Hi havia també altres proteïnes ja conegudes però fins ara no relacionades amb CP190 com Nurf-38 (component del complex remodelador de la cromatina NURF) i Z4 (relacionada amb manteniment de l’estructura de la cromatina, amb regions eucromàtiques i amb JIL-1). I també vam identificar dues proteïnes no descrites fins al moment que hem anomenat Ibf-1 i Ibf-2 per Insulator Binding Factor 1 i 2. Vam veure que es tractava de proteïnes amb localització nuclear i que s’unien a la cromatina a cromosomes politènics formant un patró de bandes que es solapa majoritàriament amb bandes de CP190. N’hem realitzat ChIP-seq (immunoprecipitació de cromatina seguida de seqüenciació) i hem observat que no només colocalitzen a la cromatina amb CP190 sinó també —tot i que amb menor mesura— amb les demés proteïnes d’insulator conegudes a Drosophila: Su(Hw), CTCF i BEAF. Els llocs d’unió mostren força diversitat: des de regions intergèniques a promotors de gens i també a introns i exons. Hi ha un particular enriquiment a gens que contenen promotors alternatius i a promotors que tenen un altre promotor proper. A nivell funcional hem vist per microarray que la seva manca causa desregulació de l’expressió de varis gens no relacionats funcionalment entre si. També hem vist en assaigs transgènics que la manca d’Ibf-1 i Ibf-2 disminueix l’efecte enhancer-blocking d’alguns insulators. Per tot plegat concloem que hem identificat dues noves proteïnes d’activitat insulator a Drosophila. / "Identification and characterization of new factors associated to insulator elements in Drosophila melanogaster" Insulator elements are genomic sequences that serve as boundaries for proper gene regulation. These sequences are bound by specific chromatin-binding proteins that help insulate and separate different regulatory regions. They are classically defined by having two properties: on one hand they can act as barriers to heterochromatin that can therefore insulate a transgene from positional effects due to genomic environment; and on the other hand they can block the interaction between an enhancer and a promoter when they are positioned in between. In this case, the activating effect of the enhancer will be attenuated in the presence of the insulator. We have investigated the insulators present in the Abdominal-B homeotic gene regulatory region of Drosophila melanogaster. This large region is divided into several domains each one controlling Abdominal-B expression in a different body segment. Previous work in the lab had uncovered two DNaseI hypersensitive sites between domains iab-5 and iab-6. We have characterized them and identified one as the insulator Fab-6, that separates the two domains. This insulator is dependent on CP190 and is transcribed in those cells where Abdominal-B is transcribed. In order to identify new proteins involved in insulator activity we purified the complex formed by CP190, which is an already well characterized insulator protein found in every type of insulator known in Drosophila. Using Mass Spectrometry we identified the components of the complex. We found other known insulator proteins like CTCF, Su(Hw) or Mod(mdg4). We also identified Nurf-38 (a component of NURF complex) and Z4 (an euchromatin binding protein). And we identified two previously uncharacterized proteins that we named Ibf-1 and Ibf-2 after Insulator Binding Factor 1 and 2. We have studied these two proteins and showed that not only they colocalize in chromatin with CP190 (and partially with the other insulator proteins) but also they have enhancer-blocking activity and their lack causes a misregulation in gene expression of several genes. Overall our results show that we have identified two new Drosophila insulator proteins that form complex with CP190.

