Spelling suggestions: "subject:"evolución"" "subject:"l'evolució""
41 |
Validació de l’anàlisi citogenètica exhaustiva de tot el complement cromosòmic en cèl·lula única: Aplicació translacional al Diagnòstic Genètic Preimplantacional per factor masculíRamos Masdeu, Laia 16 December 2013 (has links)
El Diagnòstic Genètic Preimplantacional (DGP) permet realitzar el diagnòstic d’alteracions
genètiques en embrions generats in vitro de parelles portadores o afectes de malalties
monogèniques, per tal de seleccionar-ne els no afectes per a la seva transferència a l’úter
matern. El cribratge d’aneuploïdies o PGS (preimplantation genetic screening), en canvi,
consisteix en l’anàlisi de la citogenètica dels embrions per així seleccionar embrions euploides
per a la seva transferència i així incrementar les taxes d’embaràs dels cicles de fecundació in
vitro. El PGS pot dur-se a terme mitjançant la tècnica de la hibridació genòmica comparada
sobre metafases (mCGH), que permet l’anàlisi de la dotació de cadascun dels 22 cromosomes
autosòmics i dels cromosomes sexuals. Aquesta tècnica també permet la detecció de
desequilibris estructurals, ja siguin deguts a translocacions Robertsonianes o recíproques
presents en els progenitors, així com de delecions o duplicacions de fragments cromosòmics,
sovint detectades en pronucli masculí. El PGS es duu a terme, majoritàriament, mitjançant
l’estudi citogenètic d’un sol blastòmer biopsiat de cada embrió que hagi assolit l’estadi de 6-8
cèl·lules.
En aquesta tesi doctoral s’ha determinat l’efecte de l’estadi de replicació de les cèl·lules en ser
analitzades mitjançant la mCGH de cèl·lula única. Aquest estudi s’ha dut a terme tant en un
model de línia cel·lular de fibroblasts com en blastòmers d’embrions humans crio-preservats.
Un segon objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat determinar la presència d’alteracions
cromosòmiques i estructurals en embrions de parelles amb factor masculí d’infertilitat, ja sigui
per reorganitzacions cromosòmiques equilibrades, un seminograma anòmal o una incidència
d’aneuploïdies incrementada als espermatozoides. A les famílies candidates al DGP, se’ls ha
realitzat un estudi complet del seminograma i la fragmentació del DNA espermàtic amb
l’objectiu de relacionar la citogenètica dels embrions i el pronòstic reproductiu de les parelles
amb el grau de fragmentació del DNA espermàtic. El coneixement d’aquests paràmetres
permetrà caracteritzar adequadament les parelles sotmeses a cicles de DGP i predir-ne l’èxit
reproductiu.
En aquesta tesi doctoral també s’ha validat una variant d’anàlisi citogenètica molt més potent
que la mateixa mCGH: els arrays de CGH d’oligonucleòtids d’Agilent. S’ha valorat la
correspondència entre el diagnòstic citogenètic obtingut mitjançant les metodologies de la
mCGH, els arrays de CGH d’oligonucleòtids i els arrays de CGH BACs, tecnologia
àmpliament utilitzada en el DGP durant els darrers anys. La validesa dels arrays de CGH
d’oligonucleòtids per a la seva aplicació a DGP s’ha demostrat en un cas de DGP per un
portador equilibrat d’una translocació Robertsoniana. / Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) allows the diagnosis of genetic disorders in IVF
embryos from affected couples or carriers of monogenic diseases, in order to select non-affected
embryos for transfer to the maternal uterus. Preimplantation genetic screening (PGS), however,
consists in the cytogenetic analysis of embryos in order to select only euploid ones for transfer
and thus increase pregnancy rates in IVF cycles. PGS can be carried out with the comparative
genome hybridization on metaphase spreads (mCGH) technique, which allows cytogenetic
analysis of the 22 autosomal chromosomes in addition to the sex chromosomes. This technique
also allows the detection of structural imbalances, either due to Robertsonian or reciprocal
translocations present in the parents, as well as deletions or duplications of chromosome
segments, often found in male pronucleus. PGS is mainly carried out by analysing one
blastomere biopsied from each embryo that has reached the 6-8-cell stage.
In this thesis, we have determined the effect of the cell stage in mCGH analysis from single
cells. This study has been carried out with a model cell-line of fibroblasts and also with
blastomeres from human cryopreserved embryos.
A second objective of this thesis was to determine the presence of structural abnormalities in
embryos from couples with male-factor infertility, either with balanced chromosomal
rearrangements, abnormal seminogram or increased incidence of sperm aneuploidies. A
complete seminogram and sperm DNA fragmentation analysis has been performed in all PGD
couples in order to study the relationship between embryo cytogenetics, reproductive prognosis
and sperm DNA fragmentation. This will allow a more accurate characterisation of couples
undergoing PGD cycles, so their reproductive success can be predicted.
A different methodology, much more powerful than mCGH, has also been validated in this
thesis for single-cell cytogenetic analysis: oligonucleotide CGH array from Agilent.
Correspondence between cytogenetic diagnoses obtained by mCGH, oligonucleotide CGH array
and BAC CGH array, a widely used technology in PGD in the last years, has been analysed.
The validity of oligonucleotide CGH array for its application to PGD has been demonstrated in
a PGD case for a balanced carrier of a Robertsonian translocation.
|
42 |
Novel Approaches for Molecular Diagnosis of Genetic Diseases by Next Generation Sequencing: Application to Breast Cancer and Retinitis Pigmentosa in the Clinical PracticeMiranda de Sousa Dias, Miguel 10 February 2014 (has links)
En la pràctica clínica actual existeix una demanda creixent d’estudis moleculars de malalties genètiques. Generalment, la detecció de mutacions patològiques en gens candidats consisteix en la seqüenciació directa dels exons i les zones intròniques flanquejants mitjançant el mètode de Sanger, el qual es basa en una electroforesi capil·lar i requereix l’amplificació prèvia de cada fragment d’ADN en una reacció de PCR individual. Així, l’anàlisi de gens formats per molts exons com BRCA1 i BRCA2, associats a càncer de mama i ovari, implica un elevat nombre de reaccions de PCR i seqüenciació, i esdevé una tasca molt costosa en termes de temps i diners. D’altra banda, l’estudi de malalties monogèniques genèticament heterogènies, com és el cas de la Retinosi Pigmentària autosòmica dominant (RPad), pot requerir l’anàlisi de més de 20 gens per tal d’identificar la causa molecular de la malaltia. Tot i així, només un 20-30% dels pacients amb RPad són diagnosticats molecularment ja molts gens i mutacions associades a la malaltia són encara desconeguts.
