Over the last ten years, improvements in molecular techniques and the arrival of the next-generation sequencing technologies have revealed a large amount of structural variation (SV) in the human genome. Consequently, there has been a significant increase in interest from the scientific community to understand the role of the SV in diseases, such as cancer, or in determining phenotypic traits in the general population. The objective of this thesis has been to study in depth the characterization and the functional importance of the SV, through the analysis of different methods for its detection and its biological impact in two different contexts. First, we have analysed the presence of copy-number variants in several human populations using a microarray approach and, by validating one of the detected regions, we have confirmed the reliability of this method for the detection of this type of SV. Second, through the chronic lymphocytic leukaemia (CLL) genome project, we have identified structural variants in patients with CLL by whole-genome sequencing. To obtain a comprehensive analysis of the SV in cancer genomes, we have developed a computational tool with the capacity to characterize and define all forms of the SV using next-generation sequencing data. With this tool we have detected, on one hand, some novel variants in CLL and, on the other hand, a high level of genomic complexity in one of the patients studied. From this last case, we have carried out the evaluation of the phenotypic impact of the complex variants in the progression of the CLL, which has allowed us to determine the importance of analysing cancer as a dynamic process undergoing evolutionary changes over time / En els últims deu anys, les millores en tècniques moleculars i l’aparició d’una nova generació de tècniques de seqüenciació han revelat que existeix una gran quantitat de variació estructural (SV, en anglès) en el genoma humà. En conseqüència, hi ha hagut un augment significatiu en l’interès de la comunitat científica per entendre el paper que la SV juga en malalties com el càncer, o en la determinació de trets fenotípics en la població general. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat aprofundir en la caracterització i la importància funcional de la SV, analitzant diferents mètodes per a la seva detecció i el seu impacte biològic en dos contextos específics. En primer lloc, hem analitzat la presència de variants en nombre de còpia en diferents poblacions humanes mitjançant una tècnica de microarray i, a través de la validació d’una de les regions trobades, hem pogut confirmar la fiabilitat d’aquesta tècnica per detectar aquest tipus de SV. En segon lloc, a través del projecte del genoma de la leucèmia limfàtica crònica (LLC), hem caracteritzat variants estructurals en pacients amb LLC mitjançant la seqüenciació completa del seu genoma. Per tal d’obtenir un anàlisi el màxim d’exhaustiu de la SV en genomes de càncer, hem desenvolupat una eina computacional capaç de caracteritzar i definir totes les formes possibles de SV utilitzant dades de seqüenciació. Amb aquesta eina hem pogut detectar, per una banda, algunes variants noves en LLC i, per l’altra, un alt nivell de complexitat genòmica en un dels pacients. A partir d’aquest últim cas hem dut a terme l’avaluació de l’impacte fenotípic d’un patró de SV complex en la progressió de la LLC, la qual cosa ens ha permès determinar la importància d’analitzar el càncer com a un procés dinàmic sotmès a canvis evolutius al llarg del temps.

La anemia de Fanconi (AF) es un síndrome hereditario raro, de patrón recesivo mayoritariamente autosómico. Clínicamente se caracteriza por presentar malformaciones congénitas, fallo de médula ósea progresivo, endocrinopatías, predisposición a cáncer e hipersensibilidad celular a agente inductores de enlaces cruzados en el DNA (ICL). Esta enfermedad puede ser causada por mutacions bialélicas en cualquiera de los16 genes que hasta la fecha se han identificado, por lo cual existen 16 grupos de complementación. El grupo de complementación más frecuente a nivel mundial es el FA-A (63%) y su espectro mutacional es altamente heterogeneo. En la población Española la frecuencia de este grupo de complementaciòn es mayor (77%) debido a su alta prevalencia en la población gitana española. En este estudio se ha continuado con el análisis mutacional de los pacientes FA-A españoles usando la estrategia de análisis de las mutaciones más comunes y se ha iniciado en paralelo el análisis mutacional de poblaciones AF de algunos países Latino-americanos usando dicha estrategia. Adicionalmente, se ha estudiado el fenotipo celular de pacientes Fanconi-like y otros pacientes con fenotipo celular similar incluyendo un ensayo de fragilidad cromosómica negativo. Por otra parte, se ha realizado un estudio a largo plazo de la evolución hematológica de pacientes AF con mosaicismo somático hematológico. Finalmente, se ha analizado la tasa de eficiencia del diagnóstico genético preimplantacional (DGP) con tipificación del antígeno leucocitario humano (HLA) en parejas con hijos afectos de AF. Estos resultados confirman que la estrategia de cribado mutacional realizado en pacientes FA-A españoles es eficiente para identificar el 51% de las mutaciones en pacientes españoles y sólo el 17% de las mutaciones en la población Latino-americana estudiada hasta el momento. La implementación de la secuenciación masiva del exoma es muy eficiente para el subtipaje de pacientes AF, especialmente para los subtipos menos frecuentes, de esta manera se han subtipado dos pacientes españoles (FA104: FA-Q y FA287: FA-J). Con respecto al análisis de los pacientes Fanconi-like se observó que tienen una sensibilidad celular intermedia a agentes inductores de ICLs asociado a un fenotipo clínico similar a AF. Interesantemente, células derivadas de pacientes deficientes en FAN1 presentan una sensibilidad celular intermedia a agentes inductores de ICLs pero no presentan un fenotipo hematológico de AF, lo cual descarta a FAN1 como un gen candidato para AF. Por otra parte, se ha observado una mejoría hematológica en la mayoría de los pacientes AF con mosaicismo somático, pero con casos excepcionales que son relevantes para la predicción de resultados de futuros ensayos de terapia génica. Los resultados moleculares sugieren que la evolución clínica en estos pacientes no sólo depende del nivel celular donde ocurrió la reversión mutacional, sino también de la edad biológica y el potencial proliferativo de la célula revertida. Finalmente, se ha encontrado una baja tasa de éxito en parejas con hijos afectos con AF sometidas a DGP con tipificación HLA, muy probablemente debido a la edad