Las filogenias que incorporan información procedente de distintos loci del genoma son fundamentales para resolver las relaciones evolutivas de los seres vivos, así como para determinar con precisión los tiempos de divergencia de las distintas especies y poblaciones y estudiar fenómenos como el flujo genético. En primer lugar, se analizaron los genomas completos de las bases de datos públicas de varias especies de mamíferos y se extrajeron todos los intrones. A continuación se desarrollaron una serie de filtros computacionales automatizados para seleccionar los intrones más adecuados para ser empleados en la filogenia de especies cercanas de mamíferos de acuerdo a criterios de tamaño, copia única, reloj molecular y divergencia, obteniéndose un total de 224 nuevos marcadores intrónicos. Se amplificaron varios de estos marcadores en varias parejas de especies cercanas de mamíferos, confirmando que eran efectivamente variables interespecíficamente, y también intraespecíficamente A continuación, se emplearon 8 de estos intrones junto con marcadores mitocondriales para realizar el primer estudio filogeográfico del desmán ibérico (Galemys pyrenaicus), un mamífero endémico semiacuático de la Península Ibérica. Se obtuvieron muestras de excrementos y tejidos de toda la distribución de la especie, y las secuencias mitocondriales obtenidas revelaron una fuerte estructura filogeográfica con cuatro linajes de distribución parapátrica entre los que no se observó prácticamente flujo genético (si bien los datos nucleares sugirieron cierta presencia de flujo genético en algunas de las zonas de contacto). Los niveles de diversidad genética calculados para G. pyrenaicus fueron muy bajos comparados con la media de los mamíferos, y se observaron importantes diferencias entre los distintos clados mitocondriales, hallándose la mayor diversidad en la zona noroeste de la Península Ibérica (lo que indicaría la presencia de un refugio glacial en esta área) y la menor en los Pirineos (que serían producto de una rápida colonización postglacial). Este escenario se vio corroborado por la elaboración de un modelo de distribución de la especie y la posterior proyección a las condiciones del Último Máximo Glacial, que indicó que la zona de mayor probabilidad de presencia asociada era el Noroeste de la Península Ibérica. Por último, se realizó un estudio de los tiempos de especiación y divergencia de los musgaños europeos del género Neomys empleando metodologías que estiman el árbol de especies incorporando predicciones de la teoría de la coalescencia. Para ello se emplearon 13 intrones del conjunto desarrollado anteriormente, y se halló una notable divergencia entre dos subespecies de Neomys anomalus (N. a. anomalus y N. a. milleri). La estima del árbol de especies permitió datar esta divergencia en medio millón de años, y la aplicación de un modelo de aislamiento con divergencia permitió detectar que no se había producido flujo genético significativo entre ambas. Esto sugiere que la actual clasificación taxonómica no refleja de forma correcta la realidad biológica de estos organismos. La comparación de distintas estrategias en las estimas de árboles de especies y tiempos de divergencia reveló el riesgo asociado a no emplear tasas evolutivas específicas de los organismos y de los marcadores empleados en este tipo de estudios. / Initially, several publicly available genome sequences of mammalian species were analysed and all the introns were extracted. A bioinformatic pipeline was then developed to control for orthology and to filter them following several criteria: that they had an adequate size and molecular clock, they were divergent and single copy. The final result was a new set of 224 introns to be used in closely related species mammalian phylogenetics. Then 8 of these introns, along with mitochondrial markers, were used to perform a phylogeographic study of the Iberian Desman, that is an endangered semiaquatic mammal endemic to the Iberian Peninsula. A strong phylogeographic structure with several mitochondrial lineages with no mixing was revealed, although nuclear DNA data suggest some degree of mixing in some of the contact zones. A low overall genetic diversity for the whole species was found but there were also striking differences between the clades, with the diversity being higher in the Northwestern part of the Peninsula (thus being a potential glacial refugium) and lower in the Pyrenees (which would be the result of a recent colonization). The dating of the origin of all the desman mitochondrial haplotypes to the Middle Pleistocene and the projection of a species distribution model to the conditions of the Last Glacial Maximum also support this scenario, thus highlighting the importance of the Pleistocene glacial cycles in shaping the current genetic structure of this species. Finally, 13 introns were used to obtain the species tree of the genus of European water shrews Neomys using a multilocus coalescent approach. The divergence of two subespecies of Neomys anomalus was estimated at about 0.5 million years ago, and no significant gene flow was detected since their divergence, which suggests that their current taxonomic status might not reflect the biological reality of these taxa. A series of tests to measure the effects of different ways of estimating the rates of the partitions used on the estimation of divergence in species trees were performed. These tests highlighted the importance of using lineage and marker specific estimated rates.