D’aquí que l’ús de les tècniques de seqüenciació massiva d’ADN o seqüenciació de nova generació (NGS) sigui una pràctica cada vegada més habitual en els laboratoris de genètica molecular. Per a l’estudi de diversos pacients en paral·lel o per a analitzar exomes complets amb la finalitat de trobar nous gens associats a RPad, existeixen grans plataformes de seqüenciació massiva. No obstant, l’elevat cost i la gran capacitat d’aquestes plataformes es tradueix en una pèrdua de flexibilitat a l’hora de satisfer la necessitat de molts laboratoris de genètica, que sovint han d’analitzar la mostra d’un o pocs individus en un temps i amb un cost raonablement reduïts. Com a conseqüència, les empreses tecnològiques que treballen amb equips de NGS han introduït al mercat petites plataformes adaptades a l’ús clínic. Una d’aquestes plataformes, el GS Junior, ha demostrat amb èxit el seu potencial per al diagnòstic en laboratoris de genètica molecular. Amb la mateixa tecnologia bàsica que el GS 20 i GS FLX, la plataforma GS Junior utilitza les tècniques de PCR en emulsió i piroseqüenciació, però suposa una menor despesa tant de posada en marxa com de funcionament.
Aquest treball de recerca té com a objectiu provar i posar a punt tecnologies de NGS per tal d’obtenir diagnòstics moleculars a uns costos assumibles. Amb aquesta finalitat i per a l’estudi dels gens BRCA1 i BRCA2, es va idear un protocol de PCR llarga associat a dos mètodes enzimàtics de fragmentació d'ADN per tal d’obtenir biblioteques d’ADN preparades per a ser analitzades amb NGS. A més, es van assajar diferents mètodes basats en PCR llarga, multiplex o en emulsió, i en captura d’ADN per a detectar mutacions causants d’RPad.
A més, aprofitant la reducció del preu per megabase seqüenciada, també es va fer seqüenciació massiva de l’exoma. L'eficiència de les diferents metodologies avaluades ha permès crear nous protocols de treball que ja han estat implementats en la rutina del laboratori. Per tal de caracteritzar nous gens associats a RPad, es va utilitzar la NGS per analitzar un array de captura de 448 gens candidats en diverses famílies i l’exoma complet d’una d’elles. Es va observar que els pacients analitzats presentaven un gran nombre de variants. Per a poder establir el paper d’aquestes variants com mutacions causants de la malaltia, és imprescindible efectuar la segregació familiar; per tant, la validació dels resultats només es podia aconseguir en famílies amb almenys dos individus afectats i un membre no afectat. D’aquesta manera, en la seqüenciació de l’exoma, es van trobar més de 150 variants genètiques que podrien ser les causants de la RPad en la família. / Molecular testing of genetic diseases is in increasing demand in routine clinical practice. Medical analysis of candidate genes to characterize the mutation that causes a disease currently requires amplification of the exonic and flanking sequences by PCR as a previous step to individual PCR fragment capillary electrophoresis sequencing (Sanger sequencing). BRCA1 and BRCA2, which are associated with the risk of breast cancer, are large genes with a high number of exons, and therefore involve a considerable number of individual PCRs and sequencing reactions to cover the coding and flanking sequences of both genes, which is a very costly and time consuming task. On the other hand, in genetically heterogeneous monogenic diseases such as autosomal dominant Retinitis Pigmentosa (adRP), mutation screening may be required in more than 20 genes in order to establish the molecular cause of the disease. Even so, using these expensive approaches, just 20-30% of adRP patients can be molecular diagnosed due to the fact that the mutation associated with the disease is yet unknown in more than 60% of all adRP cases
Hence the use of massive DNA sequencing or next generation sequencing (NGS) technologies is a vital practice within any clinical genetic laboratory. Large next-generation platforms are indicated for this task. Likewise, for the analysis of the whole exome to characterise new genes associated with adRP and/or for extensive patient surveys, these large platforms are also required. However, the cost and extremely large capacity of these platforms results in a loss of flexibility regarding the needs of many genetics laboratories where it is sometimes necessary to analyse samples from only one or just a few individuals in a reasonably short time. In consequence, technologic firms participating in the NGS marketspace have introduced smaller NGS platforms adapted for clinical use. One such platform, the GS Junior, has successfully proven its potential for molecular diagnosis in molecular genetics laboratories. Sharing the same core technology as the GS 20 and the GS FLX, the GS Junior platform exploits similar emulsion PCR and pyrosequencing approaches, but with lower set-up and running costs.
Accordingly, this research work aims for the successful management of NGS technologies in order to offer advanced molecular diagnosis services at assumable costs. As a result, a Long-Range (LR) -PCR approach associated with two distinct enzymatic DNA shearing methods was devised in order to prepare DNA libraries for NGS to achieve molecular testing of the large BRCA1 and BRCA2 genes. Furthermore, different methods based on LR, multiplex, emulsion PCR, or targeting DNA gene capture were assayed to detect mutation-causing adRP.
In addition, and taking the advantage of the significant price reduction per Megabase sequenced, the whole exome analysis method was also put to the test. The efficiency of the distinct methodologies used for NGS in routine clinical practice was evaluated resulting in new diagnostic protocols based on this research work, which are already introduced at a clinical routine level. In order to characterize novel genes associated with adRP, NGS was used. 448 candidate genes array and the whole exome analysis approach were carried out. It was demonstrated that the analysed patients showed a large number of variants. To characterize these variants as a disease-causing mutation, segregation in the family is mandatory. Thus, validation of results only can be achieved in families with at least two affected and one unaffected member. In this case, more than 150 genetic variants putative causing of adRP were obtained in one family.
