Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB - CSIC) / La ciencia básica ha de engarzarse con las necesidades sociales. Así, nuestro laboratorio esta involucrado en identificar genes específicamente modulados durante el proceso de cicatrización mediante estudios transcriptómicos en colaboración con diversos grupos. En esta línea, en esta Tesis se han perseguido una serie de objetivos concretos: 1) Realización de un análisis funcional de nuevos genes implicados en cicatrización (discos imaginales). 2) Comparación de los genes identificados en cicatrización en Drosophila con genes identificados en modelos de cicatrización en vertebrados. Más en detalle: • Estudio y descripción de la cicatrización en discos imaginales de Drosophila in vitro. • Identificación de genes cuya expresión cambia en las células activas en el proceso de cicatrización. • Caracterización fenotípica de genes que afectan al proceso de cicatrización (definición de categorías fenotípicas) • Caracterización detallada de un subset de genes involucrados en la regulación del proceso de cicatrización • Identificación de reguladores de cicatrización conservados en la filogenia. • Análisis del papel del citoesqueleto de actina en el proceso de cicatrización (el papel del complejo TCP1 (una chaperonina esencial) • Exploración del papel del complejo TCP1 en la regulación del citoesqueleto de actina y tubulina A lo largo de este trabajo hemos alcanzado las siguientes conclusiones: 1. La cicatrización in vitro requiere la actividad de la cascada de señalización de la JNK que controla la formación de contactos transitorios entre los epitelios 2. Han sido identificados una serie de nuevos genes modulados transcripcionalmente durante el proceso de cicatrización. 3. El análisis por interferencia o sobreexpresión de estos genes ha permitido identificar aquellos funcionalmente relevantes en la fusión de los discos imaginales y en la reparación del tejido imaginal. 4. El agrupamiento fenotípico de estos genes ha permitido definir a nivel celular las etapas requeridas para la reparación precisa de los discos imaginales. 5. Las clases principales de genes involucrados en el proceso de cicatrización son las de los reguladores del citoesqueleto de actina y transductores de señales. 6. La caracterización funcional de un subset de genes involucrados en cicatrización analizando marcadores específicos ha permitido definir la red de interacciones entre ellos y su coordinación espaciotemporal. 7. El complejo TCP1 es esencial para la cicatrización de los discos imaginales. 8. La interferencia en la expresión de distintas subunidades del complejo TCP1 demuestra su papel en la fusión de discos imaginales, cicatrización y control del citoesqueleto (actina y tubulina) en Drosophila. 9. Estudios comparativos entre Drosophila y vertebrados a nivel transcriptómico ha permitido identificar una serie de genes conservados entre distintos phila y regulados a nivel transcripcional durante la cicatrización. 10. Análisis funcionales de estos genes demuestran un papel conservado a lo largo de la filogenia apuntando a candidatos potenciales para estudios translacionales.

La MCH es una de las enfermedades cardíacas hereditarias más comunes. La complejidad clínica que caracteriza a la MCH tiene su base en su heterogeneidad genética. Tras varios años de investigación, la identificación de mutaciones en 13 genes que codifican proteínas del sarcómero ha llevado a la definición de la MCH primaria como una enfermedad del sarcómero. Las mutaciones en los genes MYBPC3 y MYH7 están involucrados en la génesis de la enfermedad en aproximadamente la mitad de los pacientes índice con MCH, mientras que las mutaciones en los genes TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2 y MYL3 suponen entre un 1 a un 5% de los casos. Dada la dificultad de predecir el riesgo de eventos adversos, como la MS, a partir de los datos clínicos, la investigación genética ha perseguido desde el principio determinar la relación entre el gen mutado o el tipo de mutación y la evolución de la enfermedad. Una correlación entre el genotipo y el fenotipo bien demostrada tendría implicaciones muy importantes para el tratamiento y la prevención de los eventos adversos en estos pacientes. Así en último término, los estudios moleculares y su correlación genotipo-fenotipo podrían ser herramientas útiles para ayudar al cardiólogo a tomar decisiones sobre los tratamientos a aplicar y el seguimiento individualizado de afectados y portadores asintomáticos. A pesar de los avances en el campo de la Genética, en la actualidad no hay consenso definitivo sobre el grado de determinismo asignable a las mutaciones conocidas en los diferentes genes. Por tanto, son necesarios estudios poblacionales con grandes series de pacientes a partir de los cuales poder establecer conclusiones definitivas sobre la relación genotipo-fenotipo. La información sobre genotipo-fenotipo y pronóstico de las diferentes mutaciones en el gen de la troponina T (TNNT2) es escasa y en ocasiones contradictoria, por su baja prevalencia (3-5%) en las series publicadas. Clásicamente se han relacionado las mutaciones en TNNT2 con un alto riesgo de muerte súbita (MS) en jóvenes con HVI leve. En consonancia con todo lo expuesto nos propusimos los objetivos de esta Tesis Doctoral: 1. Estudiar la penetrancia de la miocardiopatía hipertrófica en 9 familias portadoras de una idéntica mutación en el gen TNNT2. 2. Describir las variables morfológicas, clínicas y valor pronóstico de los pacientes portadores de la mutación Arg92Gln en el gen TNNT2 en nuestra serie, y comparación con las publicadas. 