Ralstonia solanacearum is a soil-borne beta-proteobacterium that causes wilting disease on a wide range of plants with economic importance like tomato, potato, pepper, eggplant and banana. Each year, bacterial wilt pose important threats to agriculture by producing significant economic losses to small-scale producers in developing countries and, lately, the geographical distribution of the pathogen is spreading to temperate regions of the globe. The long-term aim of the work developed was the determination of the genetic program used by R. solanacearum during plant colonization and at the different stages of disease, in order to provide a biologically relevant understanding of the repression/activation regulatory switches controlling R. solanacearum pathogenicity. We noticed that new molecular tools for functional genetic studies adapted to R. solanacearum were needed, because the widely used mutants obtained bytransposon mutagenesis contain gene disruptions rendering, in some cases, bacteria with affected virulence, pathogenicity and unable to multiply inside susceptible plants. In addition, a common issue in R. solanacearum studies was the difficulty to trans-complement gene disruptions. So far, the only alternative available was the use of plasmids, which provided a means of overexpression rather than stoichiometrical complementation, Moreover, the use of antibiotics to maintain plasmids during plant infection is not an option due to the complexity of the system. In this thesis we developed a novel system – pRC, after Ralstonia chromosome –, based in targeted and stable insertions in a precise and permissive location of the bacterial chromosome. We proposed the use of our versatile set of suicide plasmids for the study of transcriptional output (promoter probing) during plant infection, effector overexpression and purification, and monocopy gene complementation in any R. solanacearum strain. The use of the pRC system in any strain will allow the standardization of the genetic studies made in the field. We also investigated gene activities in planta. To that end, we successfully applied a luminescent reporter in the bacterial chromosome to visualize and quantify in real time the activity of pathogenicity-related promoters. We fused the promoter regions controlling two major virulence determinants to the luxCDABE reporter and followed light emission at different stages of plant infection. This strategy allowed us to establish both the timing and the exact location in the plant where these bacterial genes were expressed. Our main finding was that the T3SS is active throughout plant infection and not only at the first colonization stages. It is likely that during plant infection many overlapping signals are perceived by the bacteria, adding complexity to the gene regulatory model proposed in the literature. Together with the two articles published in peer-review journals, two additional drafts, describing the current progress of two other projects are also provided. The first draft reports a novel regulatory feedback loop governing hrpB expression when R. solanacearum is grown in the presence of plant cells. This work is part of a collaboration with Stéphane Genin (Laboratoire des Interactions Plantes Micro-organismes (LIPM, INRA-CNRS, Castanet Tolosan, France).The second draft reports the use of the pRC system to decipher “cool-adaptation” on strain UW551. This work is part of a collaboration with Caitilyn Allen research group (University of Wisconsin – Madison, Wisconsin, USA). / Ralstonia solanacearum es una bacteria Gram-negativa que causa una enfermedad de plantas conocida como marchitez bacteriana. El espectro de plantas huéspedes afectadas es amplio, incluyendo algunas especies con relevancia económica, como por ejemplo el tomate, la patata, el pimiento, la berenjena y el plátano. El objetivo a transversal de la investigación desarrollada en esta tesis de doctorado es la determinación del programa genético utilizado por R. solanacearum durante diferentes etapas de colonización de las plantas. Describimos un novedoso sistema - pRC, basado en el uso de inserciones específicas y estables en un punto específico del cromosoma bacteriano. Proponemos el uso de nuestra versátil colección de plásmidos suicidas para el estudio de la actividad de promotores de genes de patogenicidad y virulencia, la sobreexpresión y purificación de proteínas efectoras y la complementación de genes. El uso del sistema de pRC en cualquier cepa de R. solanacearum permitirá la estandarización de los estudios genéticos realizados en el campo de investigación. En esta tesis también se describe la utilización un reportero luminiscente, integrado en el genoma de la bacteria para visualizar y cuantificar en tiempo real la actividad de promotores de genes de patogenicidad durante la infección. Esta estrategia nos permitió determinar el momento y el lugar exacto de la planta donde se expresan los genes bacterianos. Nuestro principal hallazgo fue que el sistema de secreción de tipo III se transcribe a lo largo del proceso infeccioso y no sólo en las primeras etapas de colonización. Junto con los dos artículos publicados en revistas internacionales, se incluyen también dos manuscritos, que describen el progreso actual de dos otros proyectos. En el primer manuscrito se describe un nuevo proceso de regulación de la expresión de hrpB, cuando R. solanacearum se cultiva en presencia de las células vegetales. Este trabajo es parte de una colaboración con Stéphane Genin, del “Laboratoire des Plantes Interacciones Microorganismos” (LIPM, INRA-CNRS, Castanet Tolosan, Francia). El segundo proyecto describe el uso del sistema pRC para descifrar la capacidad de infección de la cepa UW551 a temperaturas bajas. Este trabajo es parte de una colaboración con el grupo de investigación de Caitilyn Allen (Universidad de Wisconsin - Madison, Wisconsin, EE.UU.)