Tesi realitzada a l'Institut de Medicina Predictiva i Personalitzada del Càncer (IMPPC) / In the era of “omics” data, the use of computational approaches to store, integrate and analyze biological information is becoming a priority, particularly in the field of biomedicine and the study of diseases. Bioinformatics methods have been successfully applied to numerous problems derived from this data explosion, such as the integration of experimentally-derived raw data with other sources of biological information in order to analyze it, the identification of features specific for biologically relevant sets of genes (such as those related to disease) or the prioritization of long lists of genes and mutations potentially associated to different phenotypes. In this thesis we will develop a new relational database of genes and mutations associated to disorders where annotations will be mapped to ontologies. By doing so, we will overcome some limitations of existing databases, such as their lack of normalization of annotations. This will provide us an optimal framework to investigate the use of ontologies and enrichment analysis to identify disease-specific mutation features that, hopefully, will help us in understanding some aspects of the underlying molecular biology of these diseases. Finally, we will explore whether networks derived from different types are better are predicting different diseases. Moreover, we will also test several combinations of these networks in order to see if they perform better than the networks alone. / La generación masiva de datos provocada por el incremento en el uso de tecnologías de alcance genómico hace que las técnicas de análisis de datos bioinformáticos sean más necesarias que nunca. En el campo de la identificación de genes y mutaciones asociados a enfermedad, hay dos grupos de técnicas que se están convirtiendo en muy populares para la priorización de listas de genes y mutaciones candidatos: el análisis de enriquecimiento y el uso de redes biológicas. En esta tesis hemos evaluado el uso de estas técnicas para (I) identificar propiedades biológicas que asociadas a mutaciones específicas de ciertas enfermedades y (II) el uso de distintas redes de información biológica y diferentes algoritmos de la teoría de redes para priorizar genes asociados a 5 tipos de enfermedades distintas. Para ello hemos creado una base de datos relacional con información sobre genes y mutaciones asociados a enfermedades y las propiedades biológicas que se alteran en las enfermedades. Todas las anotaciones han sido hechas con ontologías o vocavularios controlados. El análisis de enriquecimiento nos ha permitido identificar propiedades enriquecidas o deplecionadas en mutaciones asociadas a distintas enfermedades. Entre ellas destacan el empobrecimiento en mutaciones asociadas a cáncer en puentes disulfuro, péptidos señal y dominios transmembrana, o el enriquecimiento de mutaciones de cáncer en regions intrínsecamente desesctruturadas, regiones de composición de sesgada y regiones ricas en serina. Nuestra hipótesis es que las propiedades empobrecidas se deben a que su mutación es deleterea para la célula tumoral. Ello se debe a que las células tumorales tienen preactivada una via que puede llevar a apoptosis, la via de respuesta a proteínas malplegadas. La mutación en puentes disulfuro, dominios transmembrana o péptidos señal provoca una acumulación de proteínas en el retículo endoplásmico y una sobractivación de dicha via, provocando la apoptosis de la célula. Por otro lado, creemos que las propiedades enriquecidas en mutaciones de cáncer lo son porqué permiten alterar interacciones proteína-proteína y alterar el proteoma, una propiedad que se ha asociado con propiedades tumorales. En cuanto al uso de redes biológicas para predecir nuevos genes asociados a distintas enfermedades, hemos usado 5 algoritmos distintos, 4 redes con asociaciones derivadas de distintos tipos de información biológica para predecir genes asociados a 5 enfermedades distintas. Los 5 algoritmos usados son: el contaje de vecinos hasta distancias 1, 2 y 3 (DN1, DN y DN3), el Diffusion Kernel (DK) y el caminador aleatorio (RWR). Los 2 últimos pertenecen a un grupo de algoritmos llamados "algoritmos de difusión" y, según publicaciones previas, tienen una mayor capacidad de predicción que los 3 primeros (las variantes del contaje de vecinos). No obstante, según nuestros resultados, esta superioridad no es generalizable y depende en gran medida del tipo de red usada y la enfermedad predecida. Las 4 redes que hemos empleado representan proteínas conectadas por distintos tipos de relaciones: interacciones físicas (que hemos obtenido de HPRD), paralogía (de ENSEMBL), pertenencia a la misma via de señalización o coexpresión en tejido humano sano. El tipo de red más usado con el fin de predecir genes asociados a enfermedad es aquella derivada de datos de interacción, no obstante, nuestros datos demuestran que los otros 3 tipos de redes pueden funcionar tan bien o incluso mejor que ésta para este fin. A continuación hemos tratado de combinar las redes de distinta forma con el fin de mejorar su poder de predicción. Para ello hemos usado distintos algoritmos que pueden ser clasificados en dos grupos en función del momento de combinación de la información: "a priori" (aquellos métodos que combinan las puntuaciones obtenidas para cada gen en las redes independientes, en nuestro caso un clasificador Bayesiano) y "a posteriori" (la combinación de la información se hace antes de usar el algoritmo de redes, en nuestro caso hemos sumado los nodos y las aristas de las redes). De acuerdo a nuestros datos es mejor usar métodos "a priori", ya que el clasificador Bayesiano siempre tiene un menor poder predictivo que la suma de redes. Además, parece que es muy complicado obtener una suma de redes que funcione mejor, en términos de AUC, que la mejor red independiente, ya que sólo para una de las enfermedades, diabetes, hemos encontrado una combinación de redes que cumpliera con estos requisitos. También hemos observado que no existe una correlación entre el número de tipos de información biológica usados para crear la combinación de redes y su capacidad de predicción. Finalmente, hemos comprobado el poder predictivo de una de las mejores combinaciones de redes en un set de datos independiente que hemos obtenido de COSMIC. Este set de datos contiene genes mutados en, al menos, 15 muestras de cáncer colorectal y que no están presentes en nuestra base de datos. Hemos podido predecir estos genes tanto en términos de AUC como en términos de enriquecimiento de "ranking".