3. Comparar las características clínicas y pronósticas de esta población con una cohorte de pacientes con MCH no portadores de esta mutación, especialmente pacientes con otras mutaciones identificadas en TNNT2, otras mutaciones en genes sarcoméricos y pacientes con mutación no identificada. 4. Evaluar la prevalencia de mutaciones en genes sarcoméricos en pacientes con MCH de nuestra comunidad. 5. Demostrar un efecto fundador de la mutación Arg92Gln en la población de estudio. Para ello, desde noviembre del 2007 hasta febrero 2012 se evaluan 210 pacientes consecutivos no emparentados con diagnóstico de MCH. En todos los probandos se realiza estudio cardiológico completo, y se recoge muestra sanguínea para análisis genético. A los familiares de primer grado se les ofrece la realización de screening familiar consistente en evaluación cardiológica y genética (si hallazgo de mutación en el probando). En todos los pacientes se recogen una serie de variables en relación a la caracterización del fenotipo. La penetrancia de la enfermedad la determinamos en base a los criterios eléctricos y ecocardiográficos. En 8 probandos se identificó una idéntica mutación de tipo missense en heterocigosis en el gen TNNT2: Arg92Gln, localizada en el exón 9. Posteriormente se analizó la presencia de dicha mutación en los familiares, y se buscó un posible efecto fundador. Se realiza un exhaustivo análisis de resultados en cuanto a las variables clínicas y genéticas analizadas, prestando especial atención a los marcadores de mal pronóstico y/o muerte súbita en estos pacientes. Nuestro estudio concluye lo siguiente: 1. Las mutaciones en el gen de la troponina T son responsables de un 11.4% de casos de MCH en nuestra población insular, muy superior al de otras series. 2. El origen insular de la población de estudio, y la endogamia asociada habitualmente a este tipo de poblaciones, ha influido probablemente en la alta prevalencia de estas mutaciones. 3. Se constata un efecto fundador causal de los numerosos casos de MCH por la mutación Arg92Gln, localizada geográficamente en el noroeste de Mallorca, que no explica todos los casos, pero sí la mayoría. 4. La mutación TNNT2 Arg92Gln se asocia a miocardiopatía de desarrollo precoz, a menores edades que el resto de mutaciones. La probabilidad que el 50% de los portadores expresen el fenotipo se alcanza a los 37 años de edad. 5. La MCH por mutación TNNT2 Arg92Gln se caracteriza por una alta penetrancia, un alto riesgo de MS en jóvenes, en la mayoría como 1ª manifestación de la enfermedad, precisando el 38% implante de DAI como prevención primaria, con casos de MCH con hipertrofia sólo leve o moderada o en muchos otros casos con MCD al diagnóstico. 6. La mutación Arg92Gln produce alta frecuencia de fenotipo mixto: MCH con hipertrofia leve o moderada, y/o MCD, incluso dentro de la misma familia y a edades similares. Asimismo presentan disfunción sistólica en un porcentaje elevado (45%). 7. Los sujetos índice portadores de la mutación TNNT2 Arg92Gln presentan un perfil de riesgo significativamente peor comparado con el resto de pacientes con MCH y otras mutaciones o mutación no identificada. Existe una peor supervivencia libre de muerte cardiovascular asociada a esta mutación. La supervivencia media es de 54 años. A los 50 años la probabilidad de supervivencia es del 50%.

La metilación del ADN es una de las modificaciones epigenéticas más estudiadas y cuyo mecanismo de acción es más conocido. Consiste en la transferencia enzimática de un grupo metilo a la posición 5' de la citosina. Resulta la principal modificación epigenética en mamíferos, donde se encuentra restringida principalmente a la citosina del dinucleótido CpG, y está relacionada con el silenciamiento transcripcional. Tiene un papel clave en la regulación epigenética y por tanto, su análisis es de gran interés para entender procesos biológicos tan importantes como la replicación del DNA, la expresión génica, la diferenciación celular o las bases moleculares de muchas enfermedades, incluyendo el cáncer. Por este motivo, se han desarrollado numerosas técnicas para el estudio de la metilación del ADN, tanto a nivel regional como global y genómico. No obstante, el análisis masivo del genoma humano presenta un alto coste y dificultad, por lo que la mayoría de estudios a escala genómica utilizan diseños que reducen la complejidad del análisis. Para ello, se analiza únicamente una pequeña porción de las regiones genómicas de interés, una o unas pocas CpGs, y se extrapolan los resultados. Con la aparición de los primeros datos de células humanas obtenidos mediante Whole Genome Bisulfite Sequencing es posible evaluar la exactitud de los diferentes abordajes de complejidad reducida. En el presente trabajo se ha determinado la concordancia entre la metilación de las dianas HpaII y las islas CpG que las contienen. Para ello, se han utilizado datos públicos de dos estudios WGBS de muestras humanas. La diana HpaII se ha seleccionado dada su presencia en el 94% de las islas CpG del genoma. No en vano, la diana de restricción de HpaII (CCGG) es la más utilizada en estudios de metilación del ADN. Nuestros análisis muestran que la metilación de aquellas dianas HpaII que están dentro de islas CpG, resultan excelentes indicadores de la metilación global de las islas. Las dianas HpaII tienen un alto valor predictivo a nivel cualitativo asignando correctamente a la isla CpG como metilada o desmetilada con un alto porcentaje de acierto. Además, cuando las islas CpG disponían de dos o más dianas HpaII las predicciones resultaban extremadamente exactas para el valor de metilación de la isla. Estos resultados