|
43 |
Genética de la introgresión de genes del almendro (prunus dulcis Mill.) en el melocotonero [P. persica (l.) Batsch]: desarrollo de una estrategia de selección de líneas casi isogénicas (Nils) con marcadores molecularesDonoso Contreras, José M. 29 September 2014 (has links)
El melocotonero es el frutal de hueso más importante a nivel mundial, y el tercer árbol de fruta dulce cultivada después del manzano y el peral. A nivel genético es una de las especies mejor caracterizadas de la familia Rosaceae. El melocotonero presenta un bajo nivel de variabilidad genética pero es sexualmente compatible con otras especies de Prunus, como el almendro, los cuales podrían ser una posible fuente de nuevos genes para enriquecer su pool genético. Estudiamos un conjunto de caracteres asociados a la flor, fenología, calidad de fruta, morfología de la hoja y la resistencia a enfermedades en dos poblaciones de almendro (‘Texas’) x melocotonero (‘Earlygold’): una F2 (TxE) y un BC1 (T1E) del parental ‘Earlygold’. Tres mapas genéticos de alta densidad se construyeron utilizando un chip de SNP de 9K y 131 marcadores microsatélite: el mapa F2 (llamado TxE) y los mapas de los parentales del BC1 denominados T1E (para el híbrido) y E (para ‘Earlygold’). La comparación del mapa intraespecífico de E con los mapas interespecíficos de TxE y T1E mostró una mayor tasa de recombinación en los cruzamientos intraespecíficos que en los cruzamientos interespecíficos. El mapa de E presentó aproximadamente la mitad de su genoma sin marcadores polimórficos, lo que se interpretó por la presencia de regiones idénticas por descendencia debido a su alto nivel de coancestría. La presencia de plantas androestériles en ambas poblaciones y su segregación fue consistente con la existencia de androesterilidad citoplasmática, debido a que los individuos que tienen el citoplasma del almendro requieren la presencia del alelo del almendro en al menos uno de los dos genes restauradores, Rf1 y Rf2, para ser fértil. Varios caracteres como el tipo de flor (Sh), el tipo de fruta (Ft), la jugosidad (Jui), el color de la antera (Ag y Ag2), la pulpa antociánica (Bf2), el color de la flor (Fc2) y la resistencia al oídio (Vr3) se mapearon como caracteres morfológicos. El estudio de caracteres cuantitativos permitió identificar 63 QTLs consistentes en 32 caracteres relativos a flor (2), fenología (7), calidad de fruta (15) y hoja (8). Nuevos alelos del almendro en rasgos importantes como el color de la piel, la pulpa antociánica o la resistencia al oídio son útiles para enriquecer el pool genético del melocotonero cultivado. Proponemos la estrategia de Introgresión Asistida por Marcadores Moleculares (IAM) para integrar los fragmentos cromosómicos del almendro en el melocotonero cultivado en un breve período de tiempo (2-3 generaciones). Esta estrategia incluye tres etapas: la primera consiste en la selección de individuos con bajo número de introgresiones (preNILs) en una amplia población BC1. En esta etapa obtuvimos nueve individuos con tres o menos introgresiones de 882 individuos T1E, lo que demuestra que esta etapa es factible. La segunda etapa implica el mapeo de genes mayores de interés utilizando una colección de preNILs. En esta etapa seleccionamos 18 preNILs con cuatro o menos introgresiones y demostramos que todos los genes mayores podían ser mapeados en sus posiciones esperadas, aunque esto sólo fue posible para uno de los dos QTLs mayores estudiados. La tercera etapa consistiría en autofecundar o retrocruzar y autofecundar algunas preNILs para obtener NILs (líneas casi isogénicas) homocigotas con una sola introgresión de almendro en el fondo genético del melocotonero. Una colección completa de NILs (cubriendo todo el genoma del almendro) es una poderosa herramienta para el análisis genético de caracteres complejos. Además, las NILs con genes de interés se pueden introducir rápidamente en un programa de mejora genética. Esta tercera etapa está actualmente en progreso y se retrasará una generación debido a la androesterilidad citoplasmática. Proponemos la estrategia de IAM utilizando otras especies de Prunus como una forma de incrementar la variabilidad genética del melocotonero incorporando un conjunto de resistencias a plagas y enfermedades y mejoras en la calidad de la fruta necesarias para la mejora del melocotonero en las próximas décadas. / Peach is the most important stone fruit crop of the world in cultivated surface and the third among temperate fruit after apple and pear. It is one of the best genetically characterized species of the Rosaceae family. Peach has a low level of genetic variability but it is sexually compatible with other Prunus species, as almond, that could be a source of new genes for enrichment its genome. We studied the genetics of traits related to flower, phenology, fruit quality, leaf morphology and resistance to diseases in two almond (‘Texas’) x peach (‘Earlygold’) progenies: an F2 (TxE) and a BC1 (T1E) to the ‘Earlygold’ parent. High density maps were developed using a 9k peach SNP chip and a collection of 131 SSR markers. Three maps were obtained: the F2 map (named TxE) and the maps from the two parents of the backcross, T1E (for the hybrid) and E (for ‘Earlygold’). Comparison of the intraspecific E map with the interspecific TxE and T1E maps showed that recombination rates were much lower in interspecific than in intraspecific crosses. The E map had approximately half of its genome without polymorphic markers, which we interpreted as being identical by descent in the fixed regions due to its high level of coancestry. Male sterile plants were recovered in the F2 and BC1 generations and their segregation was consistent with the existence of a cytoplasmic male sterility, where individuals having the almond cytoplasm required the presence of the almond allele in at least one of two independent restorer genes, Rf1 and Rf2, to be fertile. Several traits as flower type (Sh), fruit type (Ft), juiciness (Jui), anther color (Ag and Ag2), blood flesh (Bf2), flower color (Fc2) and powdery mildew resistance (Vr3) have been mapped as single genes. The genetics of quantitative traits has been studied and 63 significant QTLs that had a consistent behavior across years have been identified for 32 flower (2), phenology (7), fruit (15) and leaf (8) traits. New alleles from almond on important traits such as red skin color, blood flesh or powdery mildew resistance have been identified that may prove to be useful for the introduction of new variability into the peach commercial gene pool. We propose the strategy of Marker Assisted Introgression (MAI) to integrate chromosomal fragments of almond into the peach background in a short time span (2-3 generations). MAI includes three steps: the first consists of selecting a set of individuals with a low number of introgressions (preNILs) from a large BC1 progeny, and we obtained nine individuals with three or less introgressions from 882 T1E progeny, showing that this step is feasible. The second MAI step involves mapping some of the major genes of interest using a collection of preNILs. We selected 18 peach-almond preNILs with four or less introgressions and showed that all major genes tested could be mapped to their expected positions, although this occurred in only one of the two major QTLs assayed. The third step consists of selfing or backcrossing and selfing some of the preNILs to extract homozygous NILs (Near Isogenic Lines) having a single almond introgression in the peach background. A complete collection of NILs (covering the complete almond genome) is a powerful tool for genetic analysis of complex characters and NILs containing genes of interest can be readily introduced into peach breeding to obtain cultivars with novel genes. This third step is currently in progress and will be delayed one generation due to the presence of the cytoplasmic male sterility. The extension of the MAI strategy to other donor Prunus species is proposed as a way to incorporate in the peach genome needed genes for pest and disease resistance and fruit quality for the cultivars of next decades.
|
44 |
Manipulació genètica del pàncrees per a l'estudi de la diabetisMorró Larrubia, Meritxell 30 May 2014 (has links)
La diabetis és una de les malalties més comunes. Els dos tipus principals són, la tipus 1 i la tipus 2, i es caracteritzen pel desenvolupament d’hiperglucèmia. En la diabetis tipus 1, aquest increment en la glucèmia apareix com a conseqüència d’una disminució de la massa de cèl·lula β i una pèrdua de funcionalitat dels illots. Per tant, restablir una massa de cèl·lula β capaç de mantenir una adequada homeòstasi de la glucosa és un dels principals reptes de la medicina regenerativa pel tractament de la Diabetis. Per avaluar l’eficàcia d’aquests nous tractaments seria de gran interès disposar d’eines que permetin manipular genèticament el pàncrees in vivo.