Ammonia oxidation, the first and the rate-limiting step in nitrification, is one of the cornerstones of the cycle. Members from the bacterial and archaeal domains are key players in ammonia oxidation in many different environ- ments. Usually these organisms are found coexisting but the most recent studies suggests that archaeal ammonia oxidizers show an incredible ability to adapt and oxidize ammonia under different environmental conditions and have displaced their bacterial counterparts in terms of importance in the global biogeochemical cycle, providing an avalanche of AOA molecular data (16S rDNA and amoA gene sequences) from very diverse environments worldwide. As far as we don’t have enough genomic data to perform an holistic approach using population genomics and reverse ecology to unveil the ecological and evolutionary mechanisms driving the adaptation; we focused our experiments on the amoA gene sequence. Because ammonia monooxygenase is supposed to be the key enzyme in the ammonia oxidation, we applied a combination of community ecology and molecular evolution methods to understand the mechanisms of the diversification patterns observed in the amoA gene. Another unsolved question in the archaeal ammonia oxidation is the unusual biochemistry found in the genome sequences from cultured archaeal ammonia oxidizers. In archaea, all the elements of the bacterial ammonia oxidizing pathway are missing but the genes coding for the presumptive AMO. To unveil missing pathways in this process, we have developed a powerful approach based on graphical models to capture all the functional associations present in metagenomes based in their ecological co-ocurrence. The results of the analyses revealed for the first time a global picture of the phylogenetic community structure of ammonia- oxidizing assemblages. Our study unveiled larger phylogenetic richness in AOA with more dissimilar communities and clear monophyletic groups for the different habitats. The rates of diversification in AOA were higher than in AOB and the archaeal diversification dynamics showed an unusual feature, with an initial diversification process followed by a long period of stasis and a final burst of diversification. The variations observed between AOB and AOA in terms of community structure, phylogenetic diversity, diversification patterns, and habitat dispersion were unexpected just a very few years ago, and the community phylogenetics approach has nicely captured these differences. Understand the diversification processes observed in AOA and their successful performance under a myriad of different environmental conditions such as low pH, different ammonia concentrations, high hydrostatic pressures, high light exposure, low oxygen availability among others, needs however of a deeper insight adding the evolutionary processes. Individual changes at the level of nucleotides were translated to the global diversification patterns of archaeal ammonia oxidizers. Thus, this resulted in a step further from the results obtained after applying community phylogenetics methods providing precise evolutionary information behind the phylogenetic patterns observed within an ecological context. We will gain the full picture once the results can be integrated in a comparative genomics framework. After applying methods of reverse engineering of regulatory the associations between the known and the unknown fraction were reconstructed offering a pioneering fresh view for microbial ecology. One especially relevant result obtained from this approach on AOA was the reconstruction of the association network of the different AMO subunits to the other proteins previously reported in the marine AOA Nitrosopumilus. The information recovered from metagenomics combined with available genomes fuels hypothesis for the particular and yet unknown biochemistry of ammonia oxidation in Archaea. / La oxidación del amonio es una de las piezas clave del ciclo del Nitrógeno. Tanto las bacterias como las arqueas oxidadoras del amonio se pueden encontrar coexistiendo a lo largo de diferentes ambientes. Pero cuando la primera arquea oxidadora del amonio fue aislada, se puso en relevancia la importancia de estas en comparación con las bacterias en los ciclos biogeoquímicos globales. Desde entonces hemos sido inundados por una avalancha de secuencias génicas de estas arqueas, mostrando una gran capacidad de diversificación y adaptación a ambientes diferentes. Al no disponer de suficientes datos para realizar una aproximación holistica utilizando genómica de poblaciones y de ecología inversa para poder discernir los mecanismos ecológicos y evolutivos relacionados con la adaptación; nos hemos centrado en estudiar la secuencia del amoA. La amonio monooxigenasa es la enzima responsable de la oxidación del amonio, para su estudio hemos aplicado una combinación de técnicas de ecología de comunidades y de evolución molecular con el objetivo de entender los mecanismos de los patrones de diversificación observados. Por otra banda, otro de los misterios asociados a la oxidación del amonio por parte de las arqueas, es su inusual bioquímica para realizar la oxidación del amonio. En arqueas faltan todos los elementos necesarios para llevar a cabo la oxidación del amonio a excepción del AMO. Para poder aportar algo de luz a este misterio hemos desarrollado un potente método basado en modelos gráficos para capturar todas las asociaciones funcionales presentes en los metagenomas basado en sus co-ocurrencias ecológicas.

El grau de diferenciació poblacional de les espècies marines sembla estar altament relacionat amb la seva capacitat de dispersió. En aquest treball s'ha realitzat la comparació dels nivells d'estructura poblacional entre dues espècies de peixos mediterranis amb diferents capacitats de dispersió durant la seva fase larvària i amb capacitats de moviment de l'adult semblants. Amb l'objectiu de delimitar de forma correcta les àrees de distribució d'ambdues espècies, evitant així la presència de possibles espècies críptiques i per esclarir els processos que les han originat s'ha realitzat una filogènia molecular per ambdues espècies. S'han utilitzat loci microsatèl.lits altament polimòrfics per tal d'inferir els nivells de diferenciació poblacional per cada espècie, així doncs, dues genoteques enriquides s'han dut a terme, una per cada espècie. Com a conclusió s'ha observat un grau de diferenciació poblacional major per l'espècie amb una capacitat de dispersió menor en la seva fase larvària en front de la que tenia una major capacitat de dispersió, corroborant la hipòtesis inicial d'aquesta tesi.