Les proteïnes HP1 (Heterocromatin protein 1) estan conservades als eucariotes, on la majoria de les espècies contenen vàries isoformes. A partir de les propietats de l'HP1a de Drosophila, s'ha proposat que les proteïnes HP1 uneixen la metilació de l'H3K9 i recluten factors involucrats en l'ensamblatge de l'heterocromatina i el silenciament. No se sap, però, si aquest model és aplicable a totes les isoformes d'HP1 i tots el contextos funcionals. En aquest article aportem que l'HP1c regula l'expressió gènica, ja que (1) localitza a dominis de cromatina activa, on colocalitza abastament amb la forma pausada de la RNA polimerasa II (RNApolII), PolIIser5, i amb la trimetilació de l'H3K4, suggerint una contribució a la regulació transcripcional; (2) la seva localització ectòpica a un gen reporter no indueix el seu silenciament, ans el contrari, incrementa la seva expressió, i (3) interacciona amb dues proteïnes que contenen varis Zn-fingers, WOC (without children) i ROW (Relative of WOC, que són putatius factors de transcripció. També mostrem que tot i que l'HP1c s'uneix eficientment a la metilació de l'H3K9 in vitro, la seva unió a la cromatina in vivo depèn estrictament de WOC i ROW. A més a més, les anàlisis d'expressió realitzades indiquen que HP1c, WOC i ROW regulen un programa d'expressió gènica comú, el qual és executat en part, en el context del sistema nerviós. A partir d'aquestes dades, que revelen la contribució de factors que uneixen ADN a la funcionalitat i el reclutament de l'HP1c, les proteïnes HP1 emergeixen com una família de proteïnes reguladores de la cromatina cada cop més diversa. / Heterochromatin protein 1 (HP1) proteins are conserved in eukaryotes, with most species containing several isoforms. Based on the properties of Drosophila HP1a, it was proposed that HP1s bind H3K9me2,3 and recruit factors involved in heterochromatin assembly and silencing. Yet, it is unclear whether this general picture applies to all HP1 isoforms and functional contexts. Here, we report that Drosophila HP1c regulates gene expression, as (1) it localizes to active chromatin domains, where it extensively colocalizes with the poised form of RNApolymerase II (RNApol II), Pol IIoser5, and H3K4me3, suggesting a contribution to transcriptional regulation; (2) its targeting to a reporter gene does not induce silencing but, on the contrary, increases its expression, and (3) it interacts with the zinc-finger proteins WOC (without children) and Relative-of-WOC (ROW), which are putative transcription factors. Here, we also show that, although HP1c efficiently binds H3K9me2,3 in vitro, its binding to chromatin strictly depends on both WOC and ROW. Moreover, expression profiling indicates that HP1c, WOC, and ROW regulate a common gene expression program that, in part, is executed in the context of the nervous system. From this study, which unveils the essential contribution of DNA-binding proteins to HP1c functionality and recruitment, HP1 proteins emerge as an increasingly diverse family of chromatin regulators.

L'objectiu general d'aquest treball ha estat l'estudi dels canvis a llarg termini del polimorfisme cromosòmic per inversions de Drosophila subobscura en poblacions europees, i la seva possible relació amb el canvi climàtic global del planeta.El polimorfisme cromosòmic de D. subobscura, constitueix un mecanisme genètic d'adaptació ràpida a l'ambient que dóna a l'espècie una flexibilitat adaptativa, com va posar de manifest el fet que a les poblacions colonitzadores de Nord-amèrica i Sud-amèrica s'establissin clines latitudinals per les freqüències de determinades inversions seguint el mateix patró que les existents a la regió paleàrtica. Per tant és probable que aquest polimorfisme respongui a algun factor o factors ambientals correlacionats amb la latitud, com pot ser la temperatura. Així doncs s'ha volgut comprovar si aquest polimorfisme es pot considerar un bon marcador genètic dels canvis en els ecosistemes tant d'origen natural com provocats per l'acció humana.Es van seleccionar tretze poblacions europees que ja haguessin estat mostrejades com a mínim 15 anys enrera, i es van obtenir les mostres de cadascuna en la mateixa localitat i època de l'any que la mostra antiga. Es va determinar la composició i diversitat d'espècies del gènere Drosophila en dotze de les mostres obtingudes, per tal d'obtenir una estimació de la biodiversitat. Per altra part, es van caracteritzar les poblacions mitjançant les freqüències de les inversions o ordenaments existents en cada cromosoma i per a cada població es va comparar el polimorfisme cromosòmic actual amb el de les mostres antigues. En analitzar la variació en l'espai d'aquest polimorfisme, es va comprovar l'existència de clines latitudinals en les mostres noves, equivalents a les trobades en les mostres antigues. Quan es va estudiar el polimorfisme cromosòmic en les mostres noves es van trobar tres noves inversions (U13, E22 i E23) que no havien estat descrites anteriorment. També es van detectar per primera vegada ordenaments al continent europeu que fins aleshores només s'havien trobat al nord d'Àfrica, a les Canàries i a Madeira. En comparar el polimorfisme entre les mostres noves i velles per cada població es van trobar diferències significatives en les freqüències dels ordenaments per tots els cromosomes excepte pel J. Les diferències significatives d'aquest polimorfisme detectades en l'espai entre poblacions, tant en les mostres antigues com en les noves és deguda a les clines latitudinals que presenten els diversos ordenaments cromosòmics. Es va observar que la distància genètica entre les mostres noves era menor que entre les antigues, la qual cosa indica que les diferències entre poblacions han tendit a fer-se menors al llarg del temps. Es va voler comprovar si a cada població havia disminuït la freqüència d'aquells ordenaments típics de latituds fredes i, de manera corresponent, si havia augmentat la freqüència d'aquells típics de les latituds càlides, a fi i efecte de relacionar aquests canvis amb el possible escalfament global del planeta. El conjunt de totes les poblacions presentava aquesta tendència clarament, i també quan les poblacions s'agrupaven en atlàntiques, mediterrànies i centreeuropees.Es pot concloure que el polimorfisme cromosònic de D. subobscura ha canviat sistemàticament durant els darrers 14 a 47 anys, i que els canvis poden ser deguts a canivs en factors climàtics correlacionats amb la latitud, molt probablement la temperatura.