En aquest estudi, s’han desenvolupat tres aproximacions clau per a l’anàlisi de la massa de les cèl·lules β i de les cèl·lules acinars del pàncrees: un ratolí transgènic RIP-I/β-Gal el qual expressa la β-Galactosidasa (β-Gal) de forma específica a les cèl·lules β del pàncrees, i vectors virals Adeno-associats (AAV) i Adenovirus helper dependents (HdAd) que expressen diferents gens marcadors.
En primer lloc s’ha generat el ratolí transgènic RIP-I/β-Gal per poder avaluar possibles canvis en la massa de cèl·lula β al llarg del temps i/o en processos patològics com la diabetis. De tots els animals fundadors obtinguts, només una de les línies, la L5, la de menor nombre de còpies presentava una elevada expressió de la β-Gal als illots pancreàtics, sent aproximadament el 90% de cèl·lules β del illot doble positives Ins+/β-Gal+.
També, s’han dissenyat i produït vectors virals HdAd i AAV que expressen el gens reporters GFP o seAP (secreted Alkaline Phosphatase) específicament a les cèl·lules β o exocrines segons els promotor utilitzat, promotor d’insulina (hIns) o Elastasa, respectivament.
Els HdAd, a diferència dels AAV, presenten una major capacitat de clonatge però la seva producció és més complexa. Després de la transducció via intraductal del pàncrees dels vectors HdAd-CMV-GFP o HdAd-Elastasa-GFP es va observar una disminució significativa de l’expressió de GFP als pocs dies de la injecció, degut a una forta infiltració limfocitària causada principalment per l’expressió de GFP. En canvi, quan s’utilitzava un marcador no immunogènic com la seAP l’expressió era detectada a llarg termini. Aquests resultats demostren per primer cop que la transducció del pàncrees exocrí i endocrí mitjançant vectors HdAd és possible i que l’expressió del gen d’interès es manté durant un període de temps llarg.
En paral·lel als estudis amb els HdAd, s’ha demostrat la transducció al pàncrees exocrí i endocrí quan s’injectaven els vectors de serotip 9 (AAV9) per via intraductal i intravenosa a ratolins. Animals injectats per via intraductal amb els vectors AAV9-Elastasa-seAP mostraven nivells de seAP circulants a llarg termini. Aquests vectors han estat útils per avaluar les diferències de transducció segons la via d’administració i la soca de ratolí utilitzada, observant-se una elevada transducció en els ratolins C57Bl6 independentment de la via d’administració.
La regeneració de cèl·lules β in vivo ha esdevingut un mètode prometedor per al tractament de la diabetis tipus 1. Donada l’eficiència i seguretat de les estratègies de transferència gènica mitjançant els vectors virals AAV, es van utilitzar aquests vectors per a transferir gens clau per a reprogramar les cèl·lules acinars del pàncrees cap a un fenotip β en ratolins diabètics immunocompetents. En aquest estudi es van utilitzar tres factors de transcripció claus implicats en el desenvolupament de la cèl·lula β: Pdx1 (Pancreas and duodenal homeobox gene-1), Neurog3 (Neurogenin 3) i MafA (PNM). Es va observar un increment estadísticament significatiu de l’expressió ectòpica dels tres factors al pàncrees i un increment de l’expressió de la insulina, tot i que no hem aconseguit disminuir la hiperglucèmia dels ratolins C57Bl6 diabètics. Però quan es van coinjectar els AAV9-PNM amb un Ad5-nul no codificant es va aconseguir una reprogramació parcial de les cèl·lules exocrines en productores d’insulina observant-se una expressió significativa del gen Ins1 (Insulina 1) i una disminució de les glucèmies dels ratolins diabètics.
Per tant, les aproximacions desenvolupades en aquesta tesi han demostrat que la manipulació genètica del pàncrees, tant de les cèl·lules endocrines com de les exocrines, poden ser molt útils per avaluar possibles teràpies per a la diabetis o en altres malalties pancreàtiques. / Diabetes is one of the most common diseases. The two main types are the Type 1 and Type 2 Diabetes and are characterized by the development of hyperglycaemia. In type 1 Diabetes, the increase in glucose levels results from a decrease in β-cell mass and loss of islet functionality. Therefore, recover the β cell mass to maintain an appropriate glucose homeostasis is one of the main challenges of regenerative medicine for diabetes treatment. To evaluate the effectiveness of these new diabetes treatments it would be of great interest to have tools to analyse pancreas cells (endocrine and exocrine) in vivo.
In this study, we have developed three key approaches to analyse the pancreatic β cell mass and acinar cells: a RIP-I/β-Gal transgenic mouse that overexpresses β-Galactosidase (β-Gal) specifically in pancreatic β cells and adeno-associated viral vectors (AAV) and Adenoviral helper-dependent vectors (HdAd) expressing different markers.
First, we generated the transgenic mice RIP-I/β-Gal to assess possible changes in β cell mass over the time and/or pathological processes such as diabetes. Only one of obtained lines, L5, with lower copy number, showed a high expression of β-Gal in pancreatic islets, being approximately 90% of β cells double positive for Ins+/β-Gal+.
Furthermore, we have designed and produced HdAd and AAV viral vectors expressing reporter genes such as GFP (Green Fluorescent Protein) or seAP (secreted Alkaline Phosphatase) specifically in β cells or in exocrine cells, according to the promoter used, insulin (hIns) or elastase promoter, respectively.