materna avanzada / Fanconi anemia (FA) is a rare genetic disorder, which is mainly inherited with autosomal recessive pattern. Clinically it is characterized by congenital and endocrine abnormalities, bone marrow failure, cancer predisposition and cellular hypersensitivity to DNA interstrand crosslinking agents (ICL). This disease is caused by biallelic mutations in any of 16 genes that have been identified so far, leading to 16 complementation groups. FA-A is the most common complementation group (63%) and its mutational spectrum is highly heterogeneous. In the Spanish population, the frequency of this complementation group is even higher (77%) due to its high prevalence in the Spanish gypsy population. In this study, we have continued the mutational analysis of Spanish FA-A patients by analyzing the most common mutations, and we also have started the mutational analysis of FA populations of some Latin-American countries by this strategy. In addition, we have studied the cellular phenotype of Fanconi-like patients and others patients with similar cellular phenotype including a negative chromosome fragility test. On the other hand, we have performed a long-term retrospective study of the hematological evolution of FA patients having hematologic somatic mosaicism. Finally, we have analyzed the rate of efficiency of preimplantation genetic diagnosis (PGD) with human leukocyte antigen (HLA) in couples with affected FA children. The results confirm that the mutational screening strategy adopted in Spanish FA-A patients is efficient to identify 51% of mutations in Spanish patients but only 17% of Latin-American populations studied so far. The implementation of whole exome sequencing is an efficient strategy for FA subtyping, especially for infrequent subtypes, as we have done confirming two Spanish patients (FA104: FA-Q and FA287:FA-J). It was observed that Fanconi-like patients share intermediate cell sensitivity to ICLs associated with clinical phenotype similar to FA. Interestingly, patient derived FAN1-deficient cells have intermediate cell sensitivity to ICLs but do not have a FA hematological phenotype, disregarding FAN1 as a candidate gene for FA. On the other hand, we have usually observed hematological improvement in patients with somatic mosaicism, but with exceptional cases that are relevant to predict the outcome of future gene therapy trials. The molecular results suggest that the clinical course in these patients depends not only on the cellular level where mutational reversion occurred but also on the biological age and proliferative potential of the reversed cell. Finally, we have found a very low success rate in couples with affected children with FA undergoing PGD with HLA typing, most probably due to the advanced maternal age.

Cerebral ischaemia is a potent inducer of gene expression, however, little is known about the mechanisms that regulate this expression. Studies of gene expression and the study of the mechanisms regulating this expression allow identifying new molecules regulated by ischaemia and possibly involved in the physiopathology of stroke. This thesis shows, (1) the importance of validating suitable endogenous controls for the studies of gene expression for each experimental condition; (2)that Gcf2/Lrrfip1 presents as a gene with diverse isoforms that are differentially expressed in response to stroke and that rLrrfip1, which has a possible protector role, is the main isoform; and (3) that the differential expression of the microRNAs remains from the acute to the chronic phase of ischaemia, having determined that miR-347 promotes neuronal apoptosis and Acsl4 and Arf3, potential targets of microRNAs differentially expressed in response to ischaemia, are new proteins to study in the physiopathology of stroke. / La isquèmia cerebral és un potent inductor de l’expressió gènica, en canvi, poc es coneix sobre els mecanismes que regulen aquesta expressió. Els estudis d’expressió gènica i l’estudi dels mecanismes reguladors d’aquesta expressió permeten identificar noves molècules regulades per la isquèmia i possiblement implicades en la fisiopatologia de l’ictus. Aquesta tesi mostra, (1) la importància de validar els controls endògens idonis per als estudis d’expressió gènica per cada condició experimental; (2) que Gcf2/Lrrfip1 és un gen amb diverses isoformes diferencialment expressades en resposta a la isquèmia, sent rLrrfip1 la isoforma principal amb un possible rol protector; i (3) que l’expressió diferencial dels microRNAs es manté des de la fase aguda fins la fase crònica de la isquèmia, havent determinat que el miR-347 promou l’apoptosis neuronal i que Acsl4 i Arf3, potencials dianes de microRNAs diferencialment expressats en resposta a la isquèmia, són noves proteïnes d’estudi en la fisiopatologia de l’ictus.

Both the prenatal and postnatal environment have a profound impact on the risk for adult diseases. A model of catch-up growth following fetal growth restriction was set in Wistar rats to study changes in the gene expression of energetic metabolism–related genes. Excessive adipose tissue accumulation and hypertrophy, decreased circulating adiponectin and triglycerides levels, higher HOMA-IR values and reduced expression of STK11, DLK1 and SIRT1 genes in retroperitoneal adipose, hepatic and muscular tissues were observed in pups with catch-up growth at postnatal day 42, that is related to visceral fat accumulation and insulin resistance. In conclusion, catch-up growth following prenatal growth restriction leads to changes in STK11, DLK1 and SIRT1 gene expression. These genes could be new therapeutic targets for early prevention on fetal programming of metabolic disorders in adulthood. / Els ambients pre i postnatal poden augmentar el risc de desenvolupar malalties en l’edat adulta. S’ha dissenyat un model animal de creixement recuperador postnatal secundari a restricció de pes prenatal en rates Wistar per estudiar canvis en l’expressió de gens de regulació metabòlica. Les cries amb creixement recuperador postnatal presenten acumulació excessiva i hipertròfia del teixit adipós visceral, disminució dels nivells l’adiponectina i triglicèrids circulants, augment del valor de HOMA-IR i baixa expressió dels gens STK11, DLK1 i SIRT1 en els teixits adipós, hepàtic i muscular en el dia postnatal 42 que es relaciona amb acumulació de greix visceral i resistència a la insulina. En conclusió, el creixement recuperador postnatal secundari a restricció de pes prenatal provoca canvis en l’expressió dels gens STK11, DLK1 i SIRT1, els quals podrien ser noves dianes terapèutiques per a la prevenció precoç de la programació fetal dels desordres metabòlics en l’edat adulta.