La mucopolisacaridosi l, la mucopolisacaridosi II i la leucodistròfia metacromàtica sòn tres malalties Iisosòmiques hereditàries. Totes tres són degudes al defecte funcional d'un enzim Iisosòmic que és incapaç de degradar les macromolècules procedents del recanvi cel•lular. Aquests substrats a mig degradar s'acumulen a les cèl.lules i són els causants del deteriorament i empitjorament de la clínica de forma progressiva. Els pacients amb aquestes malalites presenten un curs fatal, amb quadre degeneratiu progressiu sever i, en alguns casos, dismòrfies, alteracions òssies diverses, afectació ocular i organomegàlies. La mucopolisacaridosi I o malaltia de HurlerlScheie (MPS I; MIM 252800) és una malaltia hereditària d'acumulació lisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim alfa-L-iduronidasa. Aquest enzim participa en la degradació dels glucosaminoglicans heparan sulfat i dermatan sulfat. És una malaltia autosòmica recessiva. Els pacients amb MPS I presenten hepatoesplenomegàlia, deformitats esquelètiques, trets facials toscos, rigidesa d'articulacions, retard mental, sordesa i opacitat cornial. Es classifiquen els pacients en tres formes segons d'edat d'aparició dels símptomes: Forma severa o Hurler, forma íntermèdia o HurlerlScheíe i forma lleu o Scheíe. El gen que codifica per l'alfa-L-iduronidasa (IOUA; EC 3.2.1.76) està localitzat al locus 4p16.3, ocupa 16 kb, té 14 exons i un trànscrit de 2.7 kb que codifica per una proteïna de 653 aminoàcids. Fins a l'actualitat s'han descrit una quarantena de mutacions diferents al gen IOUA i algunes d'elles s'han vist amb certa freqüència. També s'han identificat una trentena de polimorfismes al gen IOUA. S'han estudiat 27 pacients espanyols amb MPS I; dels 54 al.lels estudiats, en 32 (un 59.3%) s'ha Identificat la mutació W402X, en 5 al.lels (9.3%) s'ha identificat la mutació P533R i en 4 (7.4%) la mutació Q70X. Així doncs, amb l'estudi d'aquestes tres mutacions es cobreix un 76% dels al.lels de la malaltia i un 63% dels genotips, el que fa recomanable començar l'estudi de nous pacients analitzant aquestes tres mutacions. Així mateix, ja anteriorment s'havia descrit que aquestes mutacions estaven associades a la forma severa de la malaltia, i els resultats en pacients espanyols reforcen aquestes observacions. La mucopolisacaridosi II o malaltia de Hunter (MPS II; MIM 309900) és una malaltia hereditària d'acumulació Iisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim iduronat-2-sulfatasa. Aquest enzim participa també en la degradació dels glucosaminoglicans heparan sulfat i dermatan sulfat. És una malaltia recessiva lligada al cromosoma X. Els pacients amb MPS II presenten una clínica molt similar a la que presenten els pacients amb MPS I, amb l'excepciò que els pacients Hunter no acostumen a presentar opacitat cornial. Es classifiquen els pacients en tres formes segons l'afectació neurològica: Forma severa, forma intermèdia i forma lleu. El gen que codifica per l'iduronat-2-sulfatasa (lOS; EC 3.1.6.13) està localitzat al locus Xq28, ocupa 24 kb, té 9 exons i un trànscrit de 2.3 kb que codifica per una proteïna de 550 aminoàcids. Respecte les mutacions descrites al gen lOS, s'ha vist que entre un 15 i un 20% dels pacients presenten grans delecions o reordenaments del gen, respecte les mutacions puntuals fins a l'actualitat se n'han descrit unes dues-centes de diferents. Gairebé totes sòn de caràcter particular, o sigui que cada família presenta una mutació diferent. Els exons que presenten major nombre de mutacions són l'exó III, V, VIII i IX. S'han estudiat 36 pacients espanyols amb MPS II,4 d'ells (11.1%) presenten una deleció total, parcial o un reordenament del gen, els 32 restants presenten 26 mutacions puntuals diferents, 21 de les quals han estat descrites per primera vegada. Totes les mutacions puntuals s'han identificat en una sola família a excepció de les mutacions G374G i R443X que s'han identificat en tres pacients cada una, i la R468Q que s'ha identificat en dos pacients. Això mostra que en aquesta malaltia existeix una gran heterogeneïtat al•lèlica. Els exons que presenten més mutacions als pacients espanyols són el VIII i el IX. L'existència d'aquesta gran heterogeneïtat genètica en aquesta malaltia dificulta el poder establir una correlació genotip-fenotip, sols els pacients que presenten grans delecions o reordenaments del gen s'ha vist que presenten sempre la forma severa de la malaltia. El fet que cada pacient í cada família presenti una mutació diferent fa difícil el poder establir una estratègia de recerca de mutacions, ja que cada nou cas comporta l'estudi del gen sencer, és per això que es considera que una bona estratègia de cara al diagnòstic de les familiars femenines dels nous pacients és l'estudi indirecte per marcadors polimòrfics intra i/o extragènics propers al gen. La leucodistròfia metacromàtica (LOM; MIM 250100) és una malaltia hereditària d'acumulació lisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim arilsulfatasa A que afecta el metabolisme de la mielina. Aquest enzim participa en la degradació dels sulfolipids gaiactosil sulfat (o cerebròsid sulfat) i lactosil sulfat. La seva deficiència provoca l'acumulació en la substància blanca del sistema nerviós central i als nervis perifèrics d'aquests substrats a mig degradar i són els causants del deteriorament i empitjorament de la clínica de forma progressiva. És una malaltia autosòmica recessiva. Els pacients amb LDM presenten desmielinització progressiva, atrófia óptica, demència i moren en estat decerebrat. Els pacients es classifiquen en tres formes segons l'edat d'aparició dels slmptomes: Forma infantil, forma juvenil i forma adulta. El gen que codifica per l'arilsulfatasa A (ARSA; EC 3.1.6.8) està localitzat al locus 22q13.31-qter, ocupa 3.2Kb, té 8 exons i un trànscrit de 2.1Kb que codifica per una proteïna de 507 aminoàcids. Fins a l'actualitat s'han descrit unes setenta mutacions diferents al gen ARSA, algunes d'elles amb certa freqüència a diferents poblacions i tambè s'han identificat nou polimorfismes diferents. S'han estudiat 20 pacients espanyols amb LDM i s'han identificat 18 mutacions diferents en els 40 al.lels analitzats, de les quals 12 són mutacions descrites per primera vegada. Aixl mateix s'han identificat tres nous polimorfismes. De les 18 mutacions identificades, tres d'elles s'han trobat amb certa freqüència en la Nostra població. Aquest és el cas de la mutació IVS2+1G -> A que s'ha identificat en 10 dels 40 al.lels (25%), la mutació D255H que s'ha identificat en 7 dels al.lels (17.5%) i la mutació nova T3271 que s'ha identificat en 4 al.lels més (10%). Aixi, amb l'estudi d'aquestes tres mutacions es cobreix un 52.5% dels al.lels LDM. Aixi mateix s'ha pogut veure per estudi d'haplotips que aquestes mutacions freqüents estan cada una d'elles en desequilibri de lligament amb un determinat haplotip, el que indicaria un possible origen únic per cada d'aquestes mutacions. Anteriorment s'havia observat que la mutació IVS2+1 G -> A estava associada a la forma infantil de la malaltia, els resultats en pacients espanyols recolzen aquesta observació i, d'altra banda, és la primera vegada que s'estableix la correlació entre la mutació D255H i la forma infantil de la malaltia. També s'ha pogut observar que existeix una correlació clara entre l'activitat enzimàtica i ia clinica dels pacients. Aixi doncs, en aquesta malaltia, ès recomanable iniciar l'estudi dels nous pacients analitzant les tres mutacions freqüents IVS2+1G-> A, D255H i T3271. / Mucopolysaccharidosis I (MPS I, M/M 252800), mucopo/ysaccharidosis II (MPS II, MIM 309900) and metachromatic leukodystrophy (MLD, M/M 250100) are three hereditary Iysosomal storage diseases due to the deficiency of a Iysosomal enzyme. We have studied the genes codifying the defective enzymes in the Spanish patients. MPS / is an autosomal recessive disease. We studied 27 patients. We identified mutation W402X in 59.3% of MPS I alleles, mutation P533R in 9.3% and mutation Q70X in 7.4%. We cover 76% of the alleles and 63% of the genotypes with the analysis of these three mutations. Correlation between these three mutations and the severe form of the disease seen in the Spanish patients agrees with previous results in other populations. MPS II is an X-Iinked recessive disease. We studied 36 patients. Four patients had a total or partial deletion or a rearrangement of the gene. These gene alterations are related with the severe form of the disease. The rest of the patients presented with a particular point mutation, showing the existence of a high genetic heterogeneity in this disease. Such heterogeneity would difficult the routine molecular diagnosis, although it remains as the best issue for detection. MLD is an autosomal recessive disease. We studied 20 patients. Mutation IVS2+1G -> A was identified in 25% of the alleles. This change is associated with the late-infantile form of the disease. Mutation D255H was identified in 17.5% of the alleles and for the first time we have established a c1ear correlation between this mutation and MLD severe forms. The newly identified mutation T3271 was found in 10% of the alleles. Analysis of these three mutations allows to cover 52.5% of the mutated alleles. Haplotype analyses showed that these three frequent mutations might have a unique origin.

En el presente trabajo investigamos algunos de los mecanismos endocrinos implicados en el crecimiento oocitario del lenguado senegalés (Solea senegalensis), así como el desarrollo de métodos para el control de su reproducción en cautividad. La tesis se dividió en tres partes diferentes:(i) Capítulo 1: Introducción General donde se resume el estado actual de conocimientos sobre los mecanismos endocrinos implicados en la reproducción de teleósteos, y se introduce al lector en los beneficios y problemas actuales de la acuicultura de peces planos, especialmente del lenguado senegalés (Solea senegalensis);(ii) Capítulos 2 y 3, donde se investiga el proceso de vitelogénesis en el lenguado senegalés. En el Capítulo 2, se caracteriza el ADN complementario de ambas isoformas del receptor de lipoproteínas de muy baja densidad/vitelogenina (Vtg), vtgr, y de una nueva proteína de unión a ácidos grasos (FABP), FABP11, encontrada exclusivamente en peces teleósteos. El análisis de expresión de estos genes en ovario de lenguado senegalés, sugiere que el nivel de los transcritos de vtgr puede ser utilizado como marcador molecular para determinar el número de oocitos reclutados en vitelogénesis, mientras que los niveles de expresión de fabp11 pueden funcionar como un marcador molecular muy útil para determinar los procesos celulares y factores ambientales que regulan el proceso de la atresia folicular. En el Capítulo 3, se valida un ELISA homologo para determinar la concentración de Vtg en plasma. Mediante este análisis se correlacionan las variaciones anuales de Vtg con los niveles de 17-estradiol, índice gonadosomático y porcentaje de oocitos en diferente estadio de desarrollo oocitario; y(iii) Capítulos 4 y 5, donde se investiga la aplicación de diferentes métodos hormonales para inducir a la ovulación y a la espermiación en lenguado senegalés en condiciones de cautividad. En el Capítulo 4, se tratan machos y hembras con un agonista de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHa), tanto mediante inyecciones sucesivas como mediante implantes de liberación sostenida. El tratamiento con GnRHa resulta eficaz para inducir la ovulación y la puesta en hembras F1 incapaces de reproducirse en cautividad. En cambio, el mismo tratamiento con GnRHa en machos es aparentemente ineficaz para aumentar la producción de esperma y/o estimular la espermatogénesis. En el Capítulo 5, el tratamiento de machos adultos con GnRHa en combinación con 11-ketoandrostenediona (OA), precursor de 11-ketotestosterona (11-KT), acelera la espermatogénesis y aumenta los niveles plasmáticos de los metabolitos 5β-reducidos de 17α,20β-dihidroxi-4-pregnan-3-ona (17,20βP), esteroide implicado en la maduración del esperma en salmónidos. Además, la motilidad del esperma producido por los machos tratados con GnRHa+OA, se ve duplicada respecto al esperma producido por el grupo control o el grupo tratado sólo con GnRHa. Por tanto, el tratamiento de machos de lenguado senegalés con GnRHa+OA puede ser empleado como potencial terapia hormonal para mejorar disfunciones reproductivas de machos de lenguado senegalés en condiciones de cautividad.En resumen, la presente tesis ha contribuido a profundizar en el conocimiento de los mecanismos endocrinos implicados en la gametogénesis del lenguado senegalés, y ha establecido algunos protocolos para la inducción de la ovulación y la espermiogénesis a través de terapias hormonales en esta especie de elevado interés comercial. / The present work was aimed at the investigation of some endocrine mechanisms involved in