Aquesta tesi pretenia proporcionar noves perspectives sobre les relacions evolutives entre llagostes de l'infraordre Achelata utilitzant marcadors moleculars, tant d'evolució lenta com d'evolució ràpida, i calcular el temps de divergència entre taxa utilitzant el mètode del rellotge molecular relaxat. Alhora, es pretenia desenvolupar una genoteca per a la llagosta europea Palinurus elephas per tal d'obtenir un conjunt de marcadors microsatèl·lit polimòrfics i comparar les mesures de diversitat genètica i grandària efectiva obtingudes en les sis espècies descrites del gènere Palinurus. A més, es pretenia estudiar les relacions filogenètiques entre espècies del gènere Palinurus i testar el suport de les dades moleculars a diferents hipòtesis evolutives, utilitzant els mètodes clàssics basats en distàncies, i mètodes recents basats en la teoria de la coalescència, com la Computació Bayesiana Aproximada (ABC). Per últim, s'avaluarà l'estructura genètica de les poblacions de P. elephas dins i entre les conques atlàntica i mediterrània i s'estudiarà l'efecte de les diferents estructures oceanogràfiques sobre aquesta estructuració utilitzant el conjunt de marcadors microsatèl·lit prèviament desenvolupat.Els resultats obtesos ens premeten afirmar que les llagostes de l'infraordre Achelata formen un grup monofilètic de crustacis decàpodes compost de dues famílies principals: Palinuridae i Scyllaridae. L'anàlisi molecular confirma Synaxidae com un grup polifilètic, que s'hauria d'incloure dins de Palinuridae. Així, els Palinuridae estarien formats per tres llinatges principals: 1) els Silentes, incloent-hi l'anterior gènere synaxid Palinurellus; 2) un clade Linuparus/Justitia i 3) un clade principal de Stridentes, incloent-hi els gèneres Puerulus, Palinustus, Palinurus, Panulirus i l'anterior synàxid Palibythus. A més, els dos clades principals trobats dins del Scyllaridae estan d'acord amb la taxonomia actual basada en dades morfològiques. Finalment, la datació del temps de divergència del grup Achelata obtinguda amb un model de rellotge relaxat és compatible amb hipòtesis prèvies d'un origen Triassic d'aquest grup. Per tal d'estudiar els processos de divergència més recent dins del gènere Palinurus, s'ha aïllat un conjunt de marcadors microsatèl.lit altament polimòrfics per a P. elephas que, a més a més, també amplifiquen i són polimòrfics per a totes les espècies de Palinurus. Les espècies de Palinurus en aigües superficials semblen tenir unes grandàries poblacionals efectives i un grau de variabilitat en marcadors nuclears majors que les espècies d'aigües profondes, alhora que també semblen haver estat sotmeses a processos més recents de selecció en el mtDNA. L'anàlisi filogenètica dóna suport a un patró d'especiació Nord-Sud al gènere Palinurus, amb totes les espècies africanes formant un clade monofilètic. El patró d'especiació en Palinurus seria un exemple típic d'una sèrie d'esdeveniments d'especiació ràpids, amb branques molt curtes separant les diferents espècies. Curiosament, els temps de divergència obtinguts utilitzant les taxes de mutació estàndards, permeten relacionar els processos d'especiació als processos de canvi climàtic més destacats dels darrers 2 Mya. Finalment, els resultats obtinguts a partir de les dades microsatèl.lit i mtDNA mostren que l'estructuració genètica de les poblacions de llagosta europea és molt baixa. Tanmateix, les conques atlàntica i mediterrània mostren diferències significatives i per tant, es recomana tractar-les com a unitats de gestió diferenciades. Tot i la reducció dràstica en les captures per tota l'àrea de distribució de P. elephas, la grandària efectiva poblacional històrica de P. elephas sembla haver-se mantés constant. A més a més, cal tenir en compte que l'elevada grandària efectiva poblacional de P. elephas provocaria valors de Fst extremadament petits, fins i tot per a poblacions amb nivells de dispersió restringits. / THESIS SUMMARY:The present PhD thesis focus on Achelata lobsters' evolutionary genetics, shifting from ancient divergences to contemporary population genetics. Our results indicate that Achelata form a monophyletic group composed of two main families: Palinuridae and Scyllaridae. The molecular analysis confirms Synaxidae as a polyphyletic group, which should be included