La migranya és un trastorn neurològic comú que afecta un 15% de la població. Es caracteritza per l’aparició d’episodis de cefalees recurrents i incapacitants, molt sovint acompanyades d’altres símptomes com la sensibilitat a la llum, les nàusees o els vòmits. La seva prevalença és variable en funció de l’edat i el sexe, essent fins a tres vegades més freqüent en dones en etapa adolescent o adulta. Clínicament, la migranya es classifica en dos subtipus, migranya sense aura i migranya amb aura, aquesta última caracteritzada per l’aparició de símptomes neurològics que precedeixen i/o acompanyen la cefalea. La migranya comuna té una etiologia complexa, en què participen factors genètics, encara poc coneguts, i ambientals. Hi ha, però, una forma monogènica del trastorn, la migranya amb aura hemiplègica, de la qual ja s'han resolt molts casos, amb gens i mutacions descrites, i que per tant constitueix un bon punt de partida per abordar l'estudi de la migranya comuna. En aquest treball hem aprofundit en els aspectes genètics de les formes rara i comuna de migranya, en pacients amb i sense aura. S’han dut a terme cribratges mutacionals, basats en seqüenciació i anàlisi de CNVs, en pacients amb migranya hemiplègica o altres trastorns paroxístics relacionats, tot identificant diverses mutacions causals. D’altra banda, s’han realitzat estudis d’associació a escala genòmica i amb gens candidats amb l’objectiu de detectar variants de susceptibilitat a la migranya comuna. Entre les dianes dels nostres estudis hi ha els microRNAs, molècules reguladores de l'expressió gènica que no havien estat avaluades fins ara en pacients migranyosos. En últim terme, es presenten els resultats preliminars d’un estudi de transcriptòmica en un model animal de depressió cortical propagant. / Migraine is a common neurological disorder that affects 15% of the population. It’s caractherized by reccurent and inhabilitating episodes of headache, often accompanied by other symptoms like photophobia, nauseas or vomiting. The prevalence of migraine is dependent on sex and age, being more frequent in adolescent and adult women. Clinically, migraine is classified in two subtypes, with and without aura, the first characterized by the appearance of neurological disturbances that preceede or accompany the migraine episode. Common migraine presents a complex ethiology, in which both genetic and environmental factors are involved. Moreover, there is a monogenic form of the disease, hemiplegic migraine, which genetic bases are known in part. This rare form of migraine turns into a good starting point to address the study of common forms of migraine. In this Thesis we have studied the genetic factors that underlie both common and rare migraine, in patients with and without aura. We have performed mutational screening, based on sequencing and CNV analysis, in patients with hemiplegic migraine and other related paroxystic disorders that have allowed the identification of several causal mutations. Moreover, case-control association studies have been performed, at both genome-wide level or on candidate genes, in order to detect risk variants for common migraine. Among the different candidates assessed, we have focused our attention mainly on microRNAs, important gene expression regulatory molecules that had not been previously explored in migraine patients. Finally, we present the preliminary results of a transcriptomic study in a rat model of cortical spreading depression.

Tesi realitzada a l'Institut Català d'Oncologia - IDIBELL / La presente tesis doctoral consta de 4 proyectos independientes centrados en el estudio de las causas genéticas del cáncer colorrectal (CCR) hereditario: A) Estudio de una variante común (rs2075786) en el gen de la telomerasa como modificador de riesgo de cáncer en síndrome de Lynch: Identificamos un incremento de riesgo de desarrollar un cáncer asociado al síndrome de Lynch (SL) en los pacientes jóvenes (<45 años) con el genotipo AA para rs2075786, los cuales mostraron telómeros más cortos que aquellos con el genotipo GG. Análisis in silico posteriores predijeron la rotura de un sitio de unión a retinoides con efecto modulador de la transcripción, lo cual podría implicar una activación más temprana de la actividad telomerasa. B) Caracterización de tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar tipo X: Se realizó una caracterización de los tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar de tipo X (CCRFX), comparando los resultados obtenidos con las características propias del CCR esporádico sin fallos en el sistema reparador de bases desapareadas. La caracterización incluyó: a) El estudio del patrón cromosómico: Los resultados obtenidos mostraron patrones de alta inestabilidad cromosómica muy cercanos a los reportados en los casos de CCR esporádico. Sin embargo, revelaron una mayor frecuencia de ganancias en los