Tesi realitzada a l'Institut Hospital del Mar d'Investigacions Mèdiques (IMIM) / Un dels factors pronòstics més importants en la leucèmia limfàtica crònica (LLC) són les categories de risc citogenètic, basades en la detecció de del(13q), trisomia 12, del(11q) i del(17p) per hibridació in situ fluorescent (FISH). Aquests grups són alhora heterogenis, i s'han descrit altres alteracions recurrents de valor pronòstic incert no incloses als panells de FISH utilitzats. L'objectiu global de la tesi doctoral és realitzar la caracterització citogenètica dels pacients amb LLC i correlacionar les dades obtingudes amb el pronòstic d'aquests. Els primers treballs estudien la variabilitat entre els pacients amb LLC i deleció de 13q. El treball 1 compara les característiques dels pacients amb del(13q) monoal•èlica (13qx1) i bial•èlica (13qx2), o amb coexistència d'ambdós clons (13qM) d'una cohort de 627 pacients amb LLC i del(13q) aïllada per FISH. Es va demostrar que, malgrat no presentar diferències significatives al curs clínic, la mediana de nuclis alterats per FISH era superior als pacients amb 13qx2 i 13qM respecte al grup 13qx1, i que les pèrdues bial•èliques podien sorgir com a evolució clonal de les monoal•èliques. D'altra banda, el percentatge de del(13q) per FISH tenia un impacte significatiu al pronòstic. Es va concloure que el pronòstic associat a la del(13q) aïllada es pot estratificar segons el percentatge d'alteració per FISH, i que la pèrdua del segon al•lel de 13q no és suficient per aportar un pitjor pronòstic. El treball 2 s'ha centrat en l'impacte de la detecció d'alteracions de 13q per citogenètica convencional (CC). Es van comparar les característiques dels pacients amb alteracions de 13q14 al cariotip, 25 pacients amb translocacions [t(13q)] i 62 amb delecions intersticials [i-del(13q)], amb un grup de 295 pacients amb del(13q) únicament detectada per FISH [F-del(13q)]. Es van estudiar les alteracions incloses al panell de FISH rutina en LLC i les delecions de RB1. En total es van identificar 25 t(13q) diferents; totes mostraven deleció de D13S319, però només un 32% també presentava pèrdua de RB1. Les medianes de nuclis amb del(13q) dels grup t(13q) i i-del(13q), eren significativament superiors que la del F-del(13q). A més, els pacients amb t(13q) mostraven una incidència major de del(13q) bial•èliques i del(17p) concomitant. La taxa de pèrdua de RB1 era significativament superior al grup i-del(13q). Respecte a l’evolució clínica, el temps fins requerir tractament dels t(13q) i i-del(13q) era significativament més curt que als F-del(13q). En conclusió, l’anàlisi per CC als pacients amb del(13q) permet identificar un subgrup de pacients amb un curs clínic més agressiu. La segona part de la tesi, recollida al treball 3, pretén definir l’aplicabilitat a la pràctica clínica dels microarrays genòmics en la rutina diagnòstica de la LLC. Es van analitzar 70 pacients per microarrays, i es van comparar els resultats amb els obtinguts amb les tècniques utilitzades a la rutina diagnòstica, CC i FISH. La tècnica amb una major taxa de detecció d’alteracions van ser els microarrays. No obstant, els microarrays oferien una menor sensibilitat i no van detectar del(11q) o del(17) identificades per FISH en quatre pacients. A més, la significança clínica de les altres anomalies identificades microarrays no va poder ser demostrada. Es va concloure que l’anàlisi per microarrays és una tècnica vàlida per a l’estudi citogenètic en LLC, però que la completa substitució de la CC i el FISH a la pràctica clínica podia afectar negativament al maneig d’alguns pacients. Globalment, els resultats d’aquesta tesi demostren que l’aplicació combinada de diferents tècniques d’anàlisi citogenètic en LLC permet la identificació d’un ampli ventall d’anomalies, així com una millor caracterització de les alteracions incloses al panell de FISH de la LLC, que poden ser útils per a una millor estratificació pronòstica dels pacients amb LLC. / One of the most important prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia (CLL) are cytogenetic risk categories based on the detection of del(13q), trisomy 12, del(11q) and del(17p) by fluorescent in situ hybridization (FISH). However, they are heterogeneous and other alterations have been described. The aim was to perform a cytogenetic characterization of CLL patients and correlate the data with the prognosis. Two of the papers included in the thesis were focused on del(13q). The first analyzes 627 patients with isolated del(13q) by FISH, and compares those who carried monoallelic, biallelic or mosaicism of both 13q deletions. While no significant differences in the outcome was observed, the percentage of del(13q) by FISH had a significant impact on prognosis. In conclusion, del(13q) prognosis can be stratified according to the percentage by FISH, and the loss of the second 13q allele is not enough to trigger a worse outcome. In the second, we compared 25 patients with translocations [t(13q)] and 62 with interstitial deletions [i-del (13q)], with 295 patients with del(13q) only detected by FISH [F-del (13q)]. All the t(13q) showed deletion of the locus D135319, but only 32% also lost RB1. Significant differences in cytogenetic features were observed among groups, this could contribute to the significant shorter time to first treatment observed in t(13q) and i-del(13q) patients. In conclusion, a subgroup of 13q-patients with a poorer outcome can be identified by conventional cytoge n et ics (CC). The third paper compares CC, FISH and microarrays results from 70 patients. Microarray analysis obtained the highest abnormalities detection rate, but showed lower sensitivity and failed to detect some abnormalities identified by FISH. Moreover, clinical significance of other anomalies detected by microarrays could not be demonstrated. In conclusion, microarrays are valid for cytogenetic characterization in CLL. However, the complete replacement of the CC and FISH by microarrays in routine laboratories could negatively affect the management of some patients. Overall, the results show that the combined application of cytogenetic techniques in LLC allow the identification of a wide range of abnormalities, and a better characterization of alterations included in the CLL FISH panel, that may be useful for better prognostic stratification of CLL patients.