proporcionan una validación global de las estrategias basadas en el uso de la enzima de restricción sensible a metilación HpaII. Esta validación puede extenderse a otras aproximaciones de reducción de la complejidad similares. Su principal ventaja radica en la drástica reducción de costes, tanto del trabajo experimental como del análisis computacional. A pesar de la alta homogeneidad existente en la metilación de las islas CpG existen otros escenarios donde no es raro observar diferencias de metilación importantes entre dos CpGs próximas. La disponibilidad de un creciente número de metilomas ha permitido identificar un conjunto de zonas con patrones de metilación diferenciales, DMRs. Estas regiones se han encontrado asociadas a cambios observados en la expresión génica entre estos tipos celulares. En el presente trabajo se han analizado posiciones individuales con una metilación discordante respecto a su entorno. Se han evaluado aquellas que se mantienen desmetiladas cuando su entorno está totalmente metilado. Dada la metilación general del genoma, estos patrones representan anomalías que difícilmente puedan ser azarosas. Así, se han encontrado secuencias anómalas que presentan características asociadas a zonas de alta actividad transcripcional y pueden representar puntos de regulación génica. Además, algunas de ellas se sitúan cerca de genes importantes en la regulación de enfermedades, como el cáncer. Aunque aún son necesarias validaciones experimentales, aproximaciones in silico como la aquí presentada permiten encontrar posiciones de discordancia epigenética que pueden representar dominios funcionales putativos. / DNA methylation consists in the enzymatic transference of a methyl group to the 5’ position of a cytosine. In humans, it mostly occurs in the CpG dinucleotide. It is related to transcriptional silencing and it has a key role in biological processes such as DNA replication, genetic expression or the molecular basis of a lot of diseases, including cancer. For these reasons, many techniques have been developed to analyze it. However, the whole genomic determination of this epigenetic mark results in difficult and expensive analysis. To circumvent this issue, many techniques use a few positions and extrapolate the results. However, no global validation of this hypothesis has been performed. We have determined the correlation between the methylation of HpaII restriction sites and the CpG islands that contain them. We have used Whole Genome Bisulfite Sequencing data from human samples. Our results show that the methylation of the HpaII sites within CpG islands are excellent reporters of the global CpG island methylation, at both the quantitative and qualitative level. The prediction values were improved when the island contained more than one HpaII site. Our results represent a global validation for methylation analysis techniques based on the use of HpaII restriction enzyme. Although the high observed homogeneity in DNA methylation, there are some scenarios where it is not uncommon to observe important methylation differences between two close CpG positions. Many of these regions have been found to be associated to differences in gene expression among different cell types. We have analyzed individual positions with a discordant methylation compared to its closest neighbor CpGs. Using them as indicators, we have found sequences that have characteristics associated to high transcriptional activity and they can represent genetic regulation points. Some of them are close to important disease-associated genes. These positions can represent putative functional domains

Les distròfies de retina (DR) engloben un conjunt de patologies caracteritzades per la degeneració dels fotoreceptors i les cèl•lules de l’epiteli pigmentari de la retina, i representen la major causa de ceguesa hereditària. Són malalties altament heterogènies clínica i genèticament. La retinosi pigmentària (RP) és la DR més freqüent, amb una prevalença d'1:4000 i més d'un milió d'afectats arreu del món. Fins l'actualitat, s'han descrit gairebé 200 gens i loci responsables de DR, però s'estima que aquests expliquen poc més de la meitat dels casos. En els últims anys, s'han centrat molts esforços en la cerca de nous gens i mutacions, fonamental per tal d’oferir als pacients i als seus familiars un diagnòstic genètic acurat i, en alguns casos, una bona prognosi de la malaltia. No obstant, una vegada identificada la causa molecular, l'estudi funcional no es presenta com una tasca trivial. Si bé l'estadi final de les DR és comú en la majoria dels casos, -la mort per apoptosi dels fotoreceptors-, els diferents gens DR participen en una gran diversitat de vies i aspectes cel•lulars dels fotoreceptors. En aquest context, és molt important combinar estratègies in silico, in vitro i in vivo per abordar-ne l'estudi acurat. El treball d'aquesta tesi doctoral s'ha basat en l'obtenció de models in vivo i in vitro per a l'estudi de dos gens causants de distròfies de retina, CERKL i RP2. El primer, va ser descrit pel nostre grup l'any 2004 com a causant de RP d’herència autosòmica recessiva. Malgrat les primers anàlisis de predicció varen revelar una elevada homologia amb la quinasa de ceramides (CERK), diversos estudis han fracassat a l'hora de validar l'activitat fosforilativa de CERKL. A l'inici d'aquesta tesi, CERKL es presentava com una proteïna òrfena de funció. Per aquesta raó, varem iniciar-ne l'aproximació funcional, basada primerament en l'estudi transcripcional en detall del gen a la retina. Els resultats varen mostrar una gran complexitat transcripcional, deguda principalment a