brazos 2p y 2q, y una mayor frecuencia de pérdidas de 10q al considerar sólo los casos Ámsterdam I. b) El screening de mutaciones en los genes KRAS, BRAF, TP53 y PIK3CA, implicados en las vías de desarrollo del cáncer: Mientras que las frecuencias mutacionales de KRAS, BRAF y PIK3CA alcanzaron valores similares en los dos grupos estudiados, los tumores CCRFX mostraron una carga de mutaciones para TP53 cercana a la mitad de la identificada en los tumores de colon esporádicos, aunque esta diferencia no alcanzó niveles significativos. c) El análisis del estado de metilación de las islas CpG: El estudio de 25 tumores CCRFX identificó un bajo nivel de metilación general para la gran mayoría (88%) de los tumores analizados (≤3/8 promotores de genes metilados). C) Caracterización de tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar tipo X: Realizamos la secuenciación del dominio exonucleasa de POLE y POLD1 en 441 pacientes con CCR familiar no polipósico y en otros 88 afectos de poliposis. Como resultado, se identificaron seis mutaciones nuevas o raras en POLD1, cuatro de ellas mostrando evidencias de patogenicidad. Además, se realizó una revisión exhaustiva de los casos identificados previamente en la literatura, elaborándose unas guías de recomendación para el estudio genético de POLE y POLD1, así como para el seguimiento preventivo de portadores. D) Búsqueda de la causa genética del CCRFX mediante ultra-secuenciación de exomas: Con la intención de identificar genes causantes de la agregación familiar presente en el CCRFX, los exomas de tres individuos afectos con CCR de una misma familia con CCRFX fueron secuenciados. Las variantes genéticas identificadas en los tres individuos fueron sometidas a varios procesos de cribado, en base al tipo de mutación y su impacto sobre la proteína, su ausencia en poblaciones control o la relevancia de la función del gen. Varias mutaciones fueron seleccionados para su estudio en profundidad, incluyendo: cosegregación de la variante con la enfermedad, búsqueda de un segundo evento inactivante del alelo salvaje, estudios de predicción in sílico, revisión bibliográfica o búsqueda de mutaciones adicionales en series de pacientes con CCR familiar. En base a los resultados obtenidos, propusimos un modelo poligénico en el que mutaciones en los genes BRF1, BARD1 y CLCA1 estarían contribuyendo a la predisposición al CCR presente en la familia estudiada. / The herein thesis “Caracterización molecular y búsqueda de causas genéticas del cáncer colorrectal hereditario no polipósico” (in English, “Molecular characterization and search for genetic causes in the hereditary non-polyposis colorectal cancer”) comprises four different studies: A) Genetic variant rs2075786 in the telomerase gene modifies cancer risk in Lynch syndrome: We found an association between the rs2075786 A allele, specially in homozygosity, with increased cancer risk of developing cancer in Lynch syndrome (LS) carriers under the age of 45. Besides, cancer-affected LS patients with the AA genotype have shorter telomeres than those with GG. In silico studies predicted that the SNP causes the disruption of a transcription binding site for a retinoid receptor, probably provoking early telomerase activation. B) Comprehensive molecular characterisation of hereditary non-polyposis colorectal tumours with mismatch repair proficiency. Hereditary non-polyposis colorectal tumours showed presence of high chromosomal instability and a higher frequency of chromosome 2p and 2q gains and of 10 q loss, when comparing to sporadic colorectal tumors with mismatch repair proficiency. No statistically significant differences between these two groups were found in the frequency of BRAF, KRAS, PIK3CA and TP53 mutations. Besides, hereditary non-polyposis colorectal tumours showed a low degree of CpG islands methylation. C) Study of the impact of POLE and POLD1 mutations in the familial colorectal cancer and/or polyposis. The exonuclease domains of POLE and POLD1 were studied 441 kindreds with familial non-polyposis colorectal cancer (CRC) and 88 with polyposis. Six novel or rare POLD1 variants, four of them with strong evidence for pathogenicity, were identified in non-polyposis CRC families. We also suggested some recommendations for POLE and POLD1 mutation screening and to define the clinical management of mutation carriers D) Search for the genetic cause of the colorectal cancer type X by whole-exome sequencing. In order to find the genetic cause of the familial colorectal cancer type-X, we sequenced the whole exome of three CRC affected relatives from the same type-X family. After several steps of mutations filtering and extensive experimental and in silico studies, we proposed a poly-genic model to explain the CRC aggregation within the family, in which mutations in BRF1, BARD1 and CLCA1 would be contributing to the familiar CRC predisposition.