within Palinuridae. Therefore, Palinuridae family presents three main lineages: 1) the Silentes, including the former synaxid genus Palinurellus; 2) a Linuparus/Justitia clade and 3) a main clade of Stridentes, including Puerulus, Palinustus, Palinurus, Panulirus and the former synaxid lobster Palibythus. Moreover, the two main clades found within the Scyllaridae are in agreement with current taxonomy based on adult morphological data. Finally, the dating of divergence of Achelata obtained with a relaxed-clock model is compatible with previous hypotheses of a Triassic origin of the Achelata lobsters.A set of highly polymorphic microsatellite markers has been developed from P. elephas which also gives successful amplification and show polymorphism for all Palinurus species. Shallow-water Palinurus species show larger effective population size and genetic diversity for nuclear markers than their deep-water counterparts. At the same time, selection on the shallow-water species' mtDNA genome seems to have been stronger and more recent. Our within-genus phylogenetic analyses consistently supported a North-to-South pattern of speciation in Palinurus with all the South-African species forming a monophyletic clade. Therefore, the Palinurus speciation pattern is a typical example of a series of rapid speciation events occurring within a group, with very short branches separating the different species. Interestingly, divergence times obtained for Palinurus species using the standard rates agree with known glaciation-related processes during the last 2My.Finally, our results for the intraspecific analysis of Palinurus elephas show that no strong population genetic differentiation is present in the European spiny lobster. However, Atlantic and Mediterranean basins showed significant differences and should be treated as different management units. Even though over-fishing has reduced catches dramatically all over its distribution area, historical effective population size seems to have remained constant in the European spiny lobster. The large effective population size of P. elephas would cause Fst values to be extremely small even for populations with restricted levels of dispersal.

La Retinosi Pigmentària (RP), la causa de ceguesa més freqüent en adults (1:4000), està originada per mutacions en més de 50 gens. Un d’aquests és CERKL, gen identificat l’any 2004 pel grup, l’estudi funcional del qual constitueix el tema d’aquesta Tesi Doctoral. Fins el moment, s’han descrit vàries mutacions en CERKL causants d’RP o de distròfia de cons i bastons (CRD). A nivell proteic, CERKL presenta un 50% de similitud amb la proteïna quinasa de ceramides (CERK) i comparteix el domini diacilglicerol quinasa (DAGK). Endemés, CERKL presenta diferents dominis proteics coneguts (senyals de localització (NLS) i d’exportació (NES) nuclear, així com un domini d’homologia a plextrina (PH)). Tot i que s’han identificat mutacions que indubtablement causen degeneració retinal, encara resta per descriure la seva funció fisiològica, així com la seva contribució a la patologia. L’objectiu principal d’aquest treball ha estat la caracterització funcional del gen i la proteïna CERKL a partir d’assaigs in vitro, combinant estratègies in silico, cel•lulars i moleculars, profunditzant en les anàlisis quantitatives i qualitatives dels principals esfingolípids. Finalment, també s’ha construït i analitzat un model animal murí knockout, Cerkl -/-. Els principals resultats obtinguts en aquest treball s’enumeren a continuació: 1.- A nivell transcripcional, s’han caracteritzat de forma exhaustiva les isoformes produïdes per CERKL en retina humana i murina, revelant un nivell de complexitat inesperat, amb més de 20 isoformes, degudes principalment a empalmament alternatiu, així com a la presència de, com a mínim, quatre promotors diferents amb especificitat tissular. 2.- Estudis cel•lulars de sobreexpressió mostren que CERKL exerceix un efecte protector davant l’apoptosi causada per estrès oxidatiu, mentre que les formes mutants no retenen aquesta funció. Encara que els mecanismes de protecció es desconeixen, aquests resultats apunten a una funció neuroprotectora a curt termini de CERKL als fotoreceptors, els quals estan sotmesos de manera continuada a estrès lumínic i oxidatiu. 3.