oocyte growth in the Senegalese sole (Solea senegalensis), as well as to develop methods for the control of reproduction of this species in captivity. The thesis was divided into three separate parts:(i) Chapter 1, a General Introduction where it was reviewed the endocrine regulation of reproduction in teleosts, and it introduced the reader into the significance and current problems in the culture of flatfish, particularly the Senegalese sole;(ii) Chapters 2 and 3, in which it was investigated the vitellogenic process of Senegalese sole. In chapter 2, it is described the isolation of complementary DNAs encoding two isoforms of very low-density lipoprotein/vitellogenin receptor (VtgR) and a novel fatty acid-binding protein (FABP), FAB11. The analysis of expression of these genes suggested that the the level of vtgr transcripts in the ovary may be used as a functional marker to quantify the number of oocytes recruited for vitellogenesis, while that of fabp11 may be a very useful molecular marker for determining cellular events and environmental factors that regulate follicular atresia. In chapter 3, an homologous EIA to quantify plasma vitellogenin was developed, and annual plasma levels of vitellogenin were correlated with changes in plasma 17-estradiol, gonadosomatic index, and percentage of oocyte at different developmental stage in the ovary; and(iii) Chapters 4 and 5, in which it was investigated the induction of ovulation and spermiation in Senegalese sole. In chapter 4, males and females were treated with gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa). Treatment was able to induce ovulation and spawning of F1 females that often fail to reproduce. However, this treatment was ineffective in males. Further studies were performed in chapter 5, where GnRHa treatment in combination with a biosynthetic precursor of 11-ketotestosterone, stimulated spermatogenesis, increasing the production of conjugated forms of 17,20-dihydroxy-4-pregnen-3-one, enhancing the motility of spermatozoa by 2-fold. In conclusion, the present work has contributed with novel information on the endocrine mechanisms involved in gametogenesis in Senegalese sole, and has established some protocols for the induction of ovulation and spermiation in this species through hormonal therapies.

A stereotyped tubular epithelial network forms many of our bodies’ organs and, defects in the formation of these tubules often leads to organ failure. My Thesis project aims to further understand the mechanisms underling the formation of tubular networks using the tracheal system of Drosophila melanogaster as a model system. Tramtrack (Ttk) is a widely expressed transcription factor (TF) whose function has been analysed in different adult and embryonic tissues in Drosophila. Interestingly, previous work from our lab showed Ttk as a key tracheal regulator. Ttk is involved in a wide range of developmental decisions, ranging from early embryonic patterning to differentiation processes in organogenesis (Araújo et al., 2007). Given the wide spectrum of functions and pleiotropic effects that hinder a comprehensive characterisation, many of the tissue specific functions of this transcription factor are poorly understood. We profiled gene expression experiments after Ttk loss- and gain-of-function in whole embryos and cell populations enriched for tracheal cells in order to identified some of the underlying genetic components that are responsible for the tracheal phenotypes of Ttk mutants. Our transcriptomes analysis revealed widespread changes in gene expression. Interestingly, one of the most prominent gene classes that showed significant opposing responses to loss- and gain-of-function was annotated with functions in chitin metabolism, along with additional genes that are linked to cellular responses, which are impaired in ttk mutants. The expression changes of these genes were validated by quantitative real-time PCR and further functional analysis of these candidate genes and other genes also expected to control tracheal tube size revealed at least a partial explanation of Ttk’s role in tube size regulation (Rotstein et al., 2011). In addition, from all the target genes found in this study, we identified and selected one of them expressed in the tracheal system, CG13188, for further functional analysis. After validating CG13188 differential expression by quantitative PCR, we corroborated and refined CG13188 expression pattern by generating an anti-CG13188 antibody. This protein accumulation analysis recapitulated the predicted CG13188 mRNA expression, but also indicated that CG13188 has a dynamic sub-cellular accumulation during the development of the tracheal system. We have confirmed that CG13188 protein expression levels are, as expected, dependent on the general regulator ttk. Interestingly, we saw that ttk also controls CG13188 protein localization, as in ttk mutant embryos, CG13188 protein did not accumulate apically in the tracheal cells at late embryonic stages, as compared to wild-type. These results suggested on one hand, that CG13188 in order to perform its function might need to be transported from the cytoplasm to the apical membrane of the tracheal cells. On the other hand, the CG13188 protein accumulation differences observed could be just a consequence of CG13188 protein levels between the conditions analysed. We have also observed that CG13188 expression is also controlled by the branch specific regulator spalt. CG13188-RNAi down-regulation in the tracheal system gave tracheal morphogenesis defects during mid and late embryonic stages. In particular, we observed that from embryonic stage 15, CG13188-RNAi embryos can not accumulate chitin into the luminal space of the most dorsal and ventral tracheal branches. These experiments indicated that CG13188 gene is required to form the chitin luminal cable in a branch specific manner. Its down-regulation in the tracheal system produced also physiological maturation phenotypes at late embryonic stages, as CG13188-RNAi embryos did not gas filled completely. Together our results suggested on one hand, the possibility of coexistence of more than one ECM assembly mechanism involved in tracheal tube size control. This novel chitin organisation mechanism might be dependent on branch type. On the other hand, our results might provide a first evidence of a link between chitin cable formation and gas filling tube morphogenesis processes.