Históricamente, los individuos portadores de alelos premutados se consideraban asintomáticos dado que no manifestaban discapacidad intelectual. Sin embargo, desde el año 2000 se han descrito dos patologías de aparición tardía asociadas específicamente a estos individuos: la insuficiencia ovárica primaria (FXPOI; OMIM#311360, ORPHA619) y el síndrome de temblor/ataxia asociado al X-Frágil (FXTAS; OMIM#300623, ORPHA93256). No obstante, cada vez es más evidente que existe un amplio espectro de manifestaciones clínicas que abarca alteraciones cognitivas, psiquiátricas, endocrinas e inmunológicas que afecta en cierto grado a los individuos portadores de la premutación. Un factor que tienen en común todas las patologías asociadas a la premutación es la penetrancia reducida, es decir, no todos los individuos portadores de alelos premutados desarrollaran alguna de estas patologías y en cambio otros pueden llegar a desarrollar varías de ellas. En este contexto, el desarrollo de las tecnologías de alto rendimiento ha proporcionado herramientas científica y metodológicamente prometedoras para el avance del conocimiento sobre las causas y mecanismos involucrados en las enfermedades complejas. El objetivo principal de esta tesis doctoral es el de ampliar el conocimiento de las bases moleculares de las patologías asociadas a la premutación, principalmente en FXPOI y FXTAS. En el trabajo I se han utilizado microarrays de expresión para la determinación del transcriptoma en sangre periférica de mujeres portadoras de la premutación con y sin FXPOI. El análisis de enriquecimiento funcional ha puesto de manifiesto la infraexpresión de vías moleculares de señalización indispensables para la activación de los folículos primordiales, el mantenimiento de su supervivencia y la maduración de los oocitos. Por otra parte, en el trabajo II se ha utilizado la secuenciación masiva de los ARNs de pequeño tamaño y microarrays de expresión de miRNAs para determinar el perfil de expresión de los miRNAs en muestras de sangre periférica de pacientes FXTAS. Este estudio ha demostrado que la biogénesis de los miRNAs no está alterada en este tejido, sin embargo existe una desregulación de su expresión por lo podrían estar implicados en la patogénesis del FXTAS. Por otro lado, los resultados del trabajo III sugieren que la inactivación preferencial del cromosoma X en las mujeres portadoras de la premutación del gen FMR1contribuye significativamente en el riesgo a desarrollar FXTAS, ya que existe un incremento significativo de la inactivación preferencial en las mujeres portadoras de la premutación respecto a la población control. Además, el patrón de inactivación es totalmente distinto. De manera que todas las mujeres con FXTAS con inactivación preferencial inactivaban preferencialmente el alelo normal mientras que las asintomáticas inactivaban preferencialmente el alelo expandido. Finalmente, se ha puesto de manifiesto una disfunción mitocondrial en los fibroblastos de pacientes con FXTAS. Este estudio identificó la disminución de la capacidad oxidativa de los fibroblastos de pacientes con FXTAS, la cual no puede ser atribuida a un menor número de mitocondrias ya que el análisis de la actividad de la enzima citrato sintasa, mostró niveles similares entre pacientes y controles. Además, el estudio mediante microscopia confocal reveló que la red mitocondrial de los pacientes con FXTAS es significativamente más circular y se encuentra menos interconectada que en el grupo control. / For many years, there was no a priori expectation for clinical involvement in the premutation range, since these individuals do not present intellectual disability. However, it is now clear that at least two distinct clinical phenotypes among carriers of premutation alleles: fragile X-associated primary ovarian insufficiency (FXPOI) and fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS). Premutation alleles are hyper-expressed and disease symptoms result from the deleterious consequences of high levels of expression of the transcript with large numbers of CGG-repeats. There is a lingering difficulty with our understanding of the FMR1 premutation-associated disorders; that is, the inability to predict who will develop any of the particular phenotypes. The major objective of this doctoral thesis is to deep knowledge of molecular mechanisms underlying FMR1 associated pathologies, mainly FXPOI and FXTAS. In the first study, transcription profiling of total blood from FMR1 premutation female carriers with and without FXPOI revealed the deregulation of key signaling pathways involved in oocyte maturation in FXPOI females. These results suggest that the impairment of fertility in these females might be due to a generalized deregulation rather than defects in a single gene. In the second study, it was evidenced a differential miRNA expression profiling in FXTAS blood samples suggesting that miRNAs are involved in FXTAS pathogenesis. In the third study, it was detected differences regarding the allele presenting severe skewed X-chromosome inactivation between the FXTAS and no-FXTAS groups. This finding suggests that skewed X-chromosome inactivation of the normal FMR1 allele may be a risk factor for the development of FXTAS. Finally, mitochondrial dysfunction was evidenced in skin fibroblasts from FXTAS patients. Furthermore, alteration of the mitochondrial network was also observed in FXTAS skin fibroblasts. Collectively, these results indicate that both mitochondrial function and dynamics are implicated in the pathophysiology and/or aetiology of neurological symptoms from FXTAS patients.

Metallothioneins (MTs) are a superfamily of ubiquitous and small cysteine rich metalloproteins present in all eukaryotes and some prokaryotes organisms, that exhibit preferences to coordinate divalent or monovalent heavy metal ions such as Zn(II), Cd(II) or Cu(I). This ability is used by MTs to participate in toxic metal detoxification, metal ion homeostasis and protection against oxidative stress. Features of MT sequences, as well as their structural arrangements, are crucial to determine their metal-abilities and the related functions. In this PhD thesis, we aimed at expanding the knowledge of some peculiar MTs, which are characterized by their unusual long sequence, their Cys-distribution and their modular folding. Thus, initially, the five Tetrahymena thermophila MTs (MTT1 to MTT5), which represent one of the longest MTs reported so far, were characterized to decipher their divalent or monovalent metal preferences. The modular structure of MTT1, MTT3 and MTT5 isoforms, which contain high occurrence of doublets and triplets confer a clear Zn-character to these MTs. Contrarily, MTT2 and MTT4 in which no modular structures, nor Cys doublets and triplets, are present, exhibit a specific Cu-thionein character. The gradation of metal-binding preferences from Zn-thionein to Cu-thionein shown by each MT, as well as the sequence features, constitute an important information source for MT evolutionary studies. Later, two other MTs from the human pathogenic opportunistic fungus