The HdAd, unlike AAV, has higher cloning capacity, but the production is more complex. After the transduction of the pancreas following the intraductal administration of HdAd-CMV-GFP or HdAd-elastase-GFP vectors, a significant decrease in GFP expression was shown few days after injection, due to a strong lymphocyte infiltration caused mainly by overexpression of GFP. However, when we used the seAP non-immunogenic marker, the seAP expression was detected long term. These results demonstrate for the first time that the endocrine and exocrine pancreas transduction by HdAd vectors is possible and that the expression of the gene of interest is maintained for a long period of time.
In parallel with HdAd studies, the endocrine and exocrine pancreas transduction has also been achieved when AAV serotype 9 vectors (AAV9) have been administered intravenously or intraductaly. The animals injected intraductaly with AAV9-elastase-seAP vectors showed long term higher seAP circulating levels. These vectors have been useful for assessing differences in transduction levels according to the administration route and the mouse strain used. Therefore, we have observed a high transduction in C57Bl6 mice regardless of the route of administration.
The in vivo β cell regeneration has become a promising method for Type 1 Diabetes treatment. Given the efficiency and safety of gene transfer strategies using AAV viral vectors, these vectors were used to transfer key genes with the aim to reprogram pancreatic acinar cells into β phenotype cells, in immunocompetent diabetic mice. In this study we used three key transcription factors involved in the development of β cell: Pdx1 (Pancreas and duodenal homeobox gene-1), Neurog3 (Neurogenin3) and Mafa.
We observed a significant increase of the pancreas ectopic expression of the three factors resulting in enhanced insulin expression, although the hyperglycaemia was not reduced in diabetic C57Bl/6 mice. When we coinjected AAV9-PNM (Pdx1, Neurog3, Mafa) vectors with an Ad5-null non-coding vector, partial reprogramming of exocrine cells into insulin-producing cells was achieved with a significant expression of Ins1 (Insulin 1) gene and a decrease on glycaemia of diabetic mice.
Therefore, the approaches developed in this thesis have shown that the genetic manipulation of the pancreas, exocrine and endocrine cells, could be very useful for evaluating potential therapies for diabetes or other pancreatic diseases.
|
45 |
Análisis, validación y estudio poblacional de las inversiones entre dos genomas humanosVicente Salvador, David 14 September 2014 (has links)
Las inversiones fueron las primeras variantes estructurales detectadas y asociadas a efectos fenotípicos en varias especies. Sin embargo, la dificultad de su estudio las ha llevado a ser las peor caracterizadas en genomas complejos como el humano. En los últimos años, se ha predicho un elevado número de posibles inversiones polimórficas en humanos mediante técnicas a gran escala como el mapeo de extremos apareados de fósmidos o la secuenciación de genomas completos, pero pocas de estas predicciones han sido validadas o estudiadas en detalle. En este trabajo se han investigado las 90 inversiones que provienen de la comparación de dos genomas ensamblados de forma independiente: el genoma de Referencia HG18 y el de J. Craig Venter (HuRef). El análisis detallado de su secuencia ha demostrado que 31 (34.4%) son errores en la comparación de ambos genomas. A continuación se han analizado experimentalmente 46 de las 59 regiones candidatas restantes (51.1%) mediante PCR y PCR inversa en el ADN de HuRef y un panel de 9 individuos de HapMap de origen Africano, Asiático y Europeo. De éstas, 18 han resultado contener inversiones polimórficas reales y 30 son errores de ensamblaje en uno de los genomas (25 errores en HG18 y 5 en HuRef). Estos errores se han confirmado experimentalmente amplificando la región en los clones BAC del genoma de Referencia o en el ADN de HuRef, respectivamente. De esta manera se ha podido eliminar un gran número de predicciones falsas y se ha contribuido a definir un catálogo fiable de inversiones polimórficas en el genoma humano. Además, 17 de las inversiones validadas se han genotipado en 90 individuos de HapMap de origen Europeo y en dos especies de primates y 7 con puntos de rotura sencillos se han genotipado in silico en 1092 individuos de 14 poblaciones del proyecto de los 1000 Genomas, a través de la detección de secuencias que contienen los puntos de rotura. Los genotipos nos han permitido encontrar SNP marcador, establecer las frecuencias del alelo invertido en diferentes poblaciones y la orientación ancestral. Mediante el análisis de la variación nucleotídica y haplotípica se ha podido determinar también el origen único o recurrente de las inversiones en la población Europea, y se han encontrado tres inversiones que habrían ocurrido en haplotipos diferentes. El análisis de secuencia de los puntos de rotura nos ha permitido determinar su mecanismo de formación e identificar genes cuya expresión podría verse afectada. Como resultado, se ha visto que las inversiones forman dos grupos según las características de sus puntos de rotura: las inversiones con puntos de rotura no localizados en repeticiones invertidas (RIs) generalmente tienen un tamaño menor y están formadas por mecanismos no homólogos que determinan su origen único, mientras que las inversiones con puntos de rotura en RIs tienen un tamaño mayor y están formadas por mecanismos homólogos que determinan su posible origen recurrente. Por otra parte, las inversiones analizadas destacan por localizarse fuera de regiones codificantes, en regiones intergénicas o dentro de intrones, aunque algunas invierten parcial o completamente genes duplicados. Finalmente, se han clasificado las inversiones según su posible implicación adaptativa mediante el análisis de las diferencias de frecuencia en las poblaciones, el estado ancestral, el índice de estructuración de la población Fst, y los posibles efectos sobre genes determinados por la posición de los puntos de rotura. En general no se esperan efectos drásticos de sus puntos de rotura, aunque las inversiones HsInv0006 y HsInv0030 son candidatas a tener efectos sobre los genes DSTYK y CTRB2/CTRB1, respectivamente, y en el caso de la inversión HsInv0006 su distribución poblacional sugiere posibles efectos adaptativos. / Inversions were the first type of structural variants to be detected and associated to phenotypic effects in different species. However, studying them was difficult and they have become one of the less characterized variants in complex genomes such as the human. In the last years, a great number of putative polymorphic inversions have been predicted in humans by high-throughput techniques, like fosmid paired-end mapping or whole genome sequencing, but few of them have been validated or studied in detail. In this work we have investigated the 90 inversions coming from the comparison of two independently assembled genomes, the Reference genome HG18 and J. Craig genome (HuRef). By analysing in detail its sequence, we have shown that 31 (34.4%) regions are errors in the comparison of both genomes. Next,we have experimentally analyzed 46 out of the 59 remaining candidate regions (51.1%) by PCR and inverse PCR using DNA from HuRef and 9 HapMap individuals from Africa, Asia and Europe. Of those, 18 have resulted to be polymorphic inversions and 30 are assembly errors of one of the genomes (25 HG18 errors and 5 HuRef errors). These errors have been experimentally confirmed by amplifying the region in the BAC clones from the Reference genome or in HuRef's DNA, respectively. Thus, we have been able to eliminate a high number of false predictions and contributed to the definition of a reliable catalog of polymorphic inversions in the human genome. In addition, for 17 of the validated inversions we have genotyped 90 European HapMap individuals and two primate species, and for 7 inversions with simple breakpoints we have also genotyped in silico 1092 individuals from 14 populations from the 1000 Genomes Project through the detection of sequences that contain the breakpoints. Genotypes have been used to find tag SNPs, establish the frequency of the inverted allele in the different populations and the ancestral orientation. Trough the analysis of the nucleotide and haplotype variation it has also been possible to determine the unique or recurrent origin of inversions, and three inversions generated in different haplotypes have been found. The analysis of the breakpoint sequence have allowed us to determine its formation mechanism and to identify genes whose expression could be affected. As a result, inversions can be classified in two groups depending on its breakpoint characteristics: inversions with simple breakpoints not located in inverted repeats are smaller and are formed by non-homologous mechanisms that imply an unique origin, whereas inversions with breakpoints located in IRs are longer and are formed by homologous mechanisms that are related to their potential recurrent origin. On the other hand, the analyzed inversions tend to be located out of coding regions, in intergenic regions or within introns, although few of them invert partially or completely duplicated genes. Finally, inversions have been classified according to its possible adaptive effects based on the analysis of frequency differences among populations, ancestral state, the Fst population structure index, and possible effects over genes determined by breakpoint position. The inversions that we have analyzed are located out of coding regions, in intergenic regions or into introns, although few of them partial or completely invert duplicated genes. In general no drastic effects of its breakpoints are expected, but inversions HsInv0006 and HsInv0030 are candidates to affect the DSTYK and CTRB2/CTRB1 genes, respectively, and in the case of inversion HsInv0006, its population distribution suggests possible adaptive effects.