Scp160 és una proteïna de Saccharomyces cerevisiae que conté 14 dominis KH de tipus I, un domini conservat present en un gran nombre de proteïnes. Scp160 presenta homologia amb la proteïna de metazous coneguda com a vigilina. Aquestes proteïnes es troben conservades en el grup dels fongs i els metazous. Les vigilines han sigut associades en diferents processos cel·lulars entre els que cal destacar: la regulació general de la síntesi proteica, la estabilització de mRNAs específics i la contribució a la segregació dels cromosomes en mitosi.La vigilina de Drosophila melanogaster, la proteïna DDP1, va ser aïllada en el nostre laboratori com una proteïna associada a la heterocromatina pericentromèrica d'aquest organisme. Donada la conservació d'aquestes proteïnes entre els fongs i els metazous ens em plantegat l'estudi de la possible contribució de la proteïna Scp160 en la formació i manteniment de la heterocromatina de S. Cerevisiae.Les cèl·lules mutants scp160 presenten, en ser analitzades per FACS, nivells de ploidia aberrants suggerint la presencia de problemes en el procés de segregació cromosómica d'aquestes cèl·lules. Consistent amb la presencia de alteracions en al procés de segregació cromosòmica les cèl·lules scp160 presenten hipersensibilitat a drogues desestabilitzadores de microtubuls com el benomyl. La expressió de la proteïna DDP1 de forma ectópica en cèl·lules de S. Cerevisiae es capaç de complementar la manca de la proteïna Scp160 indicant que ambdues proteïnes no només són homòlegs estructurals, sinó que també són homòlegs funcionals.Per tal de analitzar la contribució de la proteïna Scp160 a la estructuració de la heterocromatina als diferents loci silenciats que hi ha en el genoma de S. Cerevisiae, per això hem realitzat la deleció del gen SCP160 en soques que portaven marcadors inserits en les regions telomèriques, els locus silenciats del mating type i el locus del rDNA, observant-se que la deleció del gen SCP160 es comporta com un supressor de variegació en les seqüències telomèriques i en el locus del mating type, preo no té cap efecte en el silenciament del locus del rDNA.Consistent amb el efecte de desrepresió observat en les seqüències telomèriques la mutació scp160 presenta una desregulació en la longitud de les seqüències telomèriques, suggerint una implicació d'aquesta proteïna en el manteniment d'aquestes seqüències.Per tal de aprofundir en el defecte de silenciament que presenten les cèl·lules mutants scp160 hem estudiat mitjançant CHIP la presència de la proteïna Sir3 en les regions telomèriques de les cèl·lules mutants, observant-se una disminució significativa dels nivells de Sir3 en comparació amb cèl·lules wild type. Consistent amb aquest efecte la sobreexpresió de la proteïna Sir3 es capaç de recuperar la pèrdua de silenciament telomèric observat en les cèl·lules scp160. Així mateix el fenotip de desrepresió associat a la deleció del gen SCP160 no s'estableix en cèl·lules que sobreexpressen Sir3 o que presenten mutacions que reforcen el silenciament telomèric, com la mutació de la histona desacetilasa Rpd3 o de les proteïnes telomèriques Rif1 i Rif2.Tots aquest resultats no ens permeten discernir entre una implicació directa de la proteïna Scp160 en aquest processos o una acció indirecta deguda a la regulació d'altres processos cel·lulars. La proteïna Scp160 presenta una localització perinuclear compatible amb la presència d'aquesta proteïna a les seqüències heterocromàtiques de S. Cerevisiae, però no ha pogut ser localitzada en les regions telomèriques d'aquest organisme mitjançant CHIP. Són necessaris estudis posteriors per a determinar la presència d'aquesta proteïna en les regions heterocromàtiques d'aquest organisme.ENGLISH / Vigilins are highly conserved proteins found in fungi and metazoan. Vigilins contains 14-15 KH domains, a protein domain involved in single stranded nucleic acids binding.Drosophila melanogaster vigilin, the protein DDP1, was isolated in our lab as a protein associated with pericentric heterochromatin. As these proteins are conserved among fungi and metazoan, we wanted to study the possible implication of Scp160, Saccharomyces cerevisiae vigilin, in the formation and maintenance of heterochromatin.Mutants cells scp160 shows aberrant DNA content upon analysis with FACS. Consistent with alterations in the chromosome segregation process, these cells show hypersensitivity to benomyl, a microtubule depolymerising drug. Ectopic expression of Drosophila DDP1 in yeast cells was able to complement scp160 mutation in yeast. In order to analyse the contribution of Scp160 to heterochromatin formation we have deletes SCP160 gene in strains bearing markers at different loci that are silenced in the Saccharomyces cerevisiae genome: telomeric regions, mating type locus and rDNA locus. We have seen that SCP160 deletion behaves like a suppressor of variegation in telomeric and mating type region, but not in rDNA region.Scp160 protein shows perinuclear localization compatible with its presence in heterochromatic regions, but we could not detect this protein in the telomeric regions by chromatin immunoprecipitation experiments.