Este trabajo ha sido realizado en el Grupo de Cromatina y Enfermedad del Programa de Epigenética y Biología de Cáncer (PEBC) del Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / La presente tesis doctoral se ha centrado en investigar los procesos de desregulación en la metilación del DNA y de microRNAs en dos tipos celulares implicados en la patogenia de la artritis reumatoide, cuya función se encuentra exacerbada en el sinovio de las personas afectadas: fibroblastos sinoviales y osteoclastos. En primer lugar, se han analizado los fibroblastos sinoviales obtenidos de articulaciones procedentes de pacientes con artritis reumatoide, comparando los niveles de metilación del DNA y de expresión de microRNAs entre dos series obtenidas de pacientes y controles. En segundo lugar se ha estudiado el proceso de osteoclastogénesis, por el cual los monocitos, se fusionan y diferencian en osteoclastos multinucleados, capaces de degradar el hueso. Los fibroblastos sinoviales y los osteoclastos son dos tipos celulares que en artritis reumatoide tienen una función aberrante, dado que se encuentran hiperactivos. En la articulación afectada, los fibroblastos sinoviales hiperactivos degradan el cartílago, mientras que los osteoclastos, contribuyen a la destrucción del hueso. Tras un proceso continuado de degradación, la articulación puede perder su función y la persona que padece la AR quedar seriamente afectada. En el caso de los fibroblastos sinoviales, se han extraído de rodillas de personas con artritis reumatoide, y los hemos comparado con controles examinando sus perfiles de metilación de DNA y miRNAs, para investigar las diferencias entre los fibroblastos de pacientes y controles. Las variaciones entre los dos grupos encontradas indican potenciales vías de señalización y genes desregulados en esta enfermedad. Ente los ejemplos más reseñables cabe destacar la hipometilación del gen IL6R, TNFAIP8, HOXA11y CD74. Además, los datos de metilación, expresión de microRNAs así como expresión de mRNA, se integraron para conocer en profundidad las interconexiones entre las diferentes capas de regulación que están detrás del comportamiento aberrante de este tipo celular. Por otro lado, hemos analizado in vitro qué cambios epigenéticos suceden durante la diferenciación de monocitos a osteoclastos. Para ello, hemos realizado un análisis de metilación de DNA durante el proceso de diferenciación de monocitos y osteoclastos derivados de los anteriores, así como de varias series temporales para conocer las dinámicas de metilación. Como resultado hemos descubierto que en este proceso de diferenciación, el perfil de metilación cambia drásticamente. Genes clave en la función del osteoclasto, como la CTSK, ACP5 o TM4SF7, se hipometilan de forma activa, rápidamente, y se sobreexpresan. También genes específicos de monocito, como el CX3CR1 se hipermetilan y silencian específicamente. Además, hemos determinado que el factor de transcripción PU.1, tiene un papel clave en este cambio epigenético, dado que actúa como conector dual en el reclutamiento de la maquinaria epigenética (TET2 y DNMT3b) que va a modificar, en un sentido o en otro (hipometilación e hipermetilación) el epigenoma. La caracterización del mecanismo a nivel molecular en este proceso de diferenciación es clave para posteriormente encontrar vías de señalización que potencialmente puedan ser inhibidas farmacológicamente. Por último, se ha analizado el perfil de expresión de microRNAs en este proceso de diferenciación mieloide. Se ha realizado inicialmente un screening de expresión de 380 miRNAs a varios tiempos (0d, 2d y 21d), centrándonos posteriormente en dos clusters de miRNAs, el miR-212/132 y el miR- 99b/let-7e/125a. Se ha demostrado el papel clave que estos microRNAs desempeñan en el proceso de diferenciación, dado que su inhibición funcional, retrasó la formación de los osteoclastos, así como la expresión de marcadores de osteoclasto, y la represión de genes de linaje alternativo. / ARTICLE 1: Autoimmune rheumatic diseases are complex disorders, whose etiopathology is attributed to a crosstalk between genetic predisposition and environmental factors. Both variants of autoimmune susceptibility genes and environment are involved in the generation of aberrant epigenetic profiles in a cell-specific manner, which ultimately result in dysregulation of expression. In this study we performed DNA methylation and miRNA expression screening of a set of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and compared the results with those obtained from osteoarthritis patients with a normal phenotype. DNA methylation screening allowed us to identify changes in novel key target genes like IL6R, CAPN8 and DPP4, as well as several HOX genes. A significant proportion of genes undergoing DNA methylation changes were inversely correlated with expression. miRNA screening revealed the existence of subsets of miRNAs that underwent changes in expression. Integrated analysis highlighted sets of miRNAs that are controlled by DNA methylation, and genes that are regulated by DNA methylation and are targeted by miRNAs with a potential use as clinical markers. Our study enabled the identification of novel dysregulated targets in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and generated a new workflow for the integrated analysis of miRNA and epigenetic control. ARTICLE2: Background: DNA methylation is a key epigenetic mechanism for driving and stabilizing cell-fate decisions. Local deposition and removal of DNA methylation are tightly coupled with transcription factor binding, although the relationship varies with the specific differentiation process. Results: Here we focused on DNA methylation changes during osteoclastogenesis. Hypermethylation and hypomethylation changes took place in several thousand genes, including all relevant osteoclast differentiation and function categories. Hypomethylation occurred in association with changes in 5-hydroxymethylcytosine, a proposed intermediate toward demethylation. Transcription factor binding motif analysis revealed an overrepresentation of PU.1, NF-kB and AP-1 (Jun/Fos) binding motifs in genes undergoing DNA methylation changes. Among these, only PU.1 motifs were significantly enriched in both hypermethylated and hypomethylated genes; ChIP-seq data analysis confirmed its association to both gene sets. Moreover, PU.1 interacts with both DNMT3b and TET2, suggesting its participation in driving hypermethylation and hydroxymethylation-mediated hypomethylation. Consistent with this, siRNA-mediated PU.1 knockdown in primary monocytes impaired the acquisition of DNA methylation and expression changes, and reduced the association of TET2 and DNMT3b at PU.1 targets during osteoclast differentiation. Conclusions: The work described here identifies key changes in DNA methylation during monocyte-to-osteoclast differentiation and reveals novel roles for PU.1 in this process.