|
46 |
Characterization of the Iberian pig genome and transcriptome using high throughput sequencingEsteve Codina, Anna 26 September 2012 (has links)
En aquesta tesis, hem estudiat els patrons de variabilidad nucleotídica del genoma del porc per entendre millor quines forces evolutives l’han afectat. El porc domèstic és una espècie domèstica que presenta una gran variabilitat fenotípica arrel del procés de domesticació i de la formació de races moderna. A més, el porc senglar i altres espècies pròximes encara, avui, estan vives, facilitant, així, la búsqueda de gens candidats que han sofert selecció artificial. El porc, és, també, important en el camp de la biomedicina, com a model de malalties humanes i com a reservori d’organs humans.
En el primer capítol, hem volgut detectar si hi ha hagut selecció artificial en un possible gen candidat per la qualitat de la carn en porcs, la SERPINA6. Per això, hem estudiat la variabilitat nucleotídica de diversos porcs domèstics i senglars de diferents orígens (asiàtics i europeus). L’anàlisis realitzat, però, no ha estat concloent.
En segon lloc, fent ús de les noves tècniques de seqüenciació nova generació, hem pogut estudiar la variabilitat nucleotídica, no només d’un cert gen, sinó de tot el genoma complet d’un porc Ibèric. A més, també, ens ha permès estudiar i caracteritzar el seu transcriptoma. Per dur-ho a terme, hem utilitzat diverses tècniques i metodologies complementàries: ‘whole genome sequencing’, ‘reduced representation libraries’, ‘pool sequencing’ and ‘transcriptome sequencing’. L’estimació de la variabilitat nucleotídica ha estat de 0.7kb-1, un valor gens negligible considerant l’alt coeficient de consanguinitat d’aquesta estirp de porcs. Hem observat, també, que els telòmers tenen una variabilitat més alta que els centròmers, fet que es pot explicar per una taxa de recombinació més alta. A més, el cromosoma X presenta una variabilitat molt més baixa de la esperada respecte als autosomes, causada, segurament per selecció o altres efectes demogràfics.
Per estudiar regions en el genoma sota selecció, hem dividit el genoma en finestres no solapants i calculat diferents test de selecció, tant en un pool de porcs ibèrics, com en un sol individu. Les regions amb excés de polimorfisme i que per tant, podrien estar sota selecció balancejadora, estan enriquides en receptors olfactoris i gens del complex d’histocompatibilitat. En canvi, en regions amb excés de diferenciació i variabilitat molt baixa, no sembla que hi hagi un clar enriquiment en cap funció. De totes maneres, citem possibles gens candidats relacionats amb el metabolisme lipídic, la queratinització, la formació de pèls i el comportament.
Per altra banda, les tècniques de seqüenciació massiva permeten també, detectar variants estructurals basant-se en els patrons del ‘read depth’. D’aquesta manera, hem pogut identificar guanys en el nombre de còpies de certes regions del genoma Ibèric respecte al genoma de referència. En total, hem trobat que 36 Mb del genoma estan afectades i que aproximadament un 5% de gens es troben dins aquestes regions. Així doncs, hem pogut identificar nous paràlogs de gens anotats; la majoria formant part de grans famílies gèniques.
Finalment, hem comparat el transcriptoma de gònades masculines entre dos porcs amb fenotpis molt extrems, un d’Ibèric i un Large White. Els gens diferencialment expressats estan relacionats amb l’espermatogenesis i el metabolisme lipídic, acord amb les seves diferències fenotípiques. També hem pogut identificar nous gens no anotats, long-non-coding RNAs i elements de transposició expressats en aquest teixit.
|
47 |
Patrones de variacio n nucleotí dica y cartografí a de bloques de seleccio n ligada en el genoma de Drosophila melanogasterBarrón Aduriz, Maite Garazi 27 July 2015 (has links)
Gracias a la secuenciación de última generación (NGS) que permite disponer de múltiples genomas de individuos de una misma población podemos hoy hablar de una nueva disciplina: la genómica de poblaciones. El análisis de la variación a escala genómica añade una nueva dimensión en la interpretación de la variación genética (Jorde et al. 2001). Uno de los proyectos pioneros y más ambiciosos de genómica de poblaciones es la iniciativa internacional Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP), en el que se han secuenciado 205 genomas de la especie Drosophila melanogaster. Este recurso único se ha puesto a disposición de la comunidad drosofilista para el estudio de la variación genotípica y fenotípica en este organismo modelo de la genética desde sus orígenes. Los resultados obtenidos de los recientes estudios de variación genómica han desplazado el debate neutralista-seleccionista (Lewontin 1974) hacia una nueva perspectiva: la recombinación parece ser la fuerza evolutiva clave a la hora de determinar la importancia relativa de la deriva genética versus la selección natural en diferentes regiones del genoma.