Les Metal·lotioneïnes (MTs) configuren una família de proteïnes de baix pes molecular àmpliament distribuïdes entre els éssers vius (des dels protozous i plantes als metazous), riques en cisteïnes (Cys), que uneixen metalls pesants com el Zn, Cu, Cd, Hg,... Tot i que se'ls ha atribuit un paper en la detoxificació metàl.lica, i se n'ha estudiat estructuralment alguns dels seus membres (principalment MTs de vertebrats i fongs) es coneix poc quina és la relació estructura-funció en aquestes MT, i queden encara molts àmbits funcionals per explorar. Aquesta tesi té per objectiu estudiar la relació entre la estructura i la funció de MTs d'Invertebrats, Protozous i Plantes. Amb aquest objectiu s'ha estudiat el comportament coordinatiu les MT de diversos organismes model per a les MT.Les MT estudiades s'han estat sintetitzat heteròlogament en medis rics en Zn, Cd o Cu, i els agregats metall-MT obtinguts han estat analitzats mitjançant diverses tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ICP-AES, ESI-MS, CD, UV, Raman, IR, GC-FPD) i valoracions in vitro de substitució del Zn per Cd o Cu. Quan ha estat necessari, s'han construit formes quimèriques de les MT mitjançant teconologies d'ADN recombinant. Amb aquestes dades s'ha descrit el comportament coordinatiu de cada MT, que s'ha posat en relació amb dades estructurals i/o funcionals. Les MT MTNA, MTNB, MTNC i MTND de Drosophila melanogaster mostren preferència coordinativa per el Cu, tot i que les 3 darreres semblen tenir especificitat funcional per el Cd. La MT de la planta Quercus suber (QsMT) presenta dos dominis cisteínics separats per un espaiador, i elements d'estructura secundària. L'estudi de quimeres de QsMT demostra que l'espaiador participa en la detoxificació in vivo de Cd i Cu en llevats, i en la unió de Cd mitjançant un residu histidina. La MT CeMT2 de Caenorhabditis elegans presenta preferència coordinativa per el Zn. L'estudi de formes mutades indica que CeMT2 és capaç de formar dímers mitjançant la seva His situada a C-terminal, i que el seu plegament no es dòna en dos dominis 9Cys+9Cys en coordinar Zn o Cu. La MT TpMT1 de Tetrahymena pyriformis presenta preferència coordinativa per els metalls divalents, presenta resistència a substituir el Zn per Cd o Cu, i conté elements d'estructura secundària del tipus hèlix alfa en agregats amb Zn o Cd. La MT MT-10-IV de Mytilus edulis presenta un comportament coordinatiu compatible amb un rol homeostàtic, més que no pas amb un paper detoxificador, més atribuible a la seva subfamília homòloga, MT-20. La MT SpMTA de Strongylocentrotus purpuratus presenta propietats funcionals molt diferenciades respecte les MT de mamífer, tot i assemblar-s'hi molt des d'un punt de vista estructural: SpMTA mostra especificitats funcionals envers el Cu, que l'asocien a un paper homeostàtic més que no pas detoxificador. L'estudi d'aquests agregats ha permès també descriure que en la coordinació metàl.lica en MTs i la determinació de les propietats funcionals, a més de la cisteïna, hi intervenen també altre lligands (per exemple, histidina i ions clorur) i nivells estructurals (estructures secundària i quaternària). A més, els anàlisis amb GC-FPD han permès detectar per primer cop la presència de ions sulfur en agregats metall-MT. Des d'un punt de vista metodològic, aquesta tesi ha aportat al camp de recerca nous procediments (com l'ICP-AES àcid, la detecció de dímers per ESI-MS i les covaloracions) i tècniques (com l'estudi de l'estructura mitjançant Raman i IR, i la mesura i detecció de ions sulfur en agregats metall-MT mitjançant tinció de plata, GC-FPD, CD, UV i Raman). / "STUDY OF THE STRUCTURE-FUNCTION RELATIONSHIP IN METALLOTHIONEINS OF INVERTEBRATES, PROTOZOANS AND PLANTS."TEXT:Metallothioneins (MTs) are widely-distributed, low molecular weight, Cys-rich proteins, which present the ability to bind heavy metals (Zn, Cd, Cu, Hg,...)Most of the studies have been centred on their detoxification-role and the structural features of vertebrate and fungal members of this family. The goal of this PhD thesis is to study the structure-function relationship in MTs from Invertebrates, Protozoans and Plants, MT groups traditionally ignored from the functional and structural points of view.The coordinative behaviour of several MTs of these groups has been studied by means of heterologous synthesis of metal-MT aggregates in Zn, Cd, or Cu-rich media and subsequent characterization of the in vivo-synthesized purified aggregates (ICP-AES, ESI-MS, CD, UV, Raman, IR, GC-FPD) and titrations with Cu+ or Cd2+ ions. The MT-forms studied in this thesis are D.melanogaster MTNA, MTNB, MTNC, MTND, Q.suber QsMT, C.elegans CeMT2, M.edulis MT-10 IV, T.pyriformis TpMT1, S.purpuratus SpMTA, and some chimerical forms of these MTs, generated by recombinant DNA techniques.The study of the aggregates obtained have demonstrated that other factors than cystein amount and distribution are of importance in the determination of the functional properties, both at the metal-binding (histidine, clorur ions) and structural (secondary and quaternary structures) levels. Moreover, GC-FPD analyses have allowed detecting for the first time the presence of sulphide ions in metal-MT aggregates. This grows unexpectedly the functional and structural possibilities of the MT family. From a methodological point of view, this thesis have generated new analysis processes (as the acid ICP-AES, the detection of MT-dimeric forms or the co-titrations) and technical possibilities (as the structural study by means of Raman and IR spectroscopies or the measurement and detection of sulphide ions in Metal-MT aggregates by Ag staining, GC-FPD, CD. UV and Raman).