Cryptococcus neoformans (CnMT1 and CnMT2) were characterized. Their unusual long sequence, not known in fungal MTs so far, together with their high Cys content, explained their extraordinary Cu detoxification capacity. The modular structure of CnMT1 and CnMT2, with three and five 7-Cys containing regions, respectively, separated by cysteine-free spacers, leads to their folding into Cu5 clusters upon Cu coordination, which enhances their detoxification capacity. This extraordinary ability becomes decisive for C. neoformans virulence in order to avoid the copper toxicity induced by macrophages during mammalian host infection. The sequence analysis of these Cys-rich regions in CnMTs revealed their homology to other well characterized fungal MT models, as Neurospora crassa and Agaricus bisporus MTs, whose Cys pattern almost exactly coincides with that found in CnMTs, this supporting the emergence of the long C. neoformans MTs by ancient tandem repetitions of a primeval fungal MT unit. Finally, in this work other hypothetical fungal MTs were identified in silico, among which those of other human opportunistic pathogenic fungi such as Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis or Fusarium genus fungi. The strategy used in our group to characterize MTs, allowed us to identify a new fungal MT from F. verticillioides which presents the same Cu-thionein features (Cu5 clusters) than each Cys-building blocks from C. neoformans MTs. Evenly, the characteristics presented in F. verticillioides MT is extensible to F. graminearum and F. oxysporum MTs, given that the MT sequences are identical. Overall, this PhD thesis work contributes to enlarge the current limited knowledge about molecular evolution of unicellular eukaryote MTs and at the same time, it opens the door to characterize new pathogenic fungal MTs, whose results may provide interesting conclusions to decipher the role of MTs as virulent determinants and its function as Cu detoxifying. / Les Metal•lotioneïnes (MTs) són una superfamília de metal•loproteïnes petites, ubiqües i riques en cisteïna, presents en tot els eucariotes i alguns organismes procariotes, que coordinen metalls pesants divalents o monovalents com el Zn(II), el Cd(II) o el Cu(I). Aquesta habilitat és utilitzada per les MTs per participar en la detoxificació de metalls, en l'homeostasi d'ions metàl•lics i la protecció contra l'estrès oxidatiu. Les característiques de les seqüències de MT, així com la disposició estructural, són crucials per determinar les seves habilitat metàl•liques i les funcions que se'n deriven. Aquesta tesi pretén ampliar el coneixement d'algunes MTs peculiars, que es caracteritzen per la seva llarga seqüència inusual, la seva distribució de cisteïnes i el seu plegament modular. S'han caracteritzar les cinc MTs de Tetrahymena thermophila (MTT1 a MTT5), sent de les més llargues identificades fins ara. L'estructura modular de MTT1, MTT3 i MTT5, contenen un elevat nombre de doblets i triplets de cisteïna, conferint-los un caràcter de Zn-tioneïna. Contràriament, MTT2 i MTT4, les quals no contenen estructures modulars, ni doblets ni triplets, exhibeixen un caràcter específic de Cu-tioneïna. Els resultats obtinguts en les anàlisis constitueixen una font important d'informació per a l'estudi d'evolució de les MTs. Seguidament, es van caracteritzar dos MTs del fong oportunista patogen d'humans Cryptococcus neoformans (CnMT1 i CnMT2). La seva llarga seqüència, no descrita en MTs de fongs fins el moment, juntament amb l'elevat contingut en cisteïnes, expliquen la seva extraordinària capacitat de detoxificació del Cu. L'estructura modular amb tres (en CnMT1) i cinc (en CnMT2) blocs de 7-cisteïnes cadascun, separats per espaiadors lliures de cisteïnes, permeten el seu plegament en clústers Cus, millorant les seves capacitats detoxificants. Aquesta habilitat resulta decisiva per la virulència de C. neoformans, evitant la toxicitat per coure, induïda pels macròfags durant la infecció de l'hoste, en mamífers. Cadascun d'aquests blocs presenta homologia amb altres MTs de fongs models, com són la MT de Neurospora crassa o la d'Agaricus bisporus, fet que suggereix que les CnMT1 i CnMT2 van evolucionar a partir de repeticions en tàndem d'una mateixa MT primitiva. Finalment, es presenta també la identificació in silico d'MTs hipotètiques d'altres fongs patògens, entre les quals es troben les MTs del gènere Fusarium, i d'entre les que s'ha caracteritzat una nova MT.

La formació d’un sistema nerviós fou una innovació clau en l’evolució dels animals que va permetre desenvolupar una comunicació ràpida i eficient entre les cèl·lules d’un organisme a mesura que n’augmentava la complexitat. Analitzar la neurogènesi embrionària en el major nombre possible d’organismes és, per tant, necessari per reconstruir quin fou el mode ancestral de neurogènesi als metazous. Recentment s’ha descrit que el procés de formació d’aquest sistema d’òrgans pot ser acotat a una sèrie de passos discrets que estan controlats per xarxes gèniques comunes entre organismes model ben establerts. En general, el primer pas d’aquest procés es caracteritza per la separació de l’ectoderma neurogènic i epitelial durant la gastrulació de l’embrió; posteriorment, l’ectoderma neurogènic, o neuroectoderma, es regionalitza en els diferents eixos de coordenades i s’amplifica en quant a nombre de cèl·lules, i, finalment, dona lloc al sistema nerviós. Als Spiralia, un dels dos principals clades d’animals protòstoms, els estudis sobre les qüestions relacionades amb aquests processos s’han centrat als mol·luscs i anèl·lids mentre que poc se sap de la resta de fílums. Així doncs, en aquesta tesi ens hem plantejat utilitzar la planària d’aigua dolça Schmidtea polychroa, un platihelmint amb un sistema nerviós morfològicament simple, per a caracteritzar l’organogènesi dels sistemes nerviosos central, perifèric, i visual, i, posteriorment, analitzar alguns dels mòduls conservats de la neurogènesi dels organismes bilaterals. La nostra estratègia s’ha basat en l’estudi del marcatge amb anticossos neurals i amb l’anàlisi de l’expressió de gens pan-neurals i de subpoblacions neuronals per proposar un model de desenvolupament del sistema nerviós durant l’embriogènesi d’aquella espècie. Els resultats d’aquesta tesi demostren l’origen de novo a l’estadi 4 i a partir d’una població de cèl·lules embrionàries determinades d’aquell sistema d’òrgans; posteriorment, aquestes cèl·lules conjunten en un primordi nerviós bilateral situat al futur pol ventral de l’embrió que serà l’origen d’estructures nervioses com el cervell o els cordons nerviosos laterals i ventrals. A més, també hem determinat la dinàmica temporal i espaial de desenvolupament dels ulls durant l’embriogènesi més tardana; en concret, aquests òrgans es formen a la part més anterior de l’organisme i des d’una cèl·lula precursora comuna que, més tard, es separarà en els primordis de l’ull dret i esquerra. Finalment, hem aïllat i caracteritzat gens ortòlegs del grup soxB i un conjunt de membres dels bHLH proneurals, que són famílies gèniques amb un paper ben establert en la determinació de l’ectoderma neurogènic i l’especificació neuronal, així com també de gens associats amb la diferenciació dels ulls, com ara els membres de la xarxa gènica controlada per pax6 i també altres factors de transcripció com rx, otxA o atonal. L’anàlisi molecular d’aquests mostra, per una banda, que un ortòleg de la família soxB1 es detecta en el presumptiu neuroectoderma de l’embrió i en cèl·lules progenitores neuronals, mentre que els gens de les famílies soxB2, achaete-scute, neuroD i beta3, així com alguns dels gens relacionats amb el desenvolupament dels ulls, estan associats amb l’especificació de poblacions neuronals. En conjunt, els nostres resultats suggereixen que els principals mecanismes moleculars de control de la neurogènesi es troben substancialment conservats als tríclads, tot i que aquests animals mostren un patró embrionari que divergeix clarament de l’ancestral de la resta d’organismes espirals. En resum, la nostra tesi expandeix la comprensió actual de la neurogènesi dels animals bilaterals i, alhora, proporciona un marc bàsic per a futurs estudis sobre el desenvolupament embrionari de les planàries. / The development of a nervous system is a key innovation in the evolution of metazoans, which is illustrated by the presence of a common developmental toolkit for the formation of this organ system. Neurogenesis in the Spiralia, and in particular the Platyhelminthes, is, however, poorly understood when compared with other animal groups. In this thesis we used the planarian Schmidtea polychroa, a free-living flatworm with a morphologically simple nervous system, as a model organism for studying the organogenesis of the central, peripheral and visual nervous systems. Using a combination of immunolabelling and gene expression analysis of neural-specific markers we show that the nervous system is formed de novo from a population of embryonic cells when the embryo adopts the definitive axial identities. Later on, these cells aggregate in a bilateral neural primordium which differentiates the brain, and the ventral and lateral nerve cords. Also, during this late embryonic phase, the eyes develop in the anterior-most part of the organism from a shared precursor. To further understand the early steps of neurogenesis, we isolate and characterize soxB and a set of bHLH genes, which are gene families with a well-established role in metazoan neural development, and genes associated with the specification of eye cell types -in particular, the pax6-gene network and transcription factors of the otx and rx families. Thus, we demonstrate that soxB1-1 is expressed in the putative neuroectoderm and neural progenitor cells, whereas soxB2, neural bHLH genes (achaete-scute, neuroD and beta3), and the eye-related genes so, eya and otxA are associated with the specification of neural subpopulations. Altogether, our findings suggest that the ancestral neural-specific gene regulatory network is substantially conserved in triclad, despite exhibiting a divergent mode of development. In summary, this thesis expands the current understanding of bilaterian neurogenesis and provides a basic framework for further studies in planarian embryonic development. / La formación de un sistema nervioso fue una innovación clave en la evolución de los animales que permitió desarrollar una comunicación rápida y eficiente entre las células de un organismo a medida que aumentaba la complejidad. Analizar la neurogénesis embrionaria en el mayor número posible de organismos es, por lo tanta, necessario para reconstruir cual fue el modo ancestral de neurogénesis de los metazoos. Recientemente se ha descrito que ese proceso puede ser definido con un conjunto de pasos o etapas que están controlados por redes génicas comunes entre organismos modelo bien establecidos. En general, el primer paso de la neurogénesis implica la separación del ectodermo neurogénico y epitelial durante la gastrulación del embrión; posteriormente, el ectodermo neurogènico, o neuroectodermo, se regionaliza en los principales ejes de coordenadas y se amplifica en cuanto a número de células y, finalmente, da lugar a las células nerviosas. En los organismos del grupo de los Spiralia, uno de los dos principales clados de protóstomos, los estudios sobre temas relacionados con esas etapas se han centrado en los moluscos y anélidos mientras que poco se sabe del resto de filos del grupo. Así pues, en esta tesis doctoral nos hemos planteado utilizar la planaria de agua dulce Schmidtea polychroa, un platihelminto con un sistema nervioso morfológicamente simple, para caracterizar la organogénesis de los sistemas nerviosos central, periférico, y visual, y, posteriormente, analizar algunos de los módulos conservados de la neurogénesis de los organismos bilaterals. Inicialmente nuestra estrategia se basó en el estudio del marcaje con anticuerpos específicos neurales y con el análisis de la expresión de genes pan-neurales y de subpoblaciones neuronales para proponer un modelo de desarrollo del sistema nervioso durante la embriogénesis de esta especie. Los resultados de nuestra tesis demuestran el origen de novo en el estadio 4 y a partir de una población de células embrionarias determinadas del sistema nerviosos definitivo; más tarde, estas células se condensan en un primordio nervioso bilateral situado en el futuro polo ventral del embrión que será el origen de estructuras como el cerebro o los cordones laterales y ventrales. Además, también hemos determinado la dinámica temporal y espacial de desarrollo de los ojos durante las etapas más tardías de la embriogénesis: estos órganos se forman en la parte más anterior del embrión y a partir de unas células precursoras comunes que se separarán en los primordios de los ojos derecho e izquierdo. Por último, hemos aislado y caracterizado genes ortólogos del grupo soxB y un conjunto de miembros de los bHLH proneurales, que son familias génicas con un papel bien establecido en la determinación del ectodermo neurogénico y la especificación neuronal, y también de genes asociados con la diferenciación de los ojos, como por ejemplo los miembros de red génica controlada por pax6 y también otros factores de transcripción como rx, otx o atonal. Su análisis molecular muestra que un ortólogo del grupo soxB1 se detecta en el putativo neuroectodermo del embrión y en células progenitoras neuronales de S. polychroa, mientras que los genes de los grupos soxB2, achaete-scute, neuroD y beta3, así como algunos genes relacionados con el desarrollo de los ojos, están asociados con la especificación de diferentes poblaciones neuronales. En conjunto, nuestros datos sugieren que, a pesar de que los tríclados muestran un patrón de desarrollo del zigoto que difiere claramente del patrón típico de la segmentación espiral, los principales mecanismos moleculares de control de la neurogénesis se encuentran conservados en su grupo. En resumen, nuestra tesis doctoral expande la comprensión sobre el desarrollo del sistema nerviosos de los bilaterales a la vez que proporciona un marco básico para futuros estudios con embriones de planarias.