La naturaleza genética del gen de la ß-lactamasa SHV-1 ha sido analizada en 97 cepas de Klebsiella pneumoniae procedentes de productos patológicos humanos y no relacionadas epidemiológicamente. Mediante IEEA se detectaron las bandas de pI 7,6 (SHV-1) en 74 cepas, 7,1 (LEN-1) en 13 cepas y 5,4 (TEM-1) en 10 cepas. Entre las 74 cepas SHV-1, 40 mostraron una doble banda; 20 con pI 7,1 y 20 con pI 5,4. La mayoría de las 74 cepas SHV-1 presentaron plásmidos (76,7%). La transferencia por conjugación de la ß-lactamasa SHV-1 sólo fue posible en 5 casos (9,3%). Se realizó una PCR-RFLP SHV-1 específica del DNA cromosómico que resultó positiva para 93 de las 97 cepas y fue negativa únicamente en 4 cepas productoras de TEM-1. También se analizó el DNA cromosómico de las 97 cepas, en un intento de aproximación al locus génico de SHV-1 mediante restricción por endonucleasas (RFLP) y Southern-blot. La digestión con EcoRI mostró al menos una banda positiva de hibridación en 96 cepas; 2 bandas fueron detectadas en 8 muestras. Únicamente en 1 cepa productora de la ß-lactamasa TEM-1 la hibridación fue negativa. El análisis de las secuencias de DNA no mostró diferencias en las regiones promotoras del gen, ni secuencias de fin de la transcripción adicionales; únicamente mutaciones puntuales que determinaron variantes alélicas. Se describieron algunas nuevas variantes que representaron cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína (SHV-27, 28, 32 y 33 y la LEN-2). Como resultado de los estudios de Southern-blot y secuenciación podemos postular que SHV-1 y LEN-1 están situados muy cercanos y en tándem en el cromosoma bacteriano de K. pneumoniae . Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que el ancestro de SHV-1 fue originado en el cromosoma bacteriano de K. pneumoniae .Esta tesis obtuvo un Excelente "cum laude" por unanimidad. Como complemento puede consultarse Chaves, J. et al., Antimicrob Agents Chemother 2001;45:2856-61.

Mitofusina 2 (Mfn2) es una proteína de fusión mitocondrial. Las evidencias experimentales demuestran una menor expresión génica de Mfn2 en músculo esquelético de sujetos obesos y pacientes diabéticos de tipo 2. Al inhibir la expresión de Mfn2 en células en cultivo se reduce el consumo de oxígeno, el potencial de membrana mitocondrial y la oxidación de glucosa, indicando un papel relevante de Mfn2 en la biología mitocondrial así como en la fisiopatología de la obesidad y/o la diabetes de tipo 2. Además, se han relacionado mutaciones en el gen de Mfn2 con la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth de tipo 2 y se le ha descrito un papel antiproliferativo en desordenes vasculares. Consecuentemente, el estudio de la regulación de la expresión génica de Mfn2 es de notable interés.En esta tesis, se ha clonado el promotor humano de Mfn2 y se ha determinado que carece de caja TATA y se localiza en una isla CpG, lo que lo hace susceptible de ser regulado por metilación. En músculo esquelético posee al menos 6 inicios de transcripción en una ventana de 171 pares de bases. Estudios con genes reporteros han determinado que Sp1 podría tener un papel relevante dirigiendo a la maquinaria basal de transcripción para formar el complejo de preiniciación. La expresión de Mfn2 es mayor en tejidos con requerimientos energéticos elevados. Ensayos con genes reporteros han permitido identificar factores de transcripción que podrían ser responsables de la expresión dependiente de tejido.Se ha estudiado con detalle la inducción de Mfn2 en músculo esquelético y tejido adiposo marrón con la exposición al frío y tratamiento con agonistas de los receptores beta-3-adrenérgicos, condiciones ambas caracterizadas por un elevado gasto energético. El aumento de expresión de Mfn2 en estas condiciones es mediado por PGC-1-alfael cual coactiva a ERR-alfa que se une al promotor de Mfn2 en forma de monómero entre las bases -413 y -408. El incremento del potencial de membrana mitocondrial asociado a la expresión de PGC-1-alfa es inhibido por la represión de la expresión de Mfn2. Mfn2 podría ser un efector crucial en la activación mitocondrial inducida por PGC-1-alfa. Se han aportado nuevas evidencias de la relevancia de Mfn2 en el control de la oxidación mitocondrial de substratos al mostrar una mayor expresión de Mfn2 en fibras musculares oxidativas que en fibras glucolíticas. La transcripción de Mfn2 aumenta en respuesta a incrementos en la concentración de calcio intracelular. Nuestros resultados sugieren que MEF2, el cual se une y activa al promotor de Mfn2, podría ser un efector de la cascada de señalización iniciada por el calcio citosólico. Los datos obtenidos indican que la expresión de Mfn2 en músculo esquelético se incrementan en condiciones de elevado gasto energético lo cual estimula la oxidación de substratos y provoca incrementos en el potencial de membrana mitocondrial. Dependiendo de la demanda celular de ATP, el potencial de membrana mitocondrial se disipa para producir ATP o generar calor.ENGLISH / Mitofusin 2 (Mfn2) is a mitochondrial fusion protein. Mfn2 have been related in several diseases such as neuropathy of Charcot-Marie-Tooth type 2A, vascular proliferative disorders and type 2 diabetes and obesity. Consequently, the mechanisms that regulate Mfn2 gene expression are of relevance. The human Mfn2 promoter was cloned, showing it is located in a CpG island and lacks TATA box. That makes Mfn2 promoter susceptible to be regulated by methylation. In skeletal muscle transcription is initiated in at least 6 points in a 171 bp window. Sp1 may direct the basal machinery to form a preinitiation complex in human Mfn2 promoter.Mfn2 is highly expressed in tissues with elevated energy demand. Gene reporter assays allowed to identify some transcription factors that may mediate tissue specific expression. Mfn2 was induced with cold and -3-adrenergic receptor agonist exposure, conditions associated with enhanced energy expenditure. The cold induced coactivator PGC-1regulated Mfn2 expression requiring the integrity of an estrogen-related receptor alpha (ERR-alpha-binding element located at -413/-408. ERR-alpha also activated the transcriptional activity of the Mfn2 promoter and the effects were synergic with those of PGC-1-alphaRepression of Mfn2 reduces oxygen consumption, glucose oxidation and mitochondrial membrane potential. Using knock down strategy was showed that Mfn2 cold play a crucial role in mitochondrial energization by PGC-1-alpha Mfn2 showed higher expression in slow twitch oxidative muscle fibres than in fast twitch glucolitic fibres. This is a new evidence of Mfn2 as regulator of substrate oxidation. We proved that Mfn2 gene expression was regulated by calcium. High intracellular calcium levels in oxidative muscle fibres could be the initiator of the cascade that results in higher Mfn2 expression. One of the downstream effectors of calcium is MEF2 that binds and activates Mfn2 promoter. Data provided indicated that Mfn2 expression was increased in skeletal muscle when energy demand is high. The increases in Mfn2 expression supposed a higher mitochondrial membrane potential, this mitochondrial membrane potential could be dissipated coupled to ATP synthesis (oxidative muscle) or uncoupled to produce heat (cold exposure) depending the energetic requirements of the cell in each case.