/Tesi realitzada al Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona (CMRB) / IPSC are potent tools in the creation of disease models for both basic studies on the disease and testing of potential therapeutical drugs. In this context, it has been developed the derivation of iPSC from patient fibroblasts suffering from Gaucher Disease (GD) or Tay Sachs disease (TS). GD is a recessive autosomic disease which is characterized by the deficiency of the enzyme called glucocerebrosidase (GBA), which leads to the accumulation of its substrate glucosylceramide in macrophages and neurons. This disease has 3 forms of clinical presentation: type I, which is systemic; type II, the most severe with a neuronopathic acute presentation; type III, which is a combination of the former two, but without the severity of the type II. Tay Sachs is an autosomic recessive disease which is characterized by the Hexosaminidase A (HexA) deficiency, which leads to GM2 accumulation on the lysosomes of neurons. Patients present neurodegeneration and severe impairment of the brain which ultimately leads to their death. In this project iPSC derived from GD and TS patient fibroblasts. Pluripotent state of the derived iPSC has been characterized. Later, iPSC have been differentiated to neurons in order to confirm the disease phenotype on the in vitro differentiated tissue. In GD the phenotype was corroborated by enzymatic assays and GBA detection by Western blot. A lower GBA activity on GD neurons compared to WT was found, consistent with the minor GBA levels in GD neurons detected in the western blot. In TS, derived neurons were analyzed by immunofluorescence for Lamp2 (lysosome marker), observing an increase in size and number on the TS neurons in contrast to WT. Also, TS neurons were analyzed by transmission electron microscopy, presenting membranous lamellar bodies in the cytosol of TS. Both iPSC diseases have been used as a platform for testing therapeutical drugs efficiency on the iPSC derived neurons. / Las iPS (células pluripotentes inducidas) se han revelado como potentes herramientas en la creación de modelos de enfermedades humanas para su estudio y el testeo de potenciales drogas. En este marco hemos desarrollado un proyecto para derivar iPS de fibroblastos de pacientes de Gaucher y Tay Sachs, ambas enfermedades monogénicas recesivas. La enfermedad de Gaucher se caracteriza por la deficiencia de la glucocerebrosidasa (GBA), lo que conlleva la acumulación de su substrato, la glucosilceramida, en macrófagos y neuronas. Esta enfermedad tiene tres presentaciones I, que es sistémica; II, que es una forma neuronopática aguda, tiene efectos fatales ya que los pacientes rara vez sobreviven a los dos años de edad; y III, que es una mezcla de las dos anteriores, siendo neuronopática crónica, sin llegar a la severidad del tipo II. Tay Sachs es una enfermedad que se caracteriza por la deficiencia de la Hexosaminidasa A (HexA) lo que conlleva el almacenamiento en el lisosoma del gangliósido GM2. Los pacientes de esta enfermedad presentan daños neurológicos, provocando la muerte en la mayoría de los casos. En este proyecto se han desarrollado las iPS derivadas de fibroblastos de un paciente de Gaucher tipo II, y de otro de Tay Sachs. Las iPS resultantes de ambas enfermedades han sido caracterizadas para constatar su estado pluripotente y diferenciadas a neuronas para comprobar que presentan el fenotipo característico de las enfermedades. En el caso de Gaucher, mediante ensayos enzimáticos y detección de la GBA1 por western blot, detectando una menor actividad en las neuronas gaucher que en las WT, lo que es consecuente con la menor cantidad de GBA1 detectada. En el caso de Tay Sachs, las neuronas se han analizado mediante inmunohistoquímica, marcando Lamp2, típico de lisosomas y se ha observado un aumento de tamaño y cantidad respecto de las células WT diferenciadas en paralelo. También han sido analizadas por microscopía electrónica, presentando una acumulación de cuerpos laminares en los lisosomas y aumento de número y tamaño de éstos. Ambas enfermedades han sido utilizadas como modelos para probar compuestos en las neuronas derivadas de las iPS derivadas de fibroblastos del paciente y comprobar su eficacia.

Las señales receptor tirosina kinasa (RTK) controlan un amplio abanico de decisiones durante el desarrollo de un animal, como la proliferación celular, diferenciación, morfogénesis y supervivencia. Muchas de estas señales se transducen a través de la cascada de Ras-MAPK que en última instancia fosforilan un factor de transcripción regulando la expresión de distintos genes. Los mecanismos moleculares por los que la señalización por RTKs inducen repuestas tan diversas permanecen aún sin esclarecer. Los efectores de la vía más estudiados en Drosophila son Pointed y Yan donde en ausencia de señalización, los genes diana se mantienen reprimidos por Yan, mientras que la actividad de la vía fosforila Pointed y Yan, resultando en la activación transcripcional a través de la asociación de Pointed al ADN. Estudios más recientes han mostrado que otro de los factores fosforilado por la vía es Capicua (Cic). Cic es un represor materno que es fosforilado por la MAPK y esta fosforilación dirige la desactivación de la proteína. En este trabajo, hemos mostrado que las secuencias de unión a Cic en sus genes diana representan un mecanismo general de interpretación de la señal por Ras-MAPK. Hemos descrito el mecanismo por el que la vía de Torso regula los genes huckebein (hkb) y tailless (tll) a través de la desactivación de Cic en los polos del embrión en el estadio de blastodermo sincitial. La expresión restringida de tll y hkb a los polos del embrión por la proteína Cic, permite la expresión de genes del tronco para la correcta segmentación del eje A/P del animal. Además, hemos definido una nueva diana de Cic en el eje dorsoventral (D/V) del embrión, intermediate neuroblast defective (ind), que alberga la función de diferenciar la células que dan lugar a los neuroblastos intermedios del sistema nervioso central. Experimentos adicionales nos han permitido describir el mecanismo por el que Cic regula el gen argos en repuesta a la señalización por EGFR, en el disco imaginal de ala. En este contexto, al contrario que en los casos del embrión, la desactivación de la proteína Cic en respuesta a la vía de EGFR no es el único mecanismo por el que se induce el gen diana. Trabajos posteriores tendrán que explicar esta red de regulaciones más compleja. Además de la identificación de la secuencia de unión de Cic a los elementos