l'splicing alternatiu i a l'ús de promotors alternatius. A més, es varen identificar promotors específics de teixit, fet que posava de manifest l’elevada regulació en l’expressió d’aquest gen. Pel que fa a la localització cel•lular de la proteïna, CERKL presenta un clar dinamisme cel•lular entre els compartiments citoplasmàtic i nuclear, amb una localització depenent de tipus cel•lular a la retina murina. Tot plegat, suggeria un paper multifuncional de CERKL. Per abordar la seva contribució a la degeneració retinal, es varen generar dos models animals. D’una banda, un ratolí knockout Cerkl-/- i, de l’altra, un model knockdown en peix zebra. L’estudi acurat del fenotip ens va revelar una disfunció a nivell ganglionar i/o amacrí en el cas del model murí, acompanyada d’un augment de l’estrès i mort cel•lular en la retina. D’altra banda, en el cas del model en peix zebra, els animals presentaven ulls de mida reduïda, juntament amb defectes en la laminació de la retina i en la formació dels segments externs dels fotoreceptors. Segons els nostres resultats, Cerkl no sembla contribuir en el desenvolupament primerenc de la retina d’aquest teleosti, si bé podria participar en processos de degeneració secundaris. En ambdós models es va posar de manifest la contribució de CERKL en les vies d’estrès i apoptosi cel•lular. En el futur, quan les teràpies gèniques estiguin ben establertes i els pacients puguin accedir a elles, serà fonamental el coneixement de les bases genètiques de la malaltia i l’impacte molecular de les mutacions descrites en cada cas. En aquest context, s’han realitzat estudis tant in vitro com in vivo de dues mutacions identificades als gens CERKL i RP2 en famílies espanyoles. Les diferents anàlisis ens han permès comprovar l’impacte patogènic d’aquestes mutacions sobre els productes gènics, basat en la degradació o formació aberrant de les isoformes del mRNA. A més, en el cas de RP2, responsable de RP lligada al cromosoma X, hem reportat per primera vegada un cas de semi-dominància degut a mutacions en aquest gen. L’estudi de les mostres de les dones portadores de la família ens han permès demostrar un biaix en l’expressió dels al•lels de RP2, segurament donada per la inactivació no atzarosa del cromosoma X, com a causa directa del fenotip. / Retinal dystrophies (RD), the major cause of incurable familial blindness in the Western world, are monogenic disorders characterized by progressive dysfunction of photoreceptor and retinal pigment epithelium cells. RD is a group of extremely heterogeneous diseases that show substantial clinical and genetic overlap. Highthroughput technologies have greatly improved our knowledge of the genetic basis of RD. Indeed, more than 180 RD genes have already been reported and this number is constantly increasing. However, although RD genes are known to be involved in a variety of celular and molecular processes in the retina, we are still far from understanding the contribution of most of them to the disease. In this context, we have aimed to study the contribution to the pathogenesis of two RD genes: CERKL and RP2. The first was identified by our group in 2004, as a responsible for autosomic recessive retintitis pigmentosa (RP). To shed light on the pathogenicity of the mutations in this gene, we aimed to characterize its transcriptional repertoire. Our results showed an unexpected multiplicity of CERKL transcriptional start sites plus a high variety of alternative splicing. In order to approach the function of the retinal dystrophy CERKL gene we generated a knockout mouse model. KO animals showed clear and consistent signals of gliosis and retinal stress, togheter with a non-progressive perturbation of ganglion cells. The failure to reproduce the human phenotype in the mouse, not unusual in other hereditary retinal disorders, prompted us to explore zebrafish as an alternative model. The phenotype resulted in abnormal eye development with lamination defects, failure to develop photoreceptor outer segments, increased apoptosis of retinal cells and small eyes. Our data supported that zebrafish Cerkl does not interfere with proliferation and neural differentiation during early developmental stages but is relevant for survival and protection of the retinal tissue. Finally, we have analized the pathogenicity of a new variant in RP2, a X-linked RP gene. The study of the RP2 splicing pattern in blood samples of patients and carrier females showed a aberrant mRNA transcript. High levels of variation observed for RP2-spliced products in female carriers supports X chromosome–skewed inactivation as the cause of the disease in the affected females.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / After germination in darkness, Arabidopsis seedlings follow a dark specific developmental pattern called skotomorphogenesis or etiolation, characterized because the plant develops long hypocotyls together with a closed apical hook and cotiledons in order to protect the apical meristem while passing through the soil. The phytochrome (phy)-interacting basic helix-loop-helix transcription factors (PIFs) constitutively sustain the etiolated state of dark-germinated seedlings by actively repressing deetiolation in darkness. This action is rapidly reversed upon light exposure by phy-induced proteolytic degradation of the PIFs. Here, we combined a microarray-based approach with a functional profiling strategy and identified four PIF3-regulated genes misexpressed in the dark (MIDAs) that are novel regulators of seedling deetiolation. We provide evidence that each one of these four MIDA genes regulates a specific facet of etiolation (hook maintenance, cotyledon appression, or hypocotyl elongation), indicating that there is branching in the signaling that PIF3 relays. Furthermore, combining inferred MIDA gene function from mutant analyses with their expression profiles in response to light-induced degradation of PIF3 provides evidence consistent with a model where the action of the PIF3/MIDA regulatory network enables an initial fast response to the light and subsequently prevents an overresponse to the initial light trigger, thus optimizing the seedling deetiolation process. Collectively, the data suggest that at least part of the phy/PIF system acts through these four MIDAs to initiate and optimize seedling deetiolation, and that this mechanism might allow the implementation of spatial (i.e., organ-specific) and temporal responses during the photomorphogenic program. After deetiolation plants will develop depending on the surrounding environmental conditions ans short-day, long-day, or shade. Arabidopsis seedlings display rhythmic growth when grown under diurnal conditions, with maximal elongation rates occurring at the end of the night under short-day photoperiods. Current evidence indicates that this behavior involves the action of the growth-promoting bHLH factors PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4 (PIF4) and PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 5 (PIF5) at the end of the night, through a coincidence mechanism that combines their transcriptional regulation by the circadian clock with control of protein accumulation by light. To assess the possible role of PIF3 in this process, we have analyzed hypocotyl responses and marker gene expression in pif single- and higher-order mutants. The data show that PIF3 plays a prominent role as a promoter of seedling growth under diurnal light/dark conditions, in conjunction with PIF4 and PIF5. / Los reguladores transcripcionales PIF, factores de interacción con fitocromos de tipo bHLH, aseguran de manera constitutiva el estado etiolado de las plántulas germinadas en oscuridad mediante la represión activa del proceso de desetiolación. Tras la exposición a luz, los fitocromos revierten rápidamente esta acción induciendo la degradación proteolítica de los PIFs. Un análisis reciente del transcriptoma de un cuádruple mutante deficiente en PIF1, PIF3, PIF4 y PIF5 demuestra que los PIFs, en condiciones de oscuridad, regulan transcripcionalmente un grupo de genes que coincide ampliamente con genes regulados por luz en las líneas salvajes. Tales resultados establecen que la inducción de la desetiolación mediada por los fitocromos, implica la reversión del perfil transcripcional mantenido por los PIFs en oscuridad. En este trabajo, elucidamos, como los PIFs implementan la desetiolación de la planta combinando una aproximación basada en el análisis de expresión génica con una estrategia de descripción funcional. Como resultado identificamos también cuatro genes regulados por PIF3 como nuevos reguladores del desarrollo en oscuridad, los genes MIDA de “MISREGULATED IN DARK” (DESREGULADOS EN OSCURIDAD) y proporcionamos evidencia de que cada uno de estos cuatro MIDA, regula un aspecto diferente de la etiolación ( mantenimiento del gancho apical, cierre de los cotiledones o elongación del hipocotilo), sugiriendo así, una ramificación de la señal que PIF3 ejerce sobre estos genes. Además, tras los estudios con mutantes, combinamos la función inferida para los genes MIDA con sus perfiles de expresión en respuesta a la degradación por luz de PIF3 y evidenciamos consistentemente con un modelo, que la acción de la red reguladora PIF3/MIDAS posibilita, tras la exposición a luz, una primera respuesta que induciría rápidamente el proceso de desetiolación y una segunda que modularía los efectos de la primera optimizando el proceso de desetiolación de la plántula en función de las condiciones ambientales que la rodean. Los datos presentados sugieren colectivamente que al menos parte del sistema phy/PIF actúa a través de estos cuatro MIDAs para iniciar y optimizar la desetiolación de la plántula , y que éste mecanismo podría permitir la implementación de respuestas espaciales (específicas de órgano) y temporales durante el programa fotomorfogénico.

Còpia digital de l'exemplar imprès de la tesi dipositat a la Biblioteca de la Facultat de Biologia / Els objectius principals dels treballs que aquí es descriuran queden emmarcats dins de dues grans problemàtiques. Primerament, l'estudi estructural i funcional de l'enzim dins del gènere Drosophila, en un intent de determinació de l'esquema evolutiu dins del taxó, i les influències que sobre aquest esquema hagin pogut exercir diversos paràmetres ecològics. En segon lloc, un intent de clarificació de les reaccions de resposta de Drosophila sota unes condicions de "stress" d'alcohol, i el paper que l'ADH hi juga. Per diverses raons que s'esmentaran en el seu moment, l'espècie amb la qual s'han realitzat els estudis és “Drosophila hydei”, representant cosmopolita del grup Repleta. Els punts concrets d'aquest treball poden resumir-se en: (a) Visió general de les propietats de l'enzim ADH nadiu a diferents espècies de Drosophila. (b) Estudi estructural de l'enzim ADH de D. hydei. Comparació amb les dades de les espècies que ja havien estat estudiades en el Departament. (c) Estudi comparatiu dels mètodes més actuals d'aïllament i purificació de pèptids triptics. (d) Estudi del metabolisme dels alcohols i els seus productes d'oxidació en individus sotmesos a dietes riques en etanol i isopropanol. (e) Estudi dels enzims que intervenen en les reaccions enzimàtiques del catabolisme alcohòlic.