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que afecta a millones de personas. Aunque en ratón no existen modelos de psoriasis, la facilidad para obtener muestras de piel de pacientes ha facilitado el estudio de las vías de señalización implicadas en la enfermedad, mostrando la importancia del sistema inmune en su desarrollo. Algunas terapias que utilizan anticuerpos específicos contra varias citoquinas, incluyendo TNFα, IL-23 y IL-17, son prometedoras, pero son caras y presentan efectos secundarios. Numerosos estudios han mostrado la aparición de nuevos casos de psoriasis después del tratamiento con antagonistas del TNFα en pacientes con Inflammatory Bowel Disease. Aunque esos datos indican un papel ambiguo del TNFα en psoriasis, su papel, y especialmente la contribución de sus receptores, en la regulación de la inflamación en piel han sido escasamente estudiados. OBJECTIVES: (1) Caracterización del papel de Tnfa y sus receptores (Tnfr1 y Tnfr2) en la función y distribución de los neutrófilos en larvas de pez cebra; (2) Caracterización de las vías de señalización de Tnfr1 y Tnfr2 involucradas en la homeostasis de la piel en larvas de pez cebra; (3) Caracterización del papel de Tnfa y sus receptores en inflamación crónica en piel en larvas de pez cebra; (4) Evaluación de las larvas de pez cebra como posible modelo para estudiar enfermedades inflamatorias crónicas humanas. METHODOLOGY: Líneas transgénicas de pez cebra y las ventajas de trabajar con sus embriones en in vivo imaging y cell tracking han sido utilizadas para estudiar los patrones de distribución de los neutrófilos. Además, la inflamación en la piel causada por la depleción de Tnfa o Tnfr2, pero no Tnfr1, ha sido estudiada mediante la inhibición genética (morpholinos y formas dominantes negativas) y farmacológica (DPI) de Duox1. La expresión de moléculas pro-inflamatorias ha sido medida mediante RT-qPCR, Neutrófilos y queratinocitos han sido aislados de larvas control y deficientes en Tnfr2 usando FACS-sorting. Sondas específicas para H2O2 han sido usadas para detectar su producción. RESULTS AND CONCLUSIONS: La depleción de Tnfa o Tnfr2, pero no de Tnfr1, causa inflamación en la piel a través de la activación de un bucle inflamatorio de retroalimentación positiva que implica a H2O2/NF-κB/Duox1. Tanto la inhibición genética como farmacológica de Duox1 revierten completamente la inflamación en piel, situando al H2O2 derivado de Duox1 aguas arriba de la activación de NF-κB. Extraemos las siguientes conclusiones: (1) La inhibición genética de Tnfa o Tnfr2, pero no de Tnfr1, resulta en la movilización de los neutrófilos desde la CHT hasta la piel; (2) El silenciamiento de Tnfa o Tnfr2 provoca la inducción en la piel de la expresión de genes que codifican para moléculas pro-inflamatorias; (3) La ausencia de señalización de Tnfa a través del receptor Tnfr2 desencadena la producción local de H2O2 por la enzima Duox1 en la piel; (4) La inhibición genética de Tnfa o Tnfr2 resultada en la activación del regulador maestro de la inflamación NF-кB en la piel, aguas abajo de la producción de H2O2; (5) La señalización de Tnfa a través del receptor Tnfr2 es indispensable para el mantenimiento de la homeostasis de la piel; (6) La inducción de DUOX1 y/o la consiguiente producción de H2O2 en la piel de pacientes con psoriasis, podrían ser nuevas dianas para terapias farmacológicas y genéticas para el tratamiento de la psoriasis. Estas nuevas estrategias podrían ser también aplicables para otras enfermedades inflamatorias crónicas; (7) El pez cebra puede utilizarse como organismo modelo para estudiar la psoriasis y otras enfermedades inflamatorias crónicas. / Psoriasis is a chronic, debilitating skin disease that affects millions of people worldwide. Although there is no mouse model that accurately reproduces all facets of the psoriasis, the accessibility of skin tissue from patients has facilitated the elucidation of some pathways involved in the pathogenesis of psoriasis and highlighted the importance of the immune system in the disease. Recently developed antibodies that selectively target several cytokines, including TNFα, IL-23 and IL-17, have shown promising results in early-phase clinical trials. However, these treatments are extremely expensive and show important side effects. Importantly, numerous studies have reported new-onset psoriasis following TNFα antagonist therapy in adult inflammatory bowel disease patients. Despite these clinical data pointing to an ambiguous function of TNFα in psoriasis, the role of TNFα, and in particular the contribution of each TNFR, in the regulation of skin inflammation has scarcely been studied. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Characterization of the role played by Tnfa and its receptors (Tnfr1 and Tnfr2) in the neutrophil function and distribution patterns in zebrafish larvae; (2) Characterization of the Tnfr1 and Tnfr2 signaling pathways involved in skin homeostasis in zebrafish larvae; (3) Characterization of the role played by Tnfa and its receptors in chronic inflammation in the skin in zebrafish larvae; (4) Evaluation of the zebrafish larvae as a potential model for the study of human chronic inflammatory diseases. METHODOLOGY: Some zebrafish transgenic lines and the unique advantage of the zebrafish embryo for in vivo imaging and cell tracking have been used for the study of the neutrophil distribution patterns. Furthermore, the skin inflammation caused by the depletion of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, has been studied using both genetic (morpholinos and dominant negative forms) and pharmacological (DPI) inhibition of Duox1. The expression of pro-inflammatory molecules has been measured by RT-qPCR, while neutrophils and keratinocytes have been FACS-sorted from controls and Tnfr2-deficient larvae. H2O2-specific probes have been used in order to detect the production of that compound. RESULTS AND CONCLUSIONS: We found that depletion of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, caused skin inflammation through the activation of an H2O2/NF-κB/Duox1 positive feedback inflammatory loop. Moreover, both genetic and pharmacological inhibition of Duox1 completely abrogated skin inflammation, placing Duox1-derived H2O2 upstream of the positive feedback inflammatory loop. Thus, these results lead us to the next conclusions: (1) Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, results in neutrophil mobilization from the CHT to the skin, where they get infiltrated; (2) Target gene silencing of Tnfa or Tnfr2 results in the induction of the expression of genes encoding pro-inflammatory mediators in the skin; (3) The absence of Tnfa signaling through Tnfr2 triggers the local production of H2O2 by Duox1; (4) Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2 results in the activation of the master regulator of inflammation NF-кB in the skin, downstream the production of H2O2; (5) Tnfa signaling through Tnfr2 is critically required for skin homeostasis; (6) DUOX1 induction and/or the subsequent production of H2O2 in the skin of psoriasis patients, may be new targets for pharmacologic and genetic therapies for the treatment of psoriasis. These new strategies could be applicable to other chronic inflammatory diseases as well; (7) Zebrafish can be used as a model organism for the study of psoriasis and other inflammatory chronic diseases.