reguladores de sus genes diana, hemos estudiado el papel del correpresor Groucho (Gro) en la regulación de hkb. Trabajos anteriores habían implicado a Gro en la regulación de los genes hkb y tll ya que embriones mutantes para gro muestran un patrón expandido de estos genes terminales. Este patrón, es muy similar al que se observa en embriones mutantes cic por lo que se ha sugerido que Gro podría actuar junto a Cic para la regulación de hkb y tll. Nosotros hemos podido demostrar que los lugares de unión de Cic en el enhancer de hkb son importantes para reclutar Gro al ADN. Este resultado nos indica que Gro está actuando a través de Cic para mediar la represión y no a través de otro factor que también pudiera regular la expresión de hkb. La señalización por EGFR en las células dorsoanteriores del ovario está implicada en el establecimiento del eje D/V a través de la represión del gen pipe (pip) en esta región. Nosotros hemos podido demostrar que esta regulación ocurre de manera análoga a la del embrión. Cic reprime los represores inducidos por la vía de señalización, Tll y Mirror (Mirr) en el embrión y ovario respectivamente, para posibilitar la expresión de sus genes diana, Kruppel (Kr) y pip, y así determinar las regiones que les corresponden como el tronco en el embrión y la región ventral en el ovario. Por otro lado hemos descrito un nuevo mecanismo por el que los substratos de la MAPK compiten entre ellos por la fosforilación por debajo de la vía de Torso. Así, hemos explicado la razón por la que aún habiendo más MAPK fosforilada en el polo anterior del embrión, existe una menor desactivación de Cic y cómo este efecto puede afectar la regulación de los genes diana. / The function of Capicua repressor in the interpretation of RTK-Ras-MAPK signaling in Drosophila Receptor tyrosine kinase (RTK) signaling pathways control multiple decisions during Drosophila development such as proliferation, differentiation, morphogenesis, and survival. Many RTKs signal through the very well conserved Ras-MAPK cassette that ultimately phosphorylate a nuclear factor altering the transcriptional output in many different contexts. The molecular mechanisms that lead to so many different outputs are still under study. In this work we have analyzed the molecular mechanism by which Capicua (Cic), a recently described downstream repressor of the pathway, regulates gene expression in different contexts. We found that the Cic binding sites represent a general mechanism of Ras-MAPK signaling interpretation. Cic is downregulated in the cells with active signaling pathway alleviating the repression on its target genes. In the cells with no active signaling, Cic is repressing its targets localizing their expression to restricted patterns. We showed that Cic regulates huckebein (hkb) and tailless (tll) expression at the poles of the blastoderm embryo allowing a correct A/P axis formation. hkb regulation by Cic requires the association to the global co-repressor Gro. We also found that Cic regulates intermediate neuroblast defective (ind) gene in the D/V axis of the embryo for the intermediate neuroblast formation and it regulates argos (aos) gene expression in the wing imaginal disc for a stereotyped wing vein pattern formation. We also showed that the mechanism by which the EGFR signaling pathway restricts pipe (pip) expression to the ventral follicle cells of the ovary is analogous to that occurring in the embryo: Cic restricts mirr expression to the cells with active EGFR signaling in the dorsoanterior follicle cells to allow the expression of its target, pip, in the ventral region. Finally, we also showed a novel mechanism by which MAPK substrates compete for the phosphorylation, and this mechanism explains why in the anterior pole of the embryo, containing higher concentration of phosphorylated MAPK, Cic protein concentration is higher.

Mi trabajo de tesis está compuesto por dos estudios diferenciados. Por un lado, el análisis molecular de la Osteocondromatosis Múltiple (MO) en pacientes españoles y latinoamericanos. El uso combinado de dos métodos complementarios en la búsqueda de mutaciones (detección de la dosis génica y análisis de la secuencia de ADN) ha permitido descubrir la causa de MO en el 95% de los pacientes españoles y en el 83% de los pacientes latinoamericanos analizados. Se han genotipado los exones y las regiones intrónicas flanqueantes de los genes causantes de la MO, EXT1 y EXT2, en 39 pacientes españoles y 27 latinoamericanos. Se ha identificado la mutación causal en 37 de los pacientes españoles, 29 en EXT1 y 8 en EXT2, 18 de las cuales no habían sido descritas previamente. Tras el análisis mutacional en los pacientes latinoamericanos se ha identificado la mutación causal en 18 de ellos. El análisis mediante MLPA ha permitido descubrir mutaciones de tipo mosaico y se ha confirmado que este tipo de mutaciones también pueden dar lugar a MO. También se ha realizado un estudio de la correlación genotipo-fenotipo en estos pacientes. Este estudio ha permitido determinar que los pacientes españoles con mutaciones missense tienen menor número de osteocondromas que los pacientes con otro tipo de mutaciones. En los pacientes latinoamericanos no se ha podido establecer ninguna correlación entre el grado de severidad de la MO y el gen mutado. Por otra parte, mi tesis aborda el estudio genético molecular del fenotipo alta masa ósea (HBM) en probandos españolas. Se encontraron 13 casos con este fenotipo en los que se analizaron los exones relevantes del gen LRP5, descrito como causante de la HBM y de su inhibidor DKK1. No se encontraron mutaciones en las regiones analizadas del gen LRP5. En una probando con HBM se ha identificado un cambio missense en DKK1 (p.Y74F), no descrito previamente, que podría ser la causa del fenotipo. Se realizó un estudio de 55 loci autosómicos asociados con la densidad mineral ósea (DMO) para comprobar si las probandos tienen un mayor número de alelos protectores frente a la pérdida de masa ósea. En la mayoría de los casos de HBM estudiados, los niveles de DMO se distribuyen inversamente al número de alelos de riesgo de osteoporosis. El único caso en el que esto no se cumple es el que presenta el mayor valor de Z-score y su alta masa ósea podría explicarse por una variante genética rara y penetrante. Por otro lado, se pudo disponer de osteoblastos primarios de dos probandos con HBM y de 5 muestras control y se realizó un análisis transcriptómico de estas células para analizar la expresión diferencial de genes relevantes en el metabolismo óseo en este tipo celular. En el estudio de expresión en osteoblastos primarios se ha observado una correlación negativa entre el valor de Z-score y la expresión de IL6R, DLX3, TWIST1 y PPARG. Este estudio transcriptómico apunta a que tanto un aumento en los niveles de RUNX2 como una disminución en la cantidad de SOX6 podrían tener un papel en algunos casos de HBM. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se propone un modelo de heterogeneidad genética para la HBM, en la que hay casos debidos a efectos pequeños y aditivos de diversos genes y otros causados principalmente por mutaciones en un único gen. / There are two different studies that compose my thesis. The first one is a molecular analysis of multiple osteochondromas (MO) in Spanish and Latin American patients. MO is a genetically heterogeneous disease caused by mutations in two genes: EXT1 and EXT2. On sequencing all exons and flanking regions of those two genes in the samples of 39 unrelated patients, 37 pathogenic mutations were identified. Twenty-nine different mutations were found in the EXT1 gene, while 8 were found in EXT2. Eighteen out of the 37 mutations were novel. After the mutational analysis in Latin American patients the causative mutation in 18 of them has been identified. MLPA analysis has revealed mosaic mutations and it has been confirmed that such mutations can also lead to MO. Also a study of genotype-phenotype correlation in these patients was made. On the second one, my thesis addresses the molecular genetic study of high bone mass phenotype (HBM). Thirteen cases were found with this phenotype and the relevant exons of LRP5, described as HBM causative gene, and DKK1, that is LRP5 inhibitor, were sequenced. No mutations in the relevant exons of LRP5 were found. A rare missense change in DKK1 was found in one woman (p.Y74F). Fifty-five BMD SNPs were genotyped in the HBM cases to obtain risk scores for each individual. Z-scores were negatively correlated with these risk scores, with a single exception, which may be explained by a rare penetrant genetic variant. An expression analysis in primary osteoblasts from two HBM cases and five controls was carried out. It showed that IL6R, DLX3, TWIST1 and PPARG were negatively related to Z-score. One HBM case presented with high levels of RUNX2, while the other displayed very low SOX6. In conclusion, we provide evidence of heterogeneity and the additive effects of several genes for the HBM phenotype.

This thesis studies a group of aquatic beetles (Agabus brunneus complex) that present important differences in the size of their geographic ranges. This complex is composed by an insular species (A. rufulus), a continental species with restricted range (A. ramblae) and another continental species (A. brunneus) that posses a wide range of distribution (A. brunneus) with the aim of study the factors implied in those differences. For this purpose we integrated the phylogeny/ phylogeography of the group and the evolution of the ecological niche together with morphological study and thermal tolerance of species. This complex of species diversified at the end of Pleistocene in Iberian Peninsula probably after the colonization of A. ramblae from Morocco. One of the resultant species (A. brunneus) at some point of the diversification acquired the ability to resist colder temperatures and was able to disperse to colder climates. To understand range variability from another perspective we used population proteomics to analyse the response of several populations for A. ramblae and A. bruneus facing temperatures that they might experience on field. We decided to analyse the variability at several levels in two populations of (A. ramblae) when working with natural populations obtaining satisfactory results for the reproducibility of our experimental methodology. When we analysed globally two populations for each species (one from Morocco and one from Iberian peninsula for each) we saw that the diversification observed in the phylogeny was encompassed with changes at the proteomic response. The more common proteins identified belong to energetic metabolism and stress proteins. The latter were detected to express differentially between the two species studied, showing a different response to thermal stress. This work address the possibility of employing population proteomics in natural populations of non-model species and being able of recovering the stress response facing an environmental factor like temperature. We show as well that differences in range size can be encompassing with the acquisition of capacity to face thermal stress. / Esta tesis parte del estudio de un grupo de especies de escarabajos acuáticos (Agabus brunneus complex) que poseen diferencias importantes en el tamaño de sus rangos geográficos, contando con una especie insular (A. rufulus), una continental de rango restringido (A. ramblae) y una continental de rango amplio (A. brunneus) para estudiar los factores implicados en esas diferencias. Este complejo de especies diversificó a finales del Pleistoceno en la península ibérica posiblemente tras la colonización de A. ramblae desde Marruecos. Una de las especies resultantes A. brunneus en algún momento de la diversificación desarrolló la capacidad de resistencia a bajas temperaturas lo que le facilitó el poder extender su rango hacia climas más fríos. Se empleó la proteómica de poblaciones para analizar la respuesta de varias poblaciones de A. brunneus y A. ramblae frente a temperaturas que pueden experimentar en la naturaleza. Al estudiar la variabilidad a distintos niveles entre dos poblaciones naturales de A. ramblae obtuvimos una buena reproducibilidad de nuestros experimentos. Al analizar de forma global dos poblaciones para cada especie (Marruecos y península ibérica para ambas) descubrimos que la diversificación de la filogenia ha ido acompañada de cambios en la respuesta a nivel de expresión proteínica. La mayoría de las proteínas identificadas están relacionadas con el metabolismo energético y con proteínas del estrés, estas últimas se expresan diferencialmente entre las dos especies analizadas, indicando una diferente respuesta al estrés térmico. El presente trabajo abre la posibilidad de realizar este tipo de experimentos empleando poblaciones naturales de especies no modelo y demuestra que la respuesta frente al estrés de un factor ambiental, en este caso la temperatura, puede recuperarse empleando para ello la proteómica. Así mismo las diferencias en el tamaño del rango pueden ir acompañadas de la adquisición de distinta capacidad de respuesta frente al estrés térmico.