Myogenesis is the differentiation process which encompasses the formation of skeletal muscle during development, regeneration and tissue homeostasis throughout life. Arising from embryonic or adult stem cells, the myogenic process comprehends the acquisition of a specialized cell identity and the loss of pluri/multipotent and proliferative capacities. Starting with the hypothesis that DNA methylation, together with other epigenetic mechanisms and the transcription factors, orchestrates the transcriptional program, this thesis provides a comprehensive picture of DNA methylation dynamics during murine myogenic progression, addresses their regulatory implications, and identifies relevant differentially methylated regions that define muscle cell identity. Initially, we performed a genome-scale DNA methylation study comparing embryonic stem cells (ESCs), primary myoblasts (MBs), differentiated myotubes (MTs), and mature myofibers (MFs) using AIMS-seq method. We identified 1,000 differentially methylated regions during muscle-lineage determination and terminal differentiation, mainly located in gene bodies and intergenic regions. As a whole, muscle lineage commitment was characterized by a major gain of DNA methylation, while muscle differentiation was accompanied by loss of DNA methylation in CpG-poor regions. Notably, hypomethylated sequences were enriched in enhancer-type chromatin regions, suggesting the involvement of DNA methylation in the regulation of cell-type specific enhancers. Importantly, we detected a demethylated region overlapping the super-enhancer of the cell-identity factor Myf5. We showed that the activation of My5 super-enhancer took place upon DNA demethylation exclusively in muscle-committed cells resulting in gene expression. ChIP analyses showed that the binding of the Upstream stimulatory factor 1 (Usf1) to Myf5 locus was DNA demethylation-dependent in myogenic committed cells. Moreover, Usf1 binding site contained an embedded CpG conserved in humans and demethylated in human MBs but not in human ESCs, altogether reinforcing the hypothesis that DNA methylation regulates gene expression by modulating transcription factor binding accessibility. Next, we analyzed by sodium bisulphite sequencing the DNA methylation state of reported regulatory regions (with and without CpG island) of key genes implicated in myogenesis. After analyzing myogenic and non-myogenic cells we concluded that the muscle cell identity comprehends DNA demethylation of lineage-specific CpG-poor regulatory regions leading to a transcriptionally poised or activated state, while myogenic CpG island promoters are totally unmethylated during myogenesis and are regulated by histone modifications. A collaborative work with Charles Keller’s Lab (Oregon Health & Science University, USA) allowed us to conclude that Rhabdomyosarcoma cell lines present a spurious methylation pattern at usually unmethylated CpG islands, consequently with the aberrant methylation associated to tumorigenesis. Furthermore, the study of pluripotency gene promoters during myogenesis pointed that CpG-poor promoters are repressed during differentiation by DNA methylation and by Polycomb complex at CpG island promoters. Interested in deepen in the DNA demethylation dynamics, we started a collaboration with Rita Perlingeiro’s Lab (University of Minnesota, USA) to study the DNA methylation changes in the myogenic inducible Pax7 ESC-derived model. We showed that the ESC-derived myoblast precursors recreated the DNA methylation signature of in vivo isolated muscle stem cells, supporting this model as a bona fide strategy to generate myogenic precursors in vitro with therapeutic purposes. Finally, we addressed the involvement of an active demethylating mechanism during myogenesis. Apobec2 down-regulation in inducible ESC-derived myoblast precursors with shRNA strategies affected dramatically the myogenic differentiation by impairing DNA demethylation of the Myogenin promoter and abolishing the expression of Myogenin and MHC proteins. Based on these results, we proposed that Apobec2 might be involved in the active muscle specific DNA demethylation along myogenesis. / Partint de la hipòtesi que la metilació de l’ADN, junt amb altres mecanismes epigenètics i els factors de transcripció, orquestra el programa transcripcional, aquesta tesi ofereix un estudi exhaustiu de les dinàmiques de l'ADN durant la progressió miogènica, aborda les seves possibles implicacions reguladores i identifica regions diferencialment metilades que defineixen la identitat de la cèl·lula muscular. L’anàlisi a escala genòmica els perfils de metilació en diferents estadis de la miogènesi va permetre identificar 1000 regions diferencialment metilades, localitzades principalment en regions intergèniques i intragèniques. La majoria de canvis observats eren guanys de metilació i ocorrien durant la determinació de llinatge. D’altra banda, certes regions amb perfils de cromatina associats a enhancers esdevenien desmetilades, suggerint que la metilació de l’ADN pot estar implicada en la regulació de enhancers específics de teixit. L’estudi de gens específics de múscul va mostrar que la identitat de la cèl·lula muscular requereix la desmetilació de l'ADN de regions reguladores pobres en CpGs, alhora que els gens miogènics amb illes CpG a la regió promotora es troben sempre desmetilats i són regulats per modificacions d’histones. Un exemple de la desmetilació específica de múscul és la regió super-enhancer de Myf5. Els assajos d'immunoprecipitació de la cromatina van demostrar que la unió del factor de transcripció Usf1 al locus Myf5 només es donava quan l’ADN estava desmetilat, reforçant la hipòtesi que la metilació de l'ADN regula l'expressió gènica mitjançant la modulació de l'accessibilitat dels factors de transcripció al seu lloc d’unió. Mitjançant l’estudi el perfil de metilació de l'ADN de gens miogènics en un model miogènic derivat de cèl·lules embrionàries, es va observar el mateix perfil observat en mioblasts primaris, indicant que aquest model és una bona estratègia per obtenir mioblasts in vitro amb finalitats terapèutiques. Finalment, el bloqueig de la deaminasa Apobec2 va afectar severament la diferenciació miogènica i la desmetilació de l'ADN del promotor de la Miogenina, indicant que la deaminasa Apobec2 podria estar implicada en la desmetilació activa de l'ADN.