- Estudis exhaustius i detallats mitjançant tècniques de TLC, HPLC i UPLC per l’anàlisi de lípids han demostrat que CERKL no fosforila les ceramides ni cap dels esfingolípids identificats fins el moment, sota les condicions utilitzades. Tampoc s’ha pogut observar una funció quinasa de proteïnes. Els resultats obtinguts en aquest treball apunten a que CERKL ha d’exercir una altra funció a la cèl•lula, molt probablement lligada al transport de lípids o a la regulació d’altres processos cel•lulars. 4.- La localització subcel•lular ha determinat que CERKL localitza, principalment, al reticle endoplasmàtic i a l’aparell de Golgi i, de manera minoritària, al nucli, mostrant una localització extremadament dinàmica que recolza la contribució de CERKL en processos de transport i senyalització, així com una multiplicitat funcional. 5.- Un dels aspectes claus d’aquesta Tesi ha estat el disseny, generació i estudi fenotípic a nivell transcripcional, cel•lular, morfològic, electroretinogràfic i lipidòmic del model animal Cerkl-/-. El ratolí Cerkl-/- és viable i fèrtil, i els nostres estudis preliminars no mostren una degeneració de retina severa. El fenotip dels ratolins KO mostra una alteració significativa i consistent dels potencials oscil•latoris als electroretinogrames, els quals indiquen una afectació de les cèl•lules ganglionars i/o amacrines. Aquestes dades concorden amb les anàlisis immunohistoquímiques i d’hibridació in situ en retines de ratolí WT i KO, on la màxima expressió de CERKL es detecta en les cèl•lules ganglionars, i de manera més moderada, en la capa nuclear interna i fotoreceptors. En resum, CERKL és un gen que mostra una gran complexitat transcripcional i funcional. Els pròxims objectius abordaran l’estudi en detall del model animal generat, així com d’altres models en vies de construcció. / The main aim of this thesis was the transcriptional and functional characterisation of CERKL, one of the many genes described so far that are responsible for Retinitis Pigmentosa (RP), the main genetic cause of blindness in adults (prevalence 1:4.000). In particular, we aimed to: i) characterise the complex CERKL transcription in human and mouse retinas, ii) analyse the subcellular localisation of the CERKL encoded proteins, including the truncated isoform R257X, generated by the most frequent mutant allele; iii) characterise the substrate and possible enzymatic role of the CERKL protein; iv) describe the role of CERKL in the protection against oxidative stress; and last but not least, v) design, create and initially characterise a mouse Cerkl-/- model (knockout) at the transcriptional, histological, immunohistochemical and lipidomic levels, focussing on the retina. Our results showed a high transcriptional complexity of the CERKL gene in the human and murine retina, with an extremely dynamic subcellular localisation, indicating the possibility of different functional roles in each compartment. The overexpression of CERKL protects cells from induced oxidative stress, suggesting that CERKL might play an important role in the initial response against oxidative injuries. CERKL harbours a conserved lipid kinase domain and the high homology with CERK has suggested a possible involvement in the sphingolipid metabolism. However, up to date, no kinase activity has been detected and the CERKL function remains unclear. In order to elucidate the CERKL physiological function, study its role in the retina, and whether it is (or not) related to sphingolipid metabolism, a knockout mouse was generated. The murine model resulted in a knockdown more than a knockout model, as alternative previously unreported promoters directed basal expression of Cerkl. Initial characterisation of the animal model phenotype showed a consistent and non-progressive alteration of the oscillatory potentials in the electroretinograms, an increase of apoptosis and GFAP protein (gliosis marker), as well as a decrease in Brn3a protein (ganglion cell marker), although no gross morphological changes were detectable. All together, these results point to clear signs of functional alteration at the ganglion cell layer. To determine the CERKL involvement in the sphingolipid metabolism, lipidomic quantification was performed and the analyses of the results are currently in progress.