Fa aproximadament uns 20 anys del descobriment de la poli(ADP-ribosa), únic homopolímer que s'uneix de manera covalent a les proteïnes cromosòmiques. Des d'aleshores s'han fet detallats estudis de l'estructura, metabolisme, enzimologia, com també de les funcions fisiològiques relacionades amb el polímer. Nombroses evidències suggereixen que la poli(ADP-ribosa) es troba àmpliament distribuïda als eucariotes i està involucrada en la regulació de la proliferació cel·lular, síntesi de proteïnes i metabolisme dels àcids nucleics.Així mateix, també hi ha força dades que indiquen que la mono(ADP-ribosilació) és una manera comuna de modificar covalentment les proteïnes i la seva funció. L'ADP-ribosilació es l'única reacció bioquímica en la qual el NAD, un coenzim respiratori, és utilitzat com a donador de grups ADP-ribosil.La importància dels nucleòtids de piridina NAD i NADP com a coenzims de les reaccions d'oxidació-reducció cel·lulars pot observar-se fàcilment en considerar la utilització d'aquests compostos per les deshidrogenases i reductases que ocupen posicions crítiques de les vies metabòliques. El fet que el NAD sigui el més abundant dels coenzims ha suggerit que la funció d'aquest nucleòtid no es limita a les oxidacions biològiques. L'altre paper important del NAD és servir de substrat per a la modificació de les proteïnes per ADP-ribosilació.

Los discos imaginales de Drosophila melanogaster son los primordios de las estructuras cuticulares del adulto. El disco imaginal dará lugar al ala adulta, constituida por dos capas celulares continuas donde podemos diferenciar tres componentes básicos: las estructuras del margen, las venas y las regiones de intervena. El primer objetivo de esta tesis fue el estudio de una colección de mutantes generados por inserción de un elemento P-lacW en el cromosoma III de Drosophila melanogaster con la finalidad de identificar mutaciones que afectasen a la proliferación, morfogénesis y/o diferenciación de los discos imaginales y estudiar su función. De un total de 2.368 líneas mutantes se estudiaron las líneas letales en larva III/pupa y las líneas semiletales o viables. De entre todas las líneas se seleccionó la línea I(3)112411, constituyendo su estudio monográfico, el segundo objetivo de este trabajo.

La tesi doctoral "Selenoproteïnes i estrès oxidatiu a Drosophila: regulació negativa de la via Ras/MAPK i activació de l'apoptosi" està dividida en els següents apartats: 1. La Introducció tracta la temàtica de les selenoproteïnes i els radicals lliures, i presenta el mutant selD[ptuf] de Drosophila melanogaster com a model d'estudi. Les selenoproteïnes són proteïnes que es caracteritzen per la presencia de Seleni en forma de l'aminoàcid selenocisteïna (Sec). Les selenoproteïnes identificades de les quals es coneix la seva funció actuen com antioxidants protegint les cèl·lules de l'acció nociva dels radicals lliures. Els radicals lliures són la conseqüència del metabolisme aeròbic i per tant es generen constantment. Si bé en determinades situacions els radicals lliures tenen una funció fisiològica, també són nocius per la cèl·lules que han desenvolupat mecanismes de defensa entre els que destaquen les selenoproteïnes. La mutació selD[ptuf] és una mutació nul·la en un element de la ruta de biosíntesi de les selenoproteïnes. Així el mutant selD[ptuf] no té selenoproteïnes i acumula radicals lliures el que el converteix en un model perfecte per a l'estudi dels efectes de l'estrès oxidatiu durant el desenvolupament. 2. Objectius. Els objectius concrets d'aquests tesi doctoral han estat:- estudiar la relació entre les selenoproteïnes i la via de transducció del senyal Ras/MAPK- analitzar quina o quines vies apoptòtiques s'engeguen en resposta a una situació d'estrès oxidatiu- identificar selenoproteïnes concretes que poguessin explicar els fenotips observats3. L'apartat de Resultats està dividit en tres capítols:- Capítol 1: En aquest capítol es mostra com l'increment de radicals lliures causat per la mutació selD[ptuf] regula negativament la via Ras/MAPK (Morey et al., 2001 Dev Biol 238:145-156). També es demostra que el mutant és sensible a situacions d'estrès oxidatiu (Morey et al., 2003 FEBS Lett 534:111-114).- Capítol 2: En aquest capítol es mostra com l'increment de radicals lliures causat per la mutació indueix apoptosi a través de la via Dmp53/Rpr (Morey et al., enviat a J. Cell Sci)- Capítol 3: En aquest capítol es presenta la identificació dues noves selenoproteïnes: dselM i dselG (Castellano et al., 2001 EMBO Rep. 2: 697-702), les quals podrien ser les responsables dels fenotips observats .4. L'apartat de Discussió està dividit en cinc seccions cada una de les quals prosa una funció del gen selD.- La mutació selD[ptuf] genera una situació d'estrès oxidatiu.- Importància de les selenoproteïnes de Drosophila en el control de ROS- L'increment de ROS modula negativament la via Ras/MAPK- L'increment de ROS activa l'apoptosi a través de la via Dmp53/Rpr- Una visió integrada: defectes en proliferació i activació de l'apoptosi en el mutant selD[ptuf]5. Conclusions. D'aquest treball se n'extreuen les següents conclusions:- El gen selD modula la via Ras/MAPK a través de la síntesi de selenoproteïnes i la seva funció antioxidant- L'increment de radicals lliures causat per la mutació selD[ptuf] engega l'apoptosi majoritàriament a través de la via depenent de caspases Dmp53/Rpr.- A part de la selenoproteïna Sps2, Drosophila té dues altres selenoproteïnes: dselG i dselM.