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) i a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / Examples of tubular organ systems like the mammalian lungs and vascular system abound in the animal kingdom. In this study we used the Drosophila melanogaster tracheal system to study tubular organ development. In particular, we focused on taenidial folds, chitin structures surrounding the tubular lumen that give mechanical strength to the tracheal tubes. Formed by the secretion of chitin into the apical extracellular matrix, these folds extend beyond the limits of a single cell spanning through multiple cells. This implies a high level of intra and intercellular coordination. There are a number of genes in the absence of which taenidial folds are disturbed. Among these, we focused on Blimp-1 and pri. In the absence of each of these genes, taenidial folds are disrupted while other aspects of tracheal development are unaffected. We have analyzed the expression pattern of Blimp-1 and pri and found that both genes are expressed in Drosophila tracheal cells during embryonic development. Taenidial folds are still formed in the absence of Blimp-1 or pri but they are not organized correctly, thereby indicating that Blimp-1 and pri contribute to their proper formation. Actin structures contributing to chitin organization have been reported for many systems in Drosophila, like denticle belts at the epidermis and the lumenal structure in the tracheal system. In Blimp-1 mutants, apical actin rings fail to form whereas in pri mutants they are formed but misoriented, suggesting that the function of Blimp-1 and pri is required for F-actin assembly. Interestingly, when we impair either chitin synthesis or chitin organization the apical F-actin is disorganized and does not form bundles. For the first time, we show that during tracheal system development there is a crosstalk between F-actin organization and chitin structures. By rescuing the mutant phenotype in single cells, we studied how individual cells contribute to generate a supra-cellular structure. Results of our analysis reveal that the orientation of taenidial folds is not cell-autonomously regulated and that it depends highly on the taenidial folds formed by the neighboring cells. Finally, we show that impairing cell-cell junctions, via down-regulation of α-catenin, gives rise to tracheal cells that form their taenidial folds independently. / En el reino animal hay numerosos ejemplos de sistemas de órganos tubulares, como los pulmones y el sistema vascular de los mamíferos. En este estudio hemos usado el sistema traqueal de Drosophila melanogaster para estudiar el desarrollo de este tipo de órganos. En particular, nos centramos en los pliegues taenidiales, estructuras de quitina que rodean el lumen tubular y dan resistencia mecánica a los tubos traqueales. Formados por la secreción de quitina en la matriz extracelular apical, estos pliegues se extienden más allá de los límites de una sola célula, abarcando múltiples células. Esto implica un alto nivel de coordinación intra e intercelular. Hay una serie de genes cuya ausencia produce perturbaciones en los pliegues taenidiales. De éstos, nuestro estudio se centra en Blimp-1 y pri. En ausencia de cada uno de estos genes, los pliegues taenidiales no se desarrollan correctamente mientras que otros aspectos del desarrollo traqueal no se ven demasiado afectados. Hemos analizado el patrón de expresión de Blimp-1 y pri, y hemos encontrado que ambos genes se expresan en las células traqueales de Drosophila durante el desarrollo embrionario. Los pliegues taenidiales todavía se forman en ausencia de Blimp-1 o pri, pero no están organizados correctamente, lo que indica que Blimp-1 y pri contribuyen a su adecuada formación. Existen varios sistemas en Drosophila en que estructuras de actina contribuyen a la organización de la quitina, como los dentículos de la epidermis y el lumen el sistema traqueal. En los mutantes Blimp-1, no se forman los anillos de actina apical, que si que lo hacen en los mutantes pri pero con una mala orientacion, lo que indica que la función de Blimp-1 y pri se requiere para el ensamblaje de la F-actina. Por otra parte, nuestros resultados indican que perturbar la síntesis de quitina o su organización, desorganiza la F-actina apical que no forma haces. Por lo tanto, durante el desarrollo del sistema traqueal se establece una interacción mútua entre la organización de la F-actina y de las estructuras de quitina. Mediante la expresión de la forma silvestre del gen en una sola célula en un fondo mutante, hemos estudiado cómo las células individuales contribuyen a generar una estructura supra-celular. Los resultados de nuestro análisis revelan que la orientación de los pliegues taenidiales no es regulada de manera autónoma y que depende en gran medida de los pliegues taenidiales formados por las células vecinas. Por último, mostramos que perturbar las uniones entre células, a través de la reducción de los niveles de α-catenina, da lugar a que las células traqueales formen su pliegues taenidiales de forma independiente a sus vecinas.