The origin of animal multicellularity is a major evolutionary transition and a poorly understood one. In recent years, the sequencing of the genomes of several earlybranching metazoans, such as sponges and cnidarians, has allowed to define a common and exclusive molecular toolkit of animal multicellularity. Most of these genes are involved in cell adhesion, cell-cell communication and control of cell proliferation and differentiation, all of them essential functions for a multicellular organism. The access to genomic data of close unicellular relatives of animals, such as the choanoflagellates, has revolutionized the comparative genomic studies to understand the origin of animals and the molecular toolkit of the Urmetazoa (the common ancestor of all animals), showing that some genes that were considered exclusive to animals are, in fact, present in their unicellular relatives and were later co-opted to function in a multicellular context. The sequencing of the genome of the unicellular holozoan Capsaspora owczarzaki offers a new opportunity for further studying this topic. Thus, the main objectives of this thesis have been: first, to perform comparative genomic studies to reconstruct the evolutionary history of animal molecular toolkit; second, to study the functional conservation of some of the genes identified in Capsaspora owczarzaki by performing heterologous expression in model systems such as Xenopus laevis and Drosophila melanogaster; and finally, to study the life cycle and cell biology of Capsaspora owczarzaki to further understand the unicellular functional context in which this genetic toolkit of the multicellularity can act and may have evolved first. One of the main results of our comparative genomic studies is the presence of a complete integrin adhesome in Capsaspora owczarzaki and an almost full adhesome (including integrins) in the more distantly related Thecamonas trahens. This results allowed us to reconstruct the step-wise evolutionary assembly of this key machinery of animal multicellularity. Another important result is the finding of several transcription factors (essential tools for regulating cell differentiation and cell proliferation in animals) in Capsaspora owczarzaki previously considered exclusive to animals, for example NFkappaB, Myc/Max, Mef2, T-box, Runx,... Finally, we found in Capsaspora owczarzaki homologs of the components of the Hippo signalling pathway, an essential mechanism controlling cell proliferation and organ size in animals. Through heterologous expression studies we could study in detail the functional conservation of two of these machineries discovered in Capsaspora owczarzaki by comparative genomic studies. First, we studied the Capsaspora owczarzaki homolog of Brachyury (CoBra) using Xenopus laevis, the classical model system for studying Brachyury function. Brachyury is a T-box transcription factor involved in gastrulation and mesoderm specification in metazoans. We demonstrated that CoBra is functionally conserved and that it has similar DNA binding sites to those of animal T-box genes. Second, we used Drosophila melanogaster to demonstrate the functional conservation of three components of Capsaspora owczarzaki's Hippo pathway. One the most striking morphological features of Capsaspora owczarzaki is the presence of long filopodia. Using this organism and the choanoflagellate Salpingoeca rosetta we studied the origin and evolution of metazoan filopodia and microvilli and the associated molecular toolkit. We found that most components are innovations of animals and these two close unicellular lineages and that the microvilli originated in the common ancestor of animals and choanoflagellates. Finally, we studied the life cycle of Capsaspora owczarzaki using microscopy, flow cytometry and comparative transcriptomics of different life stages. We demonstrated the existence of an aggregative pluricellular stage in Capsaspora owczarzaki and that the transition between this and other stages is tightly regulated at the level of gene expression and alternative splicing. We also found evidence that the integrin adhesome is expressed in the aggregative stage, we an extracellular matrix is produced between the cells. The study of Capsaspora owczarzaki has provided valuable insights into the origin of animal multicellularity and emphasizes the fact that gene co-option was a major mechanism to generate to multicellular molecular toolkit of animals. / El origen de la multicelularidad animal es una de las mayores transiciones evolutivas de la historia de la vida. La secuenciación, en los últimos años, de genomas de animales basales como esponjas y cnidarios ha permitido establecer la maquinaria genética común a todos los animales. La mayoría de estos genes son aquellos involucrados en la adhesión celular, la comunicación celular y el control de la proliferación y la diferenciación. El acceso a datos genómicos de organismos unicelulares muy cercanos a los animales, como Capsaspora owczarzaki, es esencial para entender mejor esta transición. Los objetivos principales de esta tesis ha sido estudiar la presencia de genes de multicelularidad y su conservación funcional en Capsaspora owczarzaki, así como su ciclo vital. Analizando su genoma, descubrimos una completa maquinaria de adhesión por integrinas en C.owczarzaki. Hemos podido reconstruir en detalle la historia evolutiva de este mecanismo crucial de adhesión y comunicación celular. También hemos encontrado un amplio repertorio de factores de transcripción, elementos esenciales para regular la diferenciación y la proliferación en los animales, que se creían exclusivos de animales en el genoma de C.owczarzaki; por ejemplo, genes NFkappaB, T-box o p53. Por último, hemos descrito que una importante vía de señalización en animales, la llamada vía Hippo, también está presente en C.owczarzaki. Este mecanismo es esencial para controlar la proliferación y el tamaño de los órganos en los animales. Mediante estudios de función heteróloga en Xenopus y Drosophila demostramos la conservación funcional de los homólogos del gen Brachyury (un factor de transcripción de la clase T-box) y de la vía Hippo de C.owczarzaki. C.owczarzaki y el coanoflagelado Salpingoeca rosetta nos sirvieron para estudiar la evolución y el origen de los filopodios y microvilli animales y su maquinaria molecular. Por último, el estudio de la biología y el ciclo de C.owczarzaki, mediante el uso de técnicas microscopias, citometría y transcriptómica comparada de los distintos estadios vitales del organismo. Demostramos la existencia de un estadio de pluricelularidad agregativa y que la transición entre éste y otros estadios está finamente regulada a nivel de expresión génica y de splicing alternativo. El estudio de C.owczarzaki nos ha dado valiosos ejemplos de cómo, más allá de la innovación génica, la co-opción de maquinaria pre-existente en un contexto unicelular fue un mecanismo esencial para el origen de la multicelularidad animal.