El dogma central de la biología molecular establece que la información génica contenida en el DNA se transcribe a RNA y de este se traduce en forma de proteína. En nuestro caso recorreremos el camino en sentido inverso: de las proteínas a los genes. Un sistema biológico debe explicarse en términos de actividad, regulación y modificación de sus proteínas, los principales efectores en último término de cualquier fenotipo observado. El conjunto de las proteínas expresadas en cada momento dependiendo del tipo celular y de los estímulos recibidos se conoce como proteoma y constituye el objeto de estudio de la proteómica. El primero de los dos grandes proyectos que se tratarán en esta tesis aborda la caracterización del proteoma de los neoblastos, las células madre de la planaria, un invertebrado del filo de los platelmintos (literalmente “gusanos planos”) con unas particularidades que lo hacen un modelo de gran valor para el estudio in vivo de las células madre. Sin embargo, las técnicas que brinda la proteómica en la actualidad, si bien han demostrado su utilidad y su potencial, no son aún lo bastante resolutivas como para dar respuesta a muchas de las preguntas que nos plantea la compleja biología del neoblasto. Este término engloba a una población de células que se está revelando mucho más heterogénea de lo que se había presumido hasta hace pocos años. Por ello, ha sido necesario descender al nivel inmediatamente anterior a la traducción en la cadena de eventos moleculares y sacar partido de la ventaja tecnológica que proporciona actualmente el estudio del RNA con la nueva generación de plataformas secuenciadoras para intentar dilucidar los misterios de la biología de estas células madre. El estudio de cualquier población celular requiere identificarla no solo a través de una descripción morfológica y funcional de las células que la componen sino que es imprescindible encontrar marcadores que permitan aislarla y, llegado el caso, subdividirla en grupos de células con características aún más concretas. Este es el caso de la población de neoblastos, dada la heterogeneidad celular por la que necesariamente está compuesta. Para poder llevar a cabo estos análisis high-throughput ha sido necesario desarrollar técnicas experimentales y computacionales. A nivel experimental cabe destacar la puesta a punto del protocolo de cell sorting para el aislamiento de los neoblastos. En el campo computacional, se han desarrollado pipelines de ensamblado transcriptómico y mapeado sobre las secuencias de referencia, y se han implementado los métodos estadísticos necesarios para determinar aquellos genes diferencialmente expresados en neoblastos. Estos genes han sido validados en el laboratorio para corroborar su expresión en neoblastos y observar el fenotipo tras su inhibición. Algunos, además, han sido caracterizados con mayor detalle (Smed-SmB, Smed-meis-like, Smed-nf-YA/YB-2/YC), lo que ha servido para profundizar en el conocimiento de la biología de los neoblastos. / A biological system can be explained in terms of activity, regulation and modification of its proteins, the main effectors at last of any observed phenotype. The set of proteins being expressed on each cellular type under distinct given inputs has been defined as the proteome and is the focus of the Proteomics field. First of the main two projects described in this thesis has approached the proteome characterization of neoblasts. Those are the stem cells of planarian, an invertebrate species from platyhelmintes phylum that has some relevant features to consider as a model organism for the stem cells research in vivo. Despite their usefulness and potential, proteomic approaches have not enough resolution to bring answers to many of the questions posed by the complex biology of the neoblast. This term comprises a cell population that became more heterogeneous than expected until nowadays. Therefore, it was necessary to deep into the previous step to the translation, taking advantage of the technological developments achieved with the new generation of sequencing platforms for the analysis of RNA sequences, in an attempt to shed light over the biology of the planarian stem cells. Beyond morphological and functional characterization, given the heterogeneity of the neoblasts populations, it is a must to identify specific markers that will assist in their isolation and even subdivide them into cell sets with specific traits. In order to perform those high-throughput analyses both experimental and computational techniques had to be deployed; among the first ones, it is worth to mention the set up for cell sorting to isolate neoblasts, while on the bioinformatics side there was the need to develop pipelines to process, assemble, and map the transcripts found over the reference sequences. Statistical methods were then applied to determine differentially expressed genes in neoblasts. Those genes have been experimentally validated to confirm their expression in neoblasts and to observe the resulting phenotype after their knock-down. Few genes have been analyzed with greater detail (Smed-SmB, Smed-meis-like, Smed-nf-YA/YB-2/YC), to deep into the neoblast biology.