El objetivo principal del trabajo es caracterizar al nivel molecular la variabilidad poblacional de la abeja doméstica, Apis mellifera Linneo, 1758, corroborando de esta manera varias hipótesis de trabajo. Una de ellas se refiere a la estructura poblacional de las abejas en la Región de Murcia y al efecto racial que se deriva de la importación de reinas y del proceso de la trashumancia de las colmenas. Otra hipótesis se refiere a la singularidad de las abejas de las Islas Canarias, cuyos antecesores se sitúan en el norte de África (poblamiento antiguo de las islas por causas naturales) o en la Península Ibérica (poblamiento antrópico a partir del siglo XVI). Se trata de determinar si existe una raza peculiar de estas islas y sus posibles ancestros. / The main objective of this thesis is to characterise at the molecular level, the population variability of Apis mellifera Linné, 1758, and to corroborate in this way several hypotheses. One of them is related with the structure of the honeybee populations from Murcia and the racial effect derived from the queen importation and the migrating movements. Other hypothesis to be corroborated is referred to Canarian honeybees, whose origin could be either Northern Africa (due to natural events) or the Iberian Peninsula (due to human activities from XVI century). The existence of an endemic honeybee race from the Canaries will be investigated.

Ralstonia solanacearum is a soil-borne beta-proteobacterium that causes wilting disease on a wide range of plants with economic importance like tomato, potato, pepper, eggplant and banana. Each year, bacterial wilt pose important threats to agriculture by producing significant economic losses to small-scale producers in developing countries and, lately, the geographical distribution of the pathogen is spreading to temperate regions of the globe. The long-term aim of the work developed was the determination of the genetic program used by R. solanacearum during plant colonization and at the different stages of disease, in order to provide a biologically relevant understanding of the repression/activation regulatory switches controlling R. solanacearum pathogenicity. We noticed that new molecular tools for functional genetic studies adapted to R. solanacearum were needed, because the widely used mutants obtained bytransposon mutagenesis contain gene disruptions rendering, in some cases, bacteria with affected virulence, pathogenicity and unable to multiply inside susceptible plants. In addition, a common issue in R. solanacearum studies was the difficulty to trans-complement gene disruptions. So far, the only alternative available was the use of plasmids, which provided a means of overexpression rather than stoichiometrical complementation, Moreover, the use of antibiotics to maintain plasmids during plant infection is not an option due to the complexity of the system. In this thesis we developed a novel system – pRC, after Ralstonia chromosome –, based in targeted and stable insertions in a precise and permissive location of the bacterial chromosome. We proposed the use of our versatile set of suicide plasmids for the study of transcriptional output (promoter probing) during plant infection, effector overexpression and purification, and monocopy gene complementation in any R. solanacearum strain. The use of the pRC system in any strain will allow the standardization of the genetic studies made in the field. We also investigated gene activities in planta. To that end, we successfully applied a luminescent reporter in the bacterial chromosome to visualize and quantify in real time the activity of pathogenicity-related promoters. We fused the promoter regions controlling two major virulence determinants to the luxCDABE reporter and followed light emission at different stages of plant infection. This strategy allowed us to establish both the timing and the exact location in the plant where these bacterial genes were expressed. Our main finding was that the T3SS is active throughout plant infection and not only at the first colonization stages. It is likely that during plant infection many overlapping signals are perceived by the bacteria, adding complexity to the gene regulatory model proposed in the literature. Together with the two articles published in peer-review journals, two additional drafts, describing the current progress of two other projects are also provided. The first draft reports a novel regulatory feedback loop governing hrpB expression when R. solanacearum is grown in the presence of plant cells. This work is part of a collaboration with Stéphane Genin (Laboratoire des Interactions Plantes Micro-organismes (LIPM, INRA-CNRS, Castanet Tolosan, France).The second draft reports the use of the pRC system to decipher “cool-adaptation” on strain UW551. This work is part of a collaboration with Caitilyn Allen research group (University of Wisconsin – Madison, Wisconsin, USA). / Ralstonia solanacearum es una bacteria Gram-negativa que causa una enfermedad de plantas conocida como marchitez bacteriana. El espectro de plantas huéspedes afectadas es amplio, incluyendo algunas especies con relevancia económica, como