Esta tesis es un estudio de genómica de poblaciones en la que se describen los patrones de variación nucleotídica de una población norteamericana de Drosophila melanogaster usando las secuencias genómicas de DGRP. Se evalúa la importancia relativa de los posibles factores genómicos moduladores de la variación nucleotídica a lo largo del genoma. La recombinación es con mucho la principal variable explicativa, por lo que se ha explorado en profundidad cómo afecta la tasa de recombinación a los patrones de variación. La correlación universalmente hallada entre el polimorfismo y la recombinación desaparece a partir de un valor umbral de recombinación en el nivel del cromosoma. En esta tesis se demuestra y estima la existencia de este valor umbral de recombinación para cada brazo cromosómico y se introducen dos nuevos conceptos en la genómica de poblaciones: bloque de selección ligada (LSB) y bloque sin selección ligada (NLSB). El genoma es un mosaico constituido por ambos tipos de bloques en los que la dinámica de la evolución molecular es opuesta y en consecuencia deben ser reconocidos y cartografiados. En los NLSB la interpretación clásica de los datos basados en la neutralidad como modelo nulo podría adoptarse perfectamente (Cavalli-Sforza 1966; Lewontin y Krakauer 1973), mientras que en los LSB se debe incorporar la selección ligada al cuerpo teórico y los modelos al uso de la genética de poblaciones. En esta tesis se traza el mapa de LSB en la especie Drosophila melanogaster utilizando distintas estimas de recombinación y se intenta determinar la unidad mínima de bloque de selección ligada. / Nowadays, sequencing of multiple individual genomes of the same population by next generation sequencing technologies (NGS) allows us to talk about a new discipline: Population Genomics. Genome-wide diversity analyses add an extra layer to the interpretation of genetic variation (Jorde et al. 2001). A pioneer and ambitious project in population genomics is the international initiative Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP), where 205 individual genomes of the species Drosophila melanogaster have been sequenced. This unique resource is being shared by the Drosophila research community to study genotypic and phenotypic diversity in this model organism. The results obtained by the new genome-wide variation studies have shifted the neutralist-selectionist debate (Lewontin 1974) towards a new perspective: the recombination is the key evolutionary force determining the relative importance of genetic drift versus natural selection in different regions of the genome.
In this dissertation, we describe the nucleotide diversity patterns of a North American natural population of Drosophila melanogaster population using DGRP genome sequences. We assess the relative importance of different population genetics forces modulating genome-wide nucleotide diversity. Recombination is the main explanatory variable and hence, we have deeply explored how recombination affects diversity patterns. The correlation almost universally found between polymorphism and recombination vanishes when recombination exceeds a given threshold value at the chromosome level. We show the actual existence of a recombination threshold at any given chromosome and their values for each chromosome arm have been estimated. Two new concepts in population genomics are introduced: linked selection block (LSB) and no linked selection block (NLSB). The genome is a mosaic made by these two distinctive blocks on which molecular evolutionary dynamics are opposite and, in consequence, they have to be recognized and mapped. In NLSB the classical interpretation of data based in neutrality as a null model could be perfectly applied (Cavalli-Sforza 1966; Lewontin y Krakauer 1973), while in LSB linked selection should be included in the theoretical framework of population genomics. We mapped the LSB map in Drosophila melanogaster using several recombination variables and we try to determine the minimum unit of linked selection block.
|
48 |
Phylogenomic analysis and genomic structure of human RCAN genes : Effect on RCAN overexpression on lymphocyte development and functionSerrano Candelas, Eva, 1982- 20 December 2012 (has links)
The protein phosphatase calcineurin (Cn), together with its substrates, the
transcription factors NFATc, play an essential role in several physiological
processes of vertebrates, such as the immune response, angiogenesis,
morphogenesis of the heart valves and neural and muscle development.
Concretely in the immune system, the Cn-NFATc signaling pathway is crucial in the
generation of T cell repertory in the thymus and in several processes of mature T
lymphocytes, as T cell activation and survival. The members of the Regulators of
Calcineurin (RCAN) family interact with Cn and compete with NFATc transcription
factors for binding to Cn. RCANs can act either promoting or suppressing Cn
activity towards its substrates. Due to their capacity to negatively modulate Cn-
NFATc signaling, RCAN proteins are considered as potential immunosuppressant
proteins. The aim of the present work was to deepen in the physiological
processes that regulate the expression of RCAN and to evaluate the effect of their
overexpression in the immune system. To this end, we have analyzed the
evolution of RCAN genes and the genomic structure of the three human members
of the RCAN gene family and, more specifically, the regulation of RCAN3 gene
expression. Furthermore, we have evaluated the expression pattern of the
different mouse Rcan genes in lymphoid tissues, and we have analyzed the in vivo
relevance of RCAN1 and RCAN3 overexpression in T cell development and
function. In this context, RCAN1 and RCAN3 overexpression enhances positive
selection of thymocytes. Moreover, RCAN1 overexpression increases the
generation of nTregs in thymus and seem to influence the effector/memory T cells
proportion in homeostasis. Furthermore, RCAN proteins appear to modulate
other TCR signaling pathways different than Cn-NFATc. Therefore, RCAN proteins
are important players of in vivo T cell development, differentiation and activation. / La fosfatasa calcineurina (Cn), junto con sus substratos, los factores de
transcripción NFATc, juega un papel esencial en varios procesos fisiológicos de
vertebrados, como la respuesta inmune, la angiogénesis, la morfogénesis de las
válvulas cardíacas o el desarrollo neuronal y muscular. Concretamente en el
sistema inmune, la vía de señalización celular Cn-NFATc es crucial en la generación
del repertorio de células T en el timo y en varios procesos de la función de los
linfocitos T maduros, como la activación y la supervivencia de las células T. Los
miembros de la familia de Reguladores de Calcineurina (RCAN) interaccionan con
Cn y compiten con los factores de transcripción NFATc por su unión a Cn. Las
RCAN pueden actuar promoviendo o inhibiendo la vía de Cn sobre sus sustratos.
Debido a esta capacidad de regular negativamente la vía de señalización Cn-
NFATc, las proteínas RCAN son consideradas como proteínas potencialmente
inmunosupresoras. El objetivo del presente trabajo ha sido profundizar en los
procesos fisiológicos que regulan la expresión de los genes RCAN y evaluar el
efecto de su sobrexpresión en el sistema inmune. Con este fin, hemos analizado la
evolución de los genes RCAN y la estructura genómica de los tres miembros RCAN
en humanos y, más específicamente, la regulación de la expresión génica de
RCAN3. Asimismo, hemos examinado el patrón de expresión de los diferentes
genes Rcan de ratón en tejidos linfoides y hemos analizado la relevancia in vivo de
la sobrexpresión de RCAN1 y RCAN3 en el desarrollo y la función de las células T.
