Aquesta tesi es centra en l’anàlisi genètica dels següents trastorns neurològics paroxístics pediàtrics: el torticoli paroxístic benigne del lactant (TPBL), l’hemiplegia alternant de la infància (HAI), la discinèsia paroxística cinesigènica (DPC) i el síndrome de la deficiència del transportador de glucosa GLUT1 (GLUT1DS); i en l’anàlisi genètica i epigenètica de la migranya, un trastorn neurològic paroxístic majoritàriament de l’adult. Els trastorns neurològics paroxístics pediàtrics analitzats són trastorns rars, poc estudiats, en els quals la simptomatologia i el patró d’herència han portat a sospitar-ne una base monogènica i un vincle amb el grup de les canalopaties neuronals. La dificultat en el seu estudi deriva, majoritàriament, de la manca de sèries importants de pacients de les quals se’n puguin obtenir conclusions extrapolables. L’interès d’aprofundir en el seu coneixement, a banda del propi interès científic, rau en trobar les causes que els originen i, així, poder trobar un tractament contra aquests trastorns, millorar la qualitat de vida dels pacients que els sofreixen i/o poder oferir consell genètic als familiars dels individus afectes. - El cribratge mutacional en 2 pacients afectes de TPBL ha identificat la mutació p.Glu533Lys en el gen CACNA1A com a causant de la malaltia, junt amb els estudis funcionals que indiquen que aquesta mutació provoca una pèrdua de funció de la proteïna codificada. - El cribratge mutacional en una cohort de 10 pacients d’HAI ha identificat 3 mutacions en el gen ATP1A3 (p.Asp801Asn, p.Glu815Lys i p.Gly947Arg) en 5 dels pacients, remarcant l’existència d’una heterogeneïtat genètica major de l’esperada en aquest trastorn. - El cribratge mutacional en la DPC ha identificat 3 mutacions diferents en el gen PRRT2 en 8 dels 10 pacients (c.649dupC, c.649delC i c.219_220delGA) descrivint per primera vegada tant la mutació c.219_220delGA com la presència de la c.649dupC i la c.649delC en un mateix pacient. - El cribratge mutacional en la GLUT1DS va permetre trobar mutacions de novo en el gen SLC2A1 en 3 dels 5 pacients analitzats: la c.667C>T, la c.710_711delGA i una deleció de tot l’exó 1; remarcant l’interès en cercar delecions GLUT1DS. La migranya és un trastorn neurològic primari molt prevalent que es manifesta amb crisis episòdiques i recurrents de mal de cap incapacitant. Els criteris de la International Headache Society subclassifiquen la malaltia en diferents subtipus, incloent la migranya sense aura (MO), la migranya amb aura (MA) i la migranya hemiplègica (MH). - El cribratge mutacional de la MH va permetre identificar 4 mutacions en el gen CACNA1A (p.Ser218Leu, p.Thr501Met, p.Arg583Gln i p.Thr666Met), 2 mutacions en el gen ATP1A2 (p.Ala606Thr i p.Glu825Lys) i la mutació p.Phe1661Leu en el gen SCN1A. - L’estudi d’associació genètica a nivell genòmic (GWAS) de la MO va permetre la identificació de 2 SNPs associats a MO, un localitzat en el gen MEF2D i l’altre proper al gen TGFBR2. També es van trobar SNPs que suggerien una tendència a la replicació en el gens PHACTR1 i ASTN2. A més a més, es van replicar els resultats obtinguts en un GWAS anterior, trobant novament associats a migranya els gens TRPM8 i LRP1. Aquest estudi va permetre identificar el primer loci d’associació a susceptibilitat a patir MO. - L’estudi epigenètic en un model de MA va permetre trobar diferències de metilació de l’ADN degudes al tractament amb àcid valproic o topiramat o a l’efecte de la depressió cortical propagant (DCP), el fenomen subjacent de l’aura, en gens que podrien estar relacionats amb la susceptibilitat a patir migranya. Els resultats podrien indicar que ambdós tractaments protegeixen davant les DCPs degut al seu efecte sobre la metilació de l’ADN, emfatitzant la importància dels mecanismes epigenètics en la susceptibilitat de la migranya. / This thesis is focused on the genetic analysis of the following neurological paediatric paroxysmal disorders: benign paroxysmal torticollis of infancy (BPTI), alternating hemiplegia of childhood (AHC), paroxysmal kinesigenic dyskinesia (PKD) and GLUT1 deficiency syndrome (GLUT1DS); and on the genetic and epigenetic analysis of migraine, a neurological paroxysmal disorder mainly found in adults. The neurological paediatric paroxysmal disorders analyzed are rare and present a simptomatology and an inheritance that suggest a monogenic origin and a link with the neuronal channelopathies. The lack of significant cohorts of patients from which obtain transferable conclusions makes it difficult to study them. The main interest of their study, besides the own scientific interest, is based on finding the underlying causes of the disorder which would be the first step to find the appropriate treatment, improve the quality of life of the patients and/or be able to offer genetic counselling to the patients relatives. The results of this study are resumed