Sanfilippo C syndrome is a lysosomal storage disorder that presents an autosomal recessive inheritance pattern and is caused by mutations in the HGSNAT gene, identified in 2006 in the chromosome 8. This gene codes for a lysosomal transmembrane protein, acetyl-CoA α-glucosaminide N-acetyltransferase, which acetylates the terminal glucosamine in the heparan sulfate chain during its degradation, a crucial step previous to the action of the next enzyme of the pathway. Heparan sulfate is a glycosaminoglycan localized in the extracellular matrix being part of proteoglycans and participate in several and important cellular processes. The HGSNAT protein dysfunction promotes the storage of partially degraded heparan sulfate chains inside the lysosomes, causing an alteration in many different cellular processes and affecting especially neurons. This fact promotes the progressive and severe neurodegeneration that appears during childhood as the main phenotypic feature in patients. This thesis represents an important study on the molecular basis of Sanfilippo C syndrome. Firstly, a mutational analysis has been performed, identifying the mutations causing the disease in 15 patients from different origins. A total of 13 different mutations have been found, seven of which were not previously described. The pathogenicity of four missense mutations identified has been proved by measuring the enzyme activity after in vitro expression of the proteins. Also, the pathogenicity of five mutations affecting different conserved splice sites has been demonstrated since they were shown to alter the splicing process. It has been established that two prevalent mutations in Spanish patients accounts for almost the 70% of the total and, using a haplotype analysis, a single origin for each of them has been suggested. Secondly, some therapeutic approaches have been tested, as a first step in the pursuit of an effective therapy that to date does not exist for this disease. The use of modified U1 snRNAs that present a higher complementarity to the mutated splice site sequences than the wild type U1 snRNA has been proved to partially restore the normal splicing process for one of the splicing mutations analyzed. In the case of missense mutations or mutations that result in the loss of some amino acids, this work suggests the possibility to use glucosamine as a chaperone to prevent the incorrect folding of the protein and to facilitate the trafficking process of the protein from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. Finally, the use of siRNAs to inhibit important genes in the heparan sulfate synthetic pathway, specifically the EXTL genes, has been suggested as a possible substrate reduction therapy, with the best results obtained on the inhibiton of EXTL2 expression. Finally, during this thesis, a neuronal model for Sanfilippo C syndrome has been obtained. This represents an important progress in the study of this disease since to date, neither cellular nor animal model exists. To achieve this goal, fibroblasts from two different Sanfilippo C patients have been reprogrammed to produce induced pluripotent cells that later have been differentiated to neurons. It has been demonstrated that these neurons present the typical phenotypic features of the disease such as the lack of enzyme activity, the heparan sulfate storage, the increased size and number of lysosomes, an alteration in the autophagy process and an increase in the number of apoptotic cells. Using specific experiments to study the neuronal activity in these cultures, a progressive decrease in the patients’ neurons activity and problems in the maintenance of the developed neuronal networks has been detected. This model will be a good platform to study profoundly the molecular, cellular and brain basis of the disease and to develop and test different therapeutic approaches for Sanfilippo C syndrome in the cellular type most affected in patients. / La síndrome de Sanfilippo és una malaltia monogènica hereditària que presenta una severa i progressiva neurodegeneració que s’inicia durant els primers anys de vida dels pacients. Està causada per mutacions en el gen HGSNAT, identificat l’any 2006 en el cromosoma 8, el qual codifica per l’enzim acetil-CoA α-glucosaminida N-acetiltransferasa, una proteïna de membrana lisosomal. La seva funció és acetilar les glucosamines terminals de les cadenes de heparà sulfat que estan sent degradades. Quan la proteïna està mutada, es promou l’acumulació de cadenes d’heparà sulfat parcialment degradades en els lisosomes, les quals augmenten en nombre i mida, provocant la seva disfunció. Per aquesta raó, la síndrome de Sanfilippo es classifica com a malaltia d’acumulació lisosòmica, en concret com a una mucopolisacaridosi, degut a la naturalesa del substrat acumulat. L’heparà sulfat és un dels glicosaminoglicans, anteriorment coneguts com a mucopolisacàrids, que es troba en la matriu extracel·lular formant part dels proteoglicans. Aquestes molècules participen en diferents i importants funcions cel·lulars com ara la migració i l’adhesió. La desregulació de la seva homeòstasi provoca una disfunció de múltiples processos cel·lulars. Aquesta tesi contribueix de manera important a l’estudi molecular de la malaltia. S’ha portat a terme un anàlisi mutacional i la conseqüent caracterització de les mutacions identificades per tal d’aprofundir en el coneixement de la malaltia. Per altra banda, s’han provat diferents possibles aproximacions terapèutiques com un primer pas en l’obtenció d’una teràpia exitosa per a aquesta devastadora malaltia neurodegenerativa per la qual encara no hi ha un tractament efectiu. Finalment, s’ha generat un model neuronal utilitzant cèl·lules mare pluripotents induïdes. Aquest model serà d’utilitat per estudiar i entendre els processos moleculars i cel·lulars que contribueixen al desenvolupament de la malaltia a nivell de la neurona i representarà una ajuda molt valuosa en la cerca de tractaments efectius.