La situació actual de la problemàtica de la recombinació, quan es consideren les eficàcies biologiques independents de les freqüències (gèniques, cromosômiques, zigòtiques) i en un ambient, i per tant amb unes eficàcies, constant en l'espai i el temps, és aproximadament la següent:D'una banda els models deterministes rarament posen de manifest cap avantatge selectiu de la recombinaciô, la tendència general és la congelació del genotip. Certs models deterministes mostren que la tendència general serà l'increment progressiu de la freqüència d'un mecanisme que impideixi o dificulti la recombinaciô. Els mateixos models acostumen a portar associat un increment de l'eficàcia mitjana de la població amb un decreixement de les freqüències de recombinaciô. La sensació general que se'n desprèn és que les limitacions a la recombinaciô són un mecanisme d'adaptació ràpida i oportunista en un ambient estable.Altres models, sense discutir la dinàmica del mecanisme regulador de la recombinaciô, tambe troben associada una eficàcia mitjana superior a un lligament més intens. Quan s'analitza el paper del desequilibri en el lligament es posa de manifest que aquest és fonamental, tant a 1'adaptació ràpida com a 1'eliminació de mutacions deletêries, i és propiciat pel lligament intens i per les interaccions epistàtiques.Abans de discutir el quadre general dels models finits convindria fer alguns comentaris crítics sobre la validesa dels models deterministes a les situacions reals. Primerament es pot fer la crítica evident que sovint les suposicions (grandària infinita, aparellament a 1'atzar ...) en les que es basen, i que sempre representen idealitzacions de la realitat, no son vàlides; realment això no és cap argument decisiu contra aquests models, l'únic que es pot dir és que quan aproximadament es compleixin tais condicions, el model serà una descripció suficientment vàlida de la realitat. A més, sovint es reconeix que un model és una primera aproximació i que es pot anar complicant per fer-lo cada cop més adequat per analitzar la realitat.Una crítica més profunda a aquells treballs que es basen en dues menes de criteris: els criteris d'optimització (normalment de maximització de l'eficàcia mitjana), associada amb les posibles "estratègies" (recombinació, no recombinació p.e.) de les poblacions, i els criteris de selecció de grup (és adequat, és beneficiós, etc. per a la població, l'espècie ...). Ambdós tipus de criteris, relacionats entre ells, presenten nombrosos problemes lògics com a explicacions vàlides d'allò que s'observa a les poblacions. Wiens (1976) ha resumit els punts essencials d'aquesta qüestió. Quant als criteris d'optimització puntualitza que normalment suposen cert que: 1) el sistema població-ambient és en equilibri, 2) com a mínim una component de l'ambient es constantment limitant, 3) no hi ha cap relaxació temporal de les pressions de selecció que afavoreixen l'òptim, 4) l'ambient disponible es constantment i totalment ocupat, 5) l'òptim esestable (p.e. no canvia el fenotip òptim al llarg del temps), 6)l'òptim és realment assolible (p.e. no es té en compte cap possible efecte de la història passada del sistema, com ara un efecte fundador).Respecte als criteris de selecció de grup hi ha seriosos problemes per encaixar-los en la teoria clàssica de la selecció natural, basada en la selecció a nivell individual. En els models amb població finita no sembla que existeixi tal unitat quant als resultats. Cal remarcar que es tracten dos problemes diferents, d'una banda el manteniment del polimorfisme al·lèlic, i d'una altra la velocitat d'adaptació i d'eliminació d'al·lels deleteris. Ambdós però estan relacionats amb una qüestió més profunda: l'efectivitat de la selecció com a força oposada als efectes de la deriva genètica.L'anàlisi de la velocitat de substitució d'al·lels favorables i de la taxa d'eliminació de llast genètic (Felsenstein (1974), Felsenstein i Yokoyama (1976), Hill i Robertson (1966), etc. ...) coincidiesen a mostrar a la recombinació com un mecanisme afavoridor de la resposta selectiva ràpida, en oposició als resultats dels models deterministes, els quals freqüentment no inclouen la mutació (excepte Eshel(1971)), amb una població inicial en equilibri on ja són presents - tots els tipus (contràriament al cas finit), es lògic que un mecanisme preservador de la combinació al·lèlica afavorida i ja present a una freqüència inicial d'equilibri, mostri les propietats trobades als models deterministes : es tracta d'incrementar la freqüència del tipus cromosòmic més eficaç i de disminuir la dels altres, no de propiciar la seva aparició ni d'evitar que es perdi a causa de la deriva. Les dades experimentals semblen confirmar l'existència real de mecanismos d'aquest tipus, i l' anàlisi matemàtica realitzada amb models deterministes i aleatoris sembla que confirmi, en un context una mica diferent, aquestes idees. Els mateixos resultats es troben si s'analitza numèricament i mitjançant simulació un model segons un procés, en temps continu i estats finits, de naixement, mort, mutació i recombinació. Per tant, per grandàries poblacionals finites, es troba que el significat de la recombinació, a més de les condicions de desequilibri inicials , varia segons es consideri el temps fins a l'aparició del primer genotip mutant doble (recombinació favorable) o el temps fins a la fixació d'aquest genotip. (recombinació desfavorable). Apart de la possible artificiositat de les suposicions inicials d'eixos models, ja esmentada i que es discutiran més endavant, quant als models de simulació finits cal dir que usualment son deficients respecte al seu "realisme" a l'hora de representar els processos ge nètics. Concretament, la selecció i la gametogênesi de vegades no coincideixen gaire amb la seva descripció biològica. Tot això es discutirà mes a fons en parlar de les tècniques .de. simulació.. De moment cal tenir-ho present com un possible factor per explicar els resultats, que podrien no ser reflex d'una propietat biològica sinò d'una limitació del model de simulació.

Els dipòsits d'amiloide s'observen en els illots pancreàtics de la immensa majoria de persones que han sofert diabetis mellitus tipus 2, i constitueixen un fet característic en la història natural de la malaltia. El principal component d'aquest dipòsits és la amilina, un pèptid sintetitzat per la pròpia cèl.lula i secretat amb la insulina. La hipòtesi de treball del present projecte es basa en el fet que els dipòsits d'amiloide serien secundaris a una alteració en la expressió de l'amilina o bé en la síntesi del pèptid, i aquesta alteració podria estar determinada per un defecte genètic.