L'esquizofrènia és una de les psicosis més comunes que té una prevalença d'un 1% en la població mundial i una etiologia desconeguda. Una de les hipòtesis etiopatològiques més recolzades per l'esquizofrènia és la teoria del neurodesenvolupament la qual postula que l'origen de la esquizofrènia tindria lloc per alteracions de la neurogènesi i gliogènesi en les etapes del desenvolupament perinatal. Nombrosos estudis han descrit diverses alteracions de la mielina (substància blanca del cervell) en pacients esquizofrènics. La mielinització dels axons és important per una correcta transmissió del senyal entre neurones. Les cèl·lules responsables de sintetitzar mielina per embolcallar el axons en el cervell són els oligodendròcits. En humans els majors pics del procés de mielinització ocorren en la etapa perinatal, infantesa i adolescència. En aquesta última etapa és on es manifesten majoritàriament els primers símptomes de l'esquizofrènia.Diversos estudis de lligament apunten a que a la regió cromosòmica 6p hi podria haver un gen o gens de susceptibilitat per l'esquizofrènia. El nostre grup va escollir un gen d'aquesta regió, el gen que codifica pel Receptor Domini Discoidina 1 (DDR1), com a candidat per l'esquizofrènia. Se sap que DDR1 és un receptor tirosina quinasa que s'expressa de forma molt important en zones proliferatives durant el neurodesenvolupament del cervell de rata i ratolí i també s'ha vist que s'expressa en cervell humà. DDR1 té com lligant el col·lagen, el qual promou la diferenciació i proliferació de les cèl·lules neuroepitelials en rates. El nostre grup ha observat una important expressió de DDR1 en la substància blanca i en concret en els oligodendròcits durant el desenvolupament pre i postnatal en ratolins. A demés l'expressió d'aquest receptor segueix un patró espacio-temporal al procés de mielinització. En la present tesi doctoral hem estudiat per primera vegada en detall el patró d'expressió gènica i proteïca del receptor DDR1 en cervell humà mitjançant tècniques específiques d'hibridació in situ, immunohistoquímica i de quantificació d'RNAm. Hem trobat que existeix una associació positiva tan a nivell gènic com haplotípic de DDR1 amb l'esquizofrènia mitjançant un estudi d'anàlisi de variants tipus SNPs en una mostra de casos i control. També hem descrit per primera vegada que DDR1 és una proteïna de la mielina en cervell humà i que entre les 5 diferents isoformes que es coneixen només les isoformes DDR1c i DDR1a es relacionen amb la mielina. D'aquesta tesi es deriven les següents aportacions científiques: - Roig B, Virgos C, Franco N, Martorell L, Valero J, Costas J, Carracedo A, Labad A, Vilella E. The discoidin domain receptor 1 as a novel susceptibility gene for schizophrenia. Molecular Psychiatry. 2007. doi: 10.1038/sj.mp.4001995. IF: 11.8- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Tomàs J, Costas J, Vogel WF, Vilella E. Identification of the tyrosine kinase receptor discoidin domain 1 (DDR1) as a novel myelin protein. Sotmés a revisió a la revista Glia. IF: 4.1- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Vilella E. Quantitative analysis of DDR1 mRNA expression in normal and schizophrenic brain. Manuscrit en preparació. / Schizophrenia is one of the most common psychoses in the world today. It has a prevalence of 1% in the population and is of unknown etiology. One of the most widely accepted etiopathogenic hypotheses for schizophrenia is neurodevelopmental theory, which postulates that schizophrenia originates from a variety of neurogenetic and gliogenetic disorders during perinatal development. Many studies have reported that schizophrenic patients have alterations in their myelin (white matter of the brain). Axons must be myelinated if signals are to be properly transmitted between neurons. The cells that form the myelin sheaths of the axons in the CNS are the oligodendrocytes.In humans, the myelination process peaks in the perinatal, childhood and adolescence stages. It is during this last stage that the symptoms of schizophrenia become manifest. Several linkage studies indicate that the 6p chromosomal region may contain one or more susceptibility genes for schizophrenia. Our group chose a gene in this region, the gene encoding the discoidin domain receptor 1 (DDR1), as a candidate gene for schizophrenia.DDR1 is known to be a receptor tyrosine kinase which is highly expressed in proliferative areas during murine brain development, and has also been shown to be expressed in human brain. The DDR1 ligand is collagen, which promotes the proliferation and differentiation of the neurophitelial cells in rats. Our group has observed that DDR1 is significantly expressed in the white matter and particularly in oligodendrocytes during pre- and postnatal development in mice. Furthermore, the expression of this receptor follows a spatial-temporal pattern similar to the process of myelination.In this doctoral thesis we have made the first detailed study of the pattern of gene and protein expression of DDR1 in human brain, using specific techniques such as in situ hybridization, immunohistochemistry and quantification of RNAm. We found a positive association of DDR1 with schizophrenia in a case-control association study using markers of the SNP (single nucleotide polymorphism) type.We have also reported for the first time that DDR1 is a myelin protein in the human brain and that of the five different isoforms that are known only isoforms DDR1c and DDR1a are related to the myelin.The following scientific articles have been written as a result of this doctoral thesis:- Roig B, Virgos C, Franco N, Martorell L, Valero J, Costas J, Carracedo A, Labad A, Vilella E. The discoidin domain receptor 1 as a novel susceptibility gene for schizophrenia. Molecular Psychiatry. 2007. doi: 10.1038/sj.mp.4001995. IF: 11.8- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Tomàs J, Costas J, Vogel WF, Vilella E. Identification of the tyrosine kinase receptor discoidin domain 1 (DDR1) as a novel myelin protein. Submitted to Glia. IF: 4.1- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Vilella E. Quantitative analysis of DDR1 mRNA expression in normal and schizophrenic brain. Manuscript in preparation.