por ejemplo el tomate, la patata, el pimiento, la berenjena y el plátano. El objetivo a transversal de la investigación desarrollada en esta tesis de doctorado es la determinación del programa genético utilizado por R. solanacearum durante diferentes etapas de colonización de las plantas. Describimos un novedoso sistema - pRC, basado en el uso de inserciones específicas y estables en un punto específico del cromosoma bacteriano. Proponemos el uso de nuestra versátil colección de plásmidos suicidas para el estudio de la actividad de promotores de genes de patogenicidad y virulencia, la sobreexpresión y purificación de proteínas efectoras y la complementación de genes. El uso del sistema de pRC en cualquier cepa de R. solanacearum permitirá la estandarización de los estudios genéticos realizados en el campo de investigación. En esta tesis también se describe la utilización un reportero luminiscente, integrado en el genoma de la bacteria para visualizar y cuantificar en tiempo real la actividad de promotores de genes de patogenicidad durante la infección. Esta estrategia nos permitió determinar el momento y el lugar exacto de la planta donde se expresan los genes bacterianos. Nuestro principal hallazgo fue que el sistema de secreción de tipo III se transcribe a lo largo del proceso infeccioso y no sólo en las primeras etapas de colonización. Junto con los dos artículos publicados en revistas internacionales, se incluyen también dos manuscritos, que describen el progreso actual de dos otros proyectos. En el primer manuscrito se describe un nuevo proceso de regulación de la expresión de hrpB, cuando R. solanacearum se cultiva en presencia de las células vegetales. Este trabajo es parte de una colaboración con Stéphane Genin, del “Laboratoire des Plantes Interacciones Microorganismos” (LIPM, INRA-CNRS, Castanet Tolosan, Francia). El segundo proyecto describe el uso del sistema pRC para descifrar la capacidad de infección de la cepa UW551 a temperaturas bajas. Este trabajo es parte de una colaboración con el grupo de investigación de Caitilyn Allen (Universidad de Wisconsin - Madison, Wisconsin, EE.UU.)

Les proteïnes HP1 (Heterocromatin protein 1) estan conservades als eucariotes, on la majoria de les espècies contenen vàries isoformes. A partir de les propietats de l'HP1a de Drosophila, s'ha proposat que les proteïnes HP1 uneixen la metilació de l'H3K9 i recluten factors involucrats en l'ensamblatge de l'heterocromatina i el silenciament. No se sap, però, si aquest model és aplicable a totes les isoformes d'HP1 i tots el contextos funcionals. En aquest article aportem que l'HP1c regula l'expressió gènica, ja que (1) localitza a dominis de cromatina activa, on colocalitza abastament amb la forma pausada de la RNA polimerasa II (RNApolII), PolIIser5, i amb la trimetilació de l'H3K4, suggerint una contribució a la regulació transcripcional; (2) la seva localització ectòpica a un gen reporter no indueix el seu silenciament, ans el contrari, incrementa la seva expressió, i (3) interacciona amb dues proteïnes que contenen varis Zn-fingers, WOC (without children) i ROW (Relative of WOC, que són putatius factors de transcripció. També mostrem que tot i que l'HP1c s'uneix eficientment a la metilació de l'H3K9 in vitro, la seva unió a la cromatina in vivo depèn estrictament de WOC i ROW. A més a més, les anàlisis d'expressió realitzades indiquen que HP1c, WOC i ROW regulen un programa d'expressió gènica comú, el qual és executat en part, en el context del sistema nerviós. A partir d'aquestes dades, que revelen la contribució de factors que uneixen ADN a la funcionalitat i el reclutament de l'HP1c, les proteïnes HP1 emergeixen com una família de proteïnes reguladores de la cromatina cada cop més diversa. / Heterochromatin protein 1 (HP1) proteins are conserved in eukaryotes, with most species containing several isoforms. Based on the properties of Drosophila HP1a, it was proposed that HP1s bind H3K9me2,3 and recruit factors involved in heterochromatin assembly and silencing. Yet, it is unclear whether this general picture applies to all HP1 isoforms and functional contexts. Here, we report that Drosophila HP1c regulates gene expression, as (1) it localizes to active chromatin domains, where it extensively colocalizes with the poised form of RNApolymerase II (RNApol II), Pol IIoser5, and H3K4me3, suggesting a contribution to transcriptional regulation; (2) its targeting to a reporter gene does not induce silencing but, on the contrary, increases its expression, and (3) it interacts with the zinc-finger proteins WOC (without children) and Relative-of-WOC (ROW), which are putative transcription factors. Here, we also show that, although HP1c efficiently binds H3K9me2,3 in vitro, its binding to chromatin strictly depends on both WOC and ROW. Moreover, expression profiling indicates that HP1c, WOC, and ROW regulate a common gene expression program that, in part, is executed in the context of the nervous system. From this study, which unveils the essential contribution of DNA-binding proteins to HP1c functionality and recruitment, HP1 proteins emerge as an increasingly diverse family of chromatin regulators.