below: - The mutational screening in 2 patients of BPTI identified the p.Glu533Lys mutation in the CACNA1A gene as the genetic cause of this disorder, in line with the functional studies that indicate that this mutation induces a loss-of-function of the coding protein. - The mutational screening in a cohort of 10 patients of AHC identified 3 mutations in the ATP1A3 gene (p.Asp801Asn, p.Glu815Lys and p.Gly947Arg) in 5 patients, highlighting the existence of a greater genetic heterogeneity than expected in this disorder. - The mutational screening in PKD identified 3 different mutations in the PRRT2 gene in 8 out of 10 patients (c.649dupC, c.649delC and c.219_220delGA), describing for the first time the mutation c.219_220delGA and also the presence of both the duplication and the deletion in the c.649 position in the same patient. - The mutational screening in 5 patients of GLUT1DS identified de novo mutations in the SLC2A1 gene in 3 patients, specifically c.667C>T, c.710_711delGA and a deletion affecting the whole first exon, highlighting the interest in looking for deletions in GLUT1DS. Migraine is a common primary neurological disorder that presents with episodic and recurrent attacks of disabling headache. The criteria of the International Headache Society divide the disorder into different subclasses, including migraine without aura (MO), migraine with aura (MA) and hemiplegic migraine (HM). The results of the genetic and epigenetic studies of migraine are resumed below: - The mutational screening of HM identified 4 mutations in the CACNA1A gene (p.Ser218Leu, p.Thr501Met, p.Arg583Gln and p.Thr666Met), 2 mutations in the ATP1A2 gene (p.Ala606Thr i p.Glu825Lys) and the mutation p.Thr501Met in the SCN1A gene. - The genome wide association study (GWAS) of MO identified 2 SNPs associated with MO, one in the MEF2D gene and the other close to the TGFBR2 gene. There were SNPs that showed suggestive evidence of replication at PHACTR1 and ASTN2 genes. Moreover, previous GWAS findings were replicated, finding the genes TRPM8 and LRP1 associated with migraine. This study allowed the identification of the first loci associated with MO. - The epigenetic study in a MA rat model identified DNA methylation differences due to the administration of valproate and topiramate drugs and/or due to the cortical spreading depression (CSD) effects in genes that could be related to the migraine susceptibility. These results could indicate that both treatments protect against CSD due to their effects on DNA methylation, highlighting the importance of the epigenetic mechanisms in the migraine susceptibility.

El complexos SWI/SNF són remodeladors de cromatina dependents d’ATP que es troben altament conservats al llarg de l’evolució. Aquests complexos poden regular l’accessibilitat a una zona genòmica alterant l’estat de la cromatina i actuant com a reguladors transcripcionals. A més d’una subunitat enzimàtica central i diverses proteïnes que conformen el nucli, els complexos SWI/SNF incorporen subunitats accessòries que confereixen especificitat i varien segons el tipus cellular i el context del desenvolupament. Les poteïnes accessòries humanes BAF60a, BAF60b i BAF60c representen proteïnes paràlogues amb funcions especialitzades, de manera que mutacions en elles s’han relacionat amb diverses malalties (p. ex. càncer). Per tal de tenir una millor visió de les funcions de les unitats accessòries del complex SWI/SNF hem estudiat els paràlegs de les proteïnes BAF, codificades pels gens ham-3 i swsn-2.2. Hem investigat les funcions de ham-3 i swsn-2.2 en diversos teixits i processos del desenvolupament i hem observat que els dos gens són redundants en diversos contextos. Tot i així, i com ocorre amb els gens humans, HAM-3 i SWSN-2.2 també han adquirit funcions específiques. / SWI/SNF complexes are ATP-dependent chromatin remodelers highly conserved through evolution. By altering the chromatin state, these complexes can regulate the accessibility of a given genomic region and thereby perform transcriptional regulation. Besides a central enzymatic subunit and various core proteins, SWI/SNF complexes incorporate accessory subunits that confer specificity to a given complex and vary depending on the cell type and developmental context. The human accessory proteins BAF60a, BAF60b and BAF60c represent paralog proteins with specialized functions, and mutations in the BAF60 genes are involved in human disease (e.g. cancer). To get closer insight in the functions of SWI/SNF accessory subunits, we studied C. elegans homologs of the BAF60 proteins, encoded by the paralog gene pair ham-3 and swsn-2.2. We investigated ham-3 and swsn-2.2 functions in various tissues and developmental processes and observed that the two genes act redundantly in many contexts. However, as their human counterparts, HAM-3 and SWSN-2.2 have also acquired specialized functions.