La trisomia del cromosoma 21 humà o síndrome de Down (SD) genera un fenotip molt complex que inclou més de 80 trets fenotípics característics. Es tracta, d'una malaltia multifactorial molt variable en la seva expressió fenotípica. Per tant, sembla evident que per poder fer front a la complexitat i variabilitat inherents a la SD, serà necessari l'ús d'estratègies metodològiques diferents. El treball realitzat en aquesta tesi doctoral mitjançant l'estudi de l'expressió diferencial en cervells fetals d'individus Down ha permès posar de manifest l'expressió alterada dels gens FABP7 i PRDX2, cap d'ells situat al cromosoma 21. Experiments d'hibridació substractiva supressora (SSH) sobre cervells fetals Down van desvetllar la subexpressió de PRDX2 als individus Down. Aquesta subexpressió es va confirmar mitjançant: i) anàlisi de transferència Northern (5 disòmics i 5 trisòmics) i ii) RT-PCR quantitativa a temps real (6 disòmics i 7 trisòmics), amb uns valors de 0.7 i 0.73 vegades, respectivament.Per avaluar els efectes de la subexpressió de PRDX2 a nivell cel.lular es van transfectar de manera estable cèl.lules de neuroblastoma (SH-SY5Y) amb cDNA antisentit de PRDX2. D'acord amb la funció antioxidant de PRDX2 es va analitzar la viabilitat cel.lular i els nivells d'apoptosi, tant en condicions estàndards, com en presència de diferents agents citotòxics (peròxid d'hidrogen, etoposide i timerosal). Per tal d'aconseguir una sobreexpressió de SOD1 es va transfectar cèl.lules SH-SY5Y amb cDNA sentit de SOD1. La inclusió de SOD1 com a control en aquesta aproximació es deu a que els individus Down presenten, com a resultat de la trisomia del cromosoma 21, una sobreexpressió d'aquest gen. Les mesures de viabilitat cel.lular sobre les dues línies transfectades demostren un descens en condicions basals, així com en presència de peròxid d'hidrogen, però no en presència d'etoposide. D'altra banda, el timerosal sembla afectar més la viabilitat dels clons que subexpressen PRDX2. Els resultats mesurant els nivells d'apoptosi sobre ambdues línies transfectades indiquen un increment en els nivells d'apoptosi via caspasa-3 en condicions basals i un menor increment, respecte al comportament control, en presència d'H2O2. Donat que en els experiments de viabilitat cel.lular no s'observa aquest "efecte protector", es dedueix que la subexpressió de PRDX2, o la sobreexpressió de SOD1, en presència d'H2O2, indueixen, majoritàriament, una mort cel.lular independent de la caspasa-3.En conjunt, tots aquests resultats apunten cap a una possible implicació de PRDX2 en l'estrés oxidatiu neuronal associat a la SD.Mitjançant l'anàlisi SSH, es va detectar també la sobreexpressió de FABP7 en cervells fetals d'individus Down. Aquesta sobreexpressió es va confirmar mitjançant anàlisi de transferència Northern (5 disòmics i 5 trisòmics) i RT-PCR quantitativa a temps real (7 disòmics i 9 trisòmics), amb un valors d'1.3 i 1.63 vegades, respectivament.Per determinar la relació entre la trisomia del cromosoma 21 i la sobreexpressió de FABP7 es va aïllar i clonar, la regió promotora de FABP7. La seqüenciació d'aquesta regió va confirmar la conservació d'un domini d'unió dels factors Pbx/POU descrit prèviament a ratolins. Les proteïnes PBX formen complexes amb altres homeobox, com és el cas de PKNOX1, que mapa a 21q22.3. Mitjançant RT-PCR quantitativa a temps real es va confirmar la sobreexpressió de PKNOX1 en cervells fetals humans (1.8 vegades més). Experiments d'electroforesi de retardament de bandes (EMSA) van demostrar la unió de la proteïna PKNOX1 a la seqüència promotora de FABP7. Finalment, els experiments d'assaig luciferasa sobre cèl.lules en cultiu de neuroblastoma revelaren una transactivació de FABP7 deguda a la sobreexpressió de PKNOX1. Els nostres resultats indiquen clarament que la sobreexpressió de FABP7 en individus Down és, molt probablement, causada per la sobreexpressió de PKNOX1, degut a l'efecte de dosi gènica associat a la trisomia del cromosoma 21.