Durant el desenvolupament dels organismes multicel·lulars els fenòmens de transducció de senyals estan íntimament lligats als mecanismes de comunicació cèl·lula-cèl·lula. En el marc d'un teixit epitelial, la formació i manteniment de l'arquitectura cel·lular i dels contactes que estableixen les cèl·lules són processos altament regulats. Una de les vies de senyalització més coneguda, i alhora estudiada, és la via de Ras/Raf/MAPK. L'activació d'aquesta via es dóna per lligands externs a la cèl·lula i s'interpreta per factors de membrana i citosòlics que transduiran el senyal intracel·lular cap al nucli. Aquesta via està altament conservada en tots els organismes eucariotes i s'usa reiteradament durant el desenvolupament en processos tan importants com la diferenciació cel·lular, la proliferació, l'apoptosi o la supervivència cel·lular. Per això, és indispensable entendre com es modula la via de Ras/Raf/MAPK, ja que segons la durada, magnitud i compartimentalització d'aquest senyal es pot donar una resposta cel·lular específica. Per tal d'identificar nous factors implicats en la regulació de la via Ras/Raf/MAPK es va dissenyar un screening genètic a Drosophila utilitzant com a model la determinació del fotoreceptor R7 durant el desenvolupament de l'ull. Per l'especificació d'aquest fotoreceptor es requereix de l'activació de dos receptors tirosina quinasa, Sevenless (Sev) i Epidermal growth factor receptor (Egfr). Una activació constitutiva del receptor Sev es manifesta en un increment en el nombre de fotoreceptors R7 en l'omatidi, i l'ull esdevé rugós. L'screening genètic per guany de funció en aquest fons sensibilitzat es basava en la cerca de factors que suprimissin aquest fenotip d'ull rugós i per extensió, factors que serien reguladors negatius de la via. D'entre els resultats que es van obtenir es va identificar un gen, center divider (cdi), la funció del qual està vinculada a la reorganització del citoesquelet d'actina cortical. Cdi és una serina/treonina quinasa encarregada de fosforilar per inactivar el factor despolimeritzador dels filaments d'actina, la ADF/Cofilina. En la present Tesi Doctoral s'ha estudiat el patró d'expressió i la funció del gen cdi en el desenvolupament de l'ull de Drosophila. Un guany de funció d'aquest gen és capaç de promoure un acúmul d'actina polimeritzada en el grup de cèl·lules de l'omatidi. També s'ha demostrat que tant el guany com la pèrdua de funció de cdi alteren la localització en l'eix apico-basal de factors integrals de les unions adherents i dels receptors i lligands propis de la via de Sev. A banda d'altres estudis fets en Drosophila per caracteritzar la funció de cdi i entendre el mecanisme d'acció en la regulació de la via de Sev, s'ha emprat el model de cèl·lules en cultiu de mamífers per analitzar el paper que té TESK1, l'homòleg de cdi en mamífers, en la regulació de la via Ras/Raf/MAPK. S'ha observat que TESK1 té l'habilitat d'inhibir la diferenciació neuronal de les cèl·lules PC12, i també que aquesta proteïna interacciona i modifica el perfil de l'activació de la MAPK. / "Celular Architecture and Signal Transduction:cdi/TESK1 gene as a modulator of Sevenless"How cellular behaviors such as cell-to-cell communication, epithelial organization and cell shape reorganization are coordinated during development is poorly understood. The developing Drosophila eye offers an ideal model system to study these processes. Localized actin polymerization is required to constrict the apical surface of epithelial cells of the eye imaginal disc to maintain the refined arrangement of the developing ommatidia. The identity of each photoreceptor cell within the epithelium is determined by cell-to-cell contacts involving signal transduction events. The R7 photoreceptor cell requires the activity of the Sevenless RTK to adopt a proper cell fate. We performed an EP screen for negative regulators of this inductive process, and we identified the serine/threonine kinase Center divider (cdi) as a suppressor of the phenotype caused by an activated Sevenless receptor. Cdi is homologous to the human testis-specific kinase 1 (TESK1), a member of the LIM kinases involved in cytoskeleton control through ADF/cofilin phosphorylation. We have analyzed the effects of gain- and loss-of-function of cdi and found alterations in actin organization and in the adherens junctions proteins DE-cadherin and β-catenin, as well as in Sevenless apical localization. Interference with the function of the ADF/cofilin phosphatase Slingshot (ssh), which antagonizes Cdi, also results in a suppression of signaling triggered by the Sevenless RTK. The results of this first chapter of the Thesis reveal a critical interplay between the localization of molecules involved in epithelial organization and signal transduction.In the second chapter of this Thesis we describe the role of the mammalian homolog of cdi, testis-specific kinase 1 (TESK1), in PC12 neuronal cell differentiation and fibroblast proliferation. In addition, we show data indicating that TESK1 interferes with both the magnitude and duration of the ERK activation profile.