En este contexto, la sobrexpresión de RCAN1 y de RCAN3 induce la selección
positiva de timocitos. Además, la sobrexpresión de RCAN1 aumenta la generación
de células nTregs en timo y parece influir en la proporción de células T
efectoras/memoria en homeostasis. Asimismo, las proteínas RCAN parecen
modular otras vías de señalización dependientes del TCR diferentes a la vía Cn-
NFATc. Por tanto, las proteínas RCAN son agentes importantes en el desarrollo, la
diferenciación y la activación de células T.
|
49 |
Genomic and functional approaches to genetic adaptationCarnero-Montoro, Elena, 1985- 25 October 2013 (has links)
The genetic basis of phenotypes that have contributed to the adaptation of species and
organisms to new environments is a central question in evolutionary genetics. The
recent accumulation of genetic variability data has allowed a genome-wide search for
different signatures of positive selection which has led to the discovery of hundreds of
putative candidate genes that may have played a role in adaptation. However, such
hypothesis-free approaches do not reveal either causal variants or the actual biological
mechanisms that have made each adaptation possible. Furthermore, the detection of
molecular signatures is limited both by the complex architecture of the genome and
by the possible polygenic nature of the selected trait.
In this thesis, through different evolutionary and functional approaches, we have
disentangled the adaptive role of two non-synonymous variants in two different
candidate genes encoding for a lymphocyte receptor and a zinc transporter,
respectively. In past human adaptation, they were most likely selected as more
effective means to fight pathogens. We have also revealed differences in the action of
natural selection between different pathways and different coding and non-coding
genomic elements in the chimpanzee lineage by analyzing polymorphisms and
divergence data together. Thus, the results of this PhD thesis have contributed to
detect new instances of genetic adaptation and provide biological explanation to them. / La base genética de los carácteres que han contribuido a la adaptación de los
organismos y las especies ha sido siempre una pregunta central en biología evolutiva.
Gracias a la acumulación masiva de datos de variabilidad genética, en los últimos
años se ha podido detectar en el genoma diferentes señales de selección positiva y
también localizar cientos de genes candidatos que han podido tener un papel en la
adaptación de las poblaciones a diferentes ambientes. Sin embargo en estos estudios,
donde no hay una hipótesis a priori, se desconoce qué variantes dentro de estos genes
fueron realmente las que proporcionaron una ventaja selectiva y por qué. Además, la
compleja arquitectura del genoma y la naturaleza poligénica de muchos carácteres
hace que sea difícil detectar casos más complejos de adaptación.
En esta tesis se intenta resolver algunos de estos problemas. En primer lugar,
mediante un enfoque evolutivo y funcional, hemos descifrado el rol adaptativo de dos
variantes genéticas, una en un receptor linfocitario y la otra en un transportador de
zinc, que probablemente fueron seleccionadas por conferir resistencia a patógenos. En
segundo lugar, mediante el análisis de datos de polimorfismo y divergencia
conjuntamente, también hemos detectado distintos mecanismos de acción de la
selección natural en distintos pathways y entre elementos codificantes y elementos no
codificantes reguladores en chimpancé.
|
50 |
Control of transcription by the stress activated Hog1 kinaseNadal Ribelles, Mariona, 1984- 25 November 2013 (has links)
A fundamental property of living cells is the ability to sense and robustly respond to fluctuations in their environment. In budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) changes in extracellular osmolarity are sensed by the HOG pathway, which evokes the program for cell adaptation required for cell survival.
The aim of this thesis was to further characterize the molecular mechanisms by which Hog1 regulates gene expression upon osmostress. A genome-wide genetic screen lead to the identification of several activities required for regulation of gene expression. Here we describe the characterization of a novel substrate for the SAPK whose activity is required for proper transcription initiation and elongation in response to stress.
This thesis also aimed to globally characterize the role of Hog1 in reprogramming the transcriptome of S. cerevisiae under osmostress conditions. By the combination of molecular approaches coupled to genome-wide techniques (ChIP-seq, MNase-seq and Tiling arrays) we have been able to fully characterize the localization of the key components that drive osmoresponsive transcription, providing for the first time a complete picture of the transcription process. The high resolution of the genome-wide approaches, has allowed us to identify new transcriptional roles for the SAPK such as the targeting of RNA Pol III machinery, and the regulation of a novel class of functional long noncoding RNAs (lncRNA). In summary, results presented in this thesis provide novel insights into the mechanisms by which the Hog1 SAPK modulates gene expression. / Una propietat cel·lular fonamental és l’habilitat de detectar i respondre de forma robusta a les
fluctuacions en el seu entorn. En cèl·lules de llevat (Saccharomyces cerevisiae), els canvis en l’
osmolaritat extracel·lular són detectats per la via de senyalització de HOG, que coordina el
procés d’adaptació cel·lular imprescindible per sobreviure a un estrès osmòtic.
L’objectiu d’aquest estudi és identificar i caracteritzar els mecanismes moleculars utilitzats per
Hog1 per regular l’expressió gènica en resposta a estrès osmòtic. Fent servir un crivatge
genètic a gran escala dissenyat per identificar activitats necessàries per la regulació de
l’expressió gènica en resposta a estrès osmòtic, hem identificat un nou substrat de Hog1,
l’activitat del qual és requereix tan per la iniciació com l’ elongació de la transcripció.
En aquest treball també ens hem centrat en caracteritzar el paper global de Hog1 en la
reorganització del transcriptoma de S. cerevisae en condicions d’ estrès osmòtic. Mitjançant la
combinació de tècniques moleculars amb tècniques de seqüenciació (ChIP-seq, MNase-seq,
Tiling arrays) hem definit el posicionament en el genoma dels components claus que regulen la
transcripció, oferint per primera vegada una visió general del procés de transcripció en
resposta a estrès osmòtic L’alta resolució d’aquestes tècniques ens ha permès identificar noves
dianes transcripcionals de Hog1, com és la regulació d’una altra maquinària transcripcional
(RNA Pol III) i la regulació de la transcripció de una nova classe de RNAs no codificants
(lncRNAs). En conjunt, els resultats presentats en aquesta tesi proporcionen una nova visió
dels mecanismes per els quals Hog1 modula l’expressió gènica
|
Page generated in 0.0666 seconds