Durante las últimas décadas ha crecido el interés en cuestiones como qué nos hace humanos o cómo difiere a nivel molecular el cerebro humano del de nuestros parientes más cercanos. Se han podido identificar cientos de genes con diferencias de expresión entre el ser humano y otros primates no humanos. Sin embargo, es importante estudiar más en detalle estos genes para comprobar si realmente están involucrados en las características específicas de nuestro cerebro. Las trombospondinas son glicoproteínas extracelulares multiméricas que modulan las interacciones entre células y con la matriz extracelular y que se han implicado en la sinaptogénesis. Dentro de la familia de las trombospondinas, los genes de la trombospondina-2 (THBS2) y trombospondina-4 (THBS4) se expresan, respectivamente, alrededor de 2 y 6 veces más en la corteza cerebral humana en comparación con la de chimpancés o macacos. Para conocer las causas de estas diferencias de expresión, hemos llevado a cabo un análisis comparativo y funcional de la región promotora de THBS4 en humanos y en chimpancés. Hemos identificado y validado un sitio de inicio de transcripción (TSS) alternativo para THBS4 que se encuentra 44 kb aguas arriba del TSS de referencia y que genera una nueva isoforma de ARNm que podría haber aparecido más tarde durante la evolución. Para comparar los niveles de expresión de ambos transcritos se realizó RT-PCR cuantitativa en diferentes tejidos humanos y en muestras de corteza cerebral de 11 humanos, 11 chimpancés y 8 macacos. Curiosamente, la nueva isoforma de THBS4 se expresa principalmente en los tejidos cerebrales. Por otra parte, la diferencia de expresión entre humanos y primates no humanos para la isoforma alternativa son consistentes con la encontrada al analizar la expresión total de THBS4. Por tanto, el aumento de la expresión de THBS4 en el cerebro humano parece estar relacionado con una mayor transcripción a partir del promotor alternativo. Para evaluar la actividad de ambas secuencias promotoras en humanos y en chimpancés, hemos llevado a cabo ensayos con un gen indicador en diferentes líneas celulares humanas. Se han encontrado diferencias significativas entre los dos promotores, aunque en las líneas de neuroblastoma que utilizamos no existen diferencias significativas entre especies. Este resultado es consistente con la búsqueda de sitios de unión de factores de transcripción en la región del promotor alternativo, ya que sólo se detectaron tres posibles sitios de unión diferentes entre ambas especies. Se ha comparado también la metilación del ADN en una isla CpG situada aguas arriba de la nueva isoforma de THBS4 en 5 humanos y en 5 chimpancés, detectando niveles bajos de metilación en ambas especies. Basándonos en las predicciones informáticas disponibles y en experimentos piloto de ChIP-Seq, hemos buscado posibles enhancers que estén controlando el promotor alternativo de THBS4, pero no hemos encontrado ningún candidato fiable. Por último, en humanos, se ha visto que hay dos haplotipos de THBS4 diferentes que se encuentran mantenidos mediante selección equilibradora. Sin embargo, la comparación experimental de ambos no muestra ningún efecto del genotipo sobre la expresión de THBS4. Aunque no se ha conseguido identificar la causa concreta del incremento en los niveles de THBS4 en humanos, en base a nuestros resultados sugerimos que la expresión diferencial del gen podría estar relacionada con una secuencia potenciadora específica del cerebro que no hemos conseguido localizar. Comprender como se encuentra regulada esta posible secuencia potenciadora podría ser relevante para entender cuales son las consecuencias funcionales de las diferencias de expresión de THBS4 sobre la evolución del cerebro y, en última instancia, darnos pistas sobre como nos convertimos en humanos. / The last decades have seen a growing interest in what makes us humans and how the human brain differs from that of our closest relatives at the molecular level. Hundreds of genes with expression differences between human and non-human primates have been identified. However, it is important to study these genes in more detail to see if they are really involved in human brain characteristics. Thrombospondins are multimeric extracellular glycoproteins that modulate cell-cell and extracellular matrix interactions and have been implicated in synaptogenesis. Within the thrombospondin family, thrombospondin-2 (THBS2) and thrombospondin-4 (THBS4) show, respectively, a ~2-fold and ~6-fold upregulation in human cerebral cortex compared to chimpanzees and macaques. To analyze the causes of these expression differences, we have carried out a comparative and functional analysis of the THBS4 promoter region in humans and chimpanzees. We have identified and validated an alternative transcription start site (TSS) for THBS4 that is located ~44 kb upstream from the known TSS and generates a new mRNA isoform that might have appeared later that the reference one during evolution. To compare expression levels of both mRNAs, we performed quantitative RT-PCR in different human tissues and cortical regions of 11 humans, 11 chimpanzees and 8 macaques. Interestingly, the new