Aquesta tesi es centra en la genètica de la migranya. La migranya comuna és un trastorn neurològic caracteritzat per episodis recurrents de mal de cap. Els criteris de la IHS (International Headache Society) subclasifiquen la malaltia en migranya amb aura (MA) i migranya sense aura (MO). L'aura són símptomes neurològics transitoris que poden acompanyar el mal de cap. Les aures més freqüents són les aures visuals, tot i que també existeixen les aures sensorials essent l'aura hemiplègica la seva forma severa. La nostra investigació es va dividir en dues areas d'acord amb la base genètica dels trastorns, d'una banda, s'ha estudiat la genètica complexa de la migranya comuna, d'altra banda s'ha estudiat una forma rara de la migranya que presenta una herència mendeliana anomenada migranya hemiplègica familiar (FHM). Per entendre més la base genètica de la migranya comuna es va utilitzar un estudi d'associació tipus cas-control amb gens candidats. Amb aquesta finalitat es van seleccionar al voltant de 550 pacients amb migranya (MA i MO) i el seu corresponent grup de control. Per tal d'analitzar la seva implicació en la susceptibilitat genètica a la migranya, es van triar gens que codifiquen per als canals de la superfamília heterogeni de potencial receptor transitori (Transient Receptor Potential- TRP) que se sap que estan implicats en les vies nociceptives. Aquesta feina ha donat lloc a una publicació (Carreño et al. SNP variants within the vanilloid TRPV1 and TRPV3 receptor genes are associated with migraine in the Spanish population. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2012). En el cas particular de les formes monogèniques de FHM es coneixen tres gens involucrats en la malatia (CACNA1A, ATP1A2 i SCN1A), les proteïnes codificades per aquests gens tenen un paper rellevant en la neurotransmissió del glutamat. L'anàlisi funcional de les mutacions que causen FHM han mostrat en última instància un augment de l'alliberament de la neurotransmissió. En el cas de mutacions al CACNA1A s'ha vist un efecte de guany de funció, a diferència de les mutacions al ATP1A2 que presenten un efecte de pèrdua de funció. En aquest treball s'ha fet un screening mutacional per identificar mutacions en pacients per seqüenciació directa. Quan les mutacions eren suficientment interessants s'han generat construccions en vectors d'expressió per subseqüents estudis funcionals en cèl·lules eucariotes. Aquesta feina ha donat lloc a tres publicacions. A la primera (Serra et al. A mutation in the first intracellular loop of CACNA1A prevents P/Q channel modulation by SNARE proteins and lowers exocytosis. Proc Natl Acad Sci. 2010) es va identificar un canvi que modula la funció del canal de CACNA1A. Aquest estudi ajuda a explicar la contribució genètica en la heterogeneïtat clínica d'una família i a entendre millor el mecanisme molecular dels canals de calci tipus P/Q. El segon (Carreño et al. Acute striatal necrosis in hemiplegic migraine with the novo CACNA1A mutation. Headache. 2011) és un informe d'un pacient que presenta una necrosi aguda stratial. Té una rellevància clínica a causa de l'aparició primerenca dels símptomes neurològics previs als atacs hemiplègics. El tercer i últim treball (Carreño et al. Screening of the ATP1A2 and CACNA1A genes in patients with hemiplegic migraine: clinical, genetic and functional studies. [work in progress]) recull l'screening mutacional al gens ATP1A2 i CACNA1A en 19 pacients amb FHM. Es van identificar 5 mutacions prèviament descrites i dues mutacions noves. / This Thesis is focused in migraine genetics, migraine is a prevalent neurological disorder characterized by recurrent episodes of headache. This research was divided in two areas according to the genetic basis of the disorders; on the one hand we studied the common migraine with a complex genetics, on the other hand we studied the rare mendelian forms of familial hemiplegic migraine (FHM). To understand more the genetic basis of the common migraine a case-control association study approach was used with candidate genes. For that purpose, around 550 patients with migraine and their corresponding control group were selected. In order to analyze their involvement in the genetic susceptibility to migraine, we chose genes encoding for channels of the heterogeneous superfamily of Transient Receptor Potential (TRP) which are known to be involved in the nociceptive pathway. In the particular case of FHM, a monogenic form of the disorder, there are three genes known to be involved in the FHM (CACNA1A, ATP1A2 and SCN1A), whose encoded proteins are playing a relevant role in the neurotransmission of the glutamate. Functional analysis of the mutations causing FHM have shown ultimately an increased neurotransmission release. CACNA1A previous studies reveled a gain-of-function effect from FHM mutations, unlike mutations on ATP1A2 that present a loss-of-function effect. Our work consisted on identifying mutations in patients by direct sequencing. If the mutations were interesting enough vector constructions were generated for functional studies in eukaryotic cells. This work gave rise to three publications: First; the identification of a change that modulates the function of the CACNA1A channel. This study contributes to explain the genetic contribution in the clinical heterogeneity of one family and to know more about the molecular mechanism of the P/Q calcium channel. Second; a report of a patient that presents an acute stratial necrosis that had clinical relevance because of the early onset of the neurological symptoms previous to the hemiplegic attacks. Third; a mutational screening of ATP1A2 and CACNA1A genes in 19 patients with FHM. 5 previously described mutations and two new mutations were found. Functional studies were carried out for the newly mutations.