Les distròfies retinianes son patologies de la visió causades per defectes a la retina, un teixit que es troba formant part de l'ull i que s'encarrega de convertir en senyals elèctriques la constant entrada d'energia lluminosa que contínuament capten els nostres ulls. El senyal elèctric generat és enviat posteriorment al cervell, i aquest s'encarrega de traduir-lo a una imatge amb colors, formes i volums. Les cèl.lules afectades en aquestes patologies son concretament les cèl.lules fotoreceptores i l'epiteli pigmentari d'aquesta retina, que a més de facilitar factors tròfics crítics pel manteniment d'aquests fotoreceptors, participa en la renovació constant de fragments d'aquestes cèl.lules, a més d'intervenir en el reciclatge de proteïnes dins el fotoreceptor. Les patologies de la retina les podem dividir en maculars, si és la regió central de l'ull la inicialment afectada en aquestes patologies, o per contra, si la part inicialment afectada és la retina més perifèrica, podem parlar de patologies d'inici perifèric. El gen ABCA4 és el gen que codifica per una proteïna anomenada ABCR que transporta substrats a través de membranes amb despesa d'ATP dins les cèl.lules fotoreceptores. Aquest gen s'ha trobat mutat tant en pacients afectats de patologies maculars com són la malaltia de Stargardt, el Fundus flavimaculatus, la distròfia de cons i bastons, i fins i tot ha estat considerat un factor genètic que podria predisposar a desenvolupar la degeneració macular associada a l'edat en edats avançades de la vida; com en pacients afectats de patologies que s'inicien amb defectes a la retina més perifèrica com ha estat la Retinosis pigmentaria. L'anàlisi del gen ABCA4 en diferents pacients afectats de diferents patologies de la retina ens ha permès observar un nombre considerable de variants patogèniques en aquest gen i ens ha portat a proposar un model de correlacions genotip-fenotip per ABCA4 . En aquest model la severitat de les diferents patologies causades per defectes en aquest gen pot ser explicada per la diferent severitat de mutacions en ABCA4 , o el què és el mateix la quantitat d'activitat residual de la proteïna ABCR. A més, hem pogut ampliar el model amb una nova entitat clínica, la distròfia macular en patró de l'epiteli pigmentari, que és una distròfia retiniana més lleu que la malaltia de Stargardt, i que podria ser explicada per mutacions de tipus lleu en aquest gen. Aquestes dades han demostrat l'heterogeneïtat al.lèlica d' ABCA4 . També s'ha pogut ampliar l'heterogeneïtat genètica descrita per la Retinosis pigmentaria, mitjançant l'anàlisi de diferents gens i loci vinculats a casos recessius d'aquesta patologia. Una vegada més s'ha pogut observar que l'heterogeneïtat genètica descrita en aquesta patologia es pot explicar pel gran nombre de gens descrits com a responsables d'un o uns pocs casos de la Retinosis, on actualment amb els gens coneguts només s'ha pogut explicar com a màxim un 50% dels casos clínics descrits.

Els animals estan agrupats en grans grups o files. Aquestes agrupacions representen organismes que presenten característiques que els hi són pròpies i diferents a les que presenten altres organismes. Aquest treball es centra en l'estudi dels cordats; format pels subfiles dels urocordats, els cefalocordats i els vertebrats. Els elements transposables són un conjunt molt heterogeni de seqüències que es caracteritzen per la seva capacitat de moure's al llarg d'un genoma i per la presència en múltiples còpies per genoma. Aquests elements, a conseqüència de les característiques que els hi són pròpies poden produir efectes deleteris en el genoma que els allotja tot i que si es troben regulats per mecanismes de control de l'hoste poden arribar a ser beneficiosos ja que n'augmenten el potencial evolutiu. Els estudis d'aquests elements en els cordats gnatostomats com l'home han evidenciat la seva massiva presència. Ja que aquests elements deuen haver condicionat l'evolució dels genomes dels gnatostomats, en aquest treball es va voler establir la participació dels elements transposables de tipus non-LTR en els organismes que es troben en la transició dels cordats pre-vertebrats cap als vertebrats. Així, utilitzant aproximacions in vitro i in silico s'ha determinat el tipus i nombre d'aquests elements en els genomes de l'ascidi Ciona intestinalis, el cefalocordat Branchiostoma floridae i l'àgnat Myxine glutinosa. Les diferents metodologies ens han permès determinar clarament l'estructura de 5 retrotransposons non-LTR en el genoma de l'ascidi, 6 en el de l'amfiox i 1 en el de la mixina. Els baixos números de còpies observats (<200 còpies/genoma haploid) en l'ascidi i l'amfiox mostren com la gran explosió d'aquests elements es va produir en els vertebrats ja que el vertebrat basal M. glutinosa ja presenta valors significativament elevats (~50000 còpies per genoma haploid). A més l'absència de metilació del elements de l'ascidi i l'amfiox però no en la mixina suggereix que la utilització d'aquest marcador epigenètic de l'expressió gènica hauria estat una coopció exclusiva dels vertebrats i no pas de tots els cordats. Per altra banda, evidències indirectes de l'activitat d'aquests elements suggeririen que aquests elements podrien ser actius en tots els genomes que s'han analitzat en aquest treball. / The animal kingdom is divided in huge groups of animals or phyla. These groups represent animals which share some particular traits that make them distinguishable from other animals. This work is based on the study of the chordates, which include the urochordate, cephalochordate and vertebrate subphyla. The transposable elements are an heterogeneous array of sequences characterized by their capacity of self mobilization along the host genome and to be present in multiple copies. These elements, as a consequence of their characteristics, could be deleterious to the host but the presence of control mechanisms by the host or the element itself might allow a beneficial relationship as these elements increase the evolbability of the genome. The studies of transposable elements in gnathostomate vertebrates, as humans, have revealed their massive presence on the host genome. As these elements should have participated in the evolution of gnathostomate subphylum, this work has tried to elucidate the role of non-LTR retrotransposons in the evolution of the organisms that appeared during the transition from the prevertebrate chordates to the vertebrates. Using in vitro and in silico approaches, we have determined the kind and number of these elements in the genome of an ascidian (Ciona intestinalis), the cephalochordate amphioxus (Branchiostoma floridae) and the agnathan hagfish (Myxine glutinosa). These approaches allowed us to clearly determine the structure of 5 non-LTR retrotransposon in the ascidian genome, 6 in amphioxus and 1 in hagfish. The low copy number observed for these elements in the genomes of the ascidian and amphioxus (less than 200 copies per haploid genome) clearly shows that the great increase of these elements occurred in the vertebrates, because the hagfish shows a number of copies similar to those in other fishes (~50000 copies per haploid genome). In addition, the absence of methylation in the non-LTR retrotransposons of the ascidian and amphioxus, but not in hagfish, suggests that the use of this epigenetic marker should be coopted in the vertebrate lineage. Even more, indirect results point to the presence of active elements in the host genome of the three studied subphyla.