isoform of THBS4 is expressed mainly in brain tissues. Moreover, expression differences between human and non-human primate cortex for this alternative isoform are consistent with those shown for total THBS4 expression. Increased THBS4 expression in the human brain therefore appears to be related to higher transcription from the alternative promoter. To evaluate the activity of both THBS4 promoter sequences we performed reporter assays from humans and chimpanzees in different human cell lines. We have found significant differences between both promoters, but not between species, in the neuroblastoma cell lines assayed. This result is consistent with the search for transcription factor binding sites (TFBS) in the alternative promoter region, which only detected three putative TFBS differentially predicted between both species. We also compared the DNA methylation in a CpG island upstream the new isoform in 5 humans and 5 chimpanzees detecting similar low methylation levels in all of them. Based in the computational predictions available online and ChIP-Seq pilot experiments, we searched for a putative enhancer region controlling the THBS4 alternative promoter without finding any reliable candidate. Finally, in humans, THBS4 has been associated to two different haplotypes that are maintained by balancing selection, but experimental analysis did not show any effect of the genotype over THBS4 gene expression. Although we have not been able to identify the ultimate cause of the increased THBS4 levels in humans, based on all our results we suggest that the differential gene expression might be related to a brain-specific enhancer sequence that has so far escaped our scrutiny. Understanding its regulation could be relevant to the functional consequences of THBS4 expression differences during human brain evolution and ultimately could give us clues of how we became humans.

The DNA Damage response is a crucial signaling network that preserves genome integrity. This network is an ensemble of distinct but often overlapping sub-networks, where participating components exert different functions according to precise spatiotemporal frameworks. To understand how these sub-networks have been assembled and emerged along evolution, we have screened DDR components in 47 selected species covering the tree of life and analyzed their evolutionary and functional properties according to different gene ages and following a variety of classifications. This is the first time a systematic analysis covers the DDR network’s evolution as a whole. Our results indicate that most of the DDR components are ancestral genes, that all the subnetworks contain at least one representative protein traceable to Prokaryota, and that the ancestral core of the DDR machinery is mainly related to repair and is mostly built upon sensor and effector activities. Along evolution the enlargement of the network has occurred through the addition of new components that have evolved to interact and work together with the ancient ones, which may have increased the complexity of the DDR network in terms of fine-tuning and cross-talk to other pathways. / La respuesta al daño en el ADN (DDR) es una red de señalización esencial que mantiene la integridad genética. Esta red es un conjunto de sub-redes distintas, pero a menudo solapantes, donde los componentes que participan desempeñan diversas funciones según marcos espacio-temporales precisos. Para comprender cómo estas sub-redes han surgido a lo largo de la evolución y cómo se han ido ensamblando, hemos buscado componentes de DDR en 47 especies que cubren el árbol de la vida, y hemos analizado sus propiedades evolutivas y funcionales según distintas edades de genes y siguiendo varias clasificaciones. Esta es la primera vez que un análisis sistemático cubre la evolución global de la red de DDR. Nuestros resultados indican que la mayoría de los componentes de la DDR son genes antiguos, que todas las sub-redes contienen al menos un representante trazable hasta procariotas, y que el núcleo ancestral de la maquinaria de DDR está principalmente relacionado con reparación y se construyó sobre actividades de detección y efectores. A lo largo de la evolución, la ampliación de la red ha ocurrido a través de la adición de nuevos componentes que han evolucionado para interaccionar y funcionar junto a los antiguos, lo que puede haber incrementado la complejidad de la red de DDR en términos de precisión y de comunicación con otras redes.

Phototransduction is the biochemical process by which a light stimulus is converted to a neuronal signal. The process functions through complex interactions between many proteins, which work in concert to tightly control the dynamics of the photoresponse. The primary aim of this thesis is to describe how the topology and kinetics of these interactions have given rise to detectable patterns of molecular evolution. To this end, a secondary aim is to develop a comprehensive mathematical model of mammalian phototransduction, first through the improvement of an existing model of the amphibian system and then through the re-tuning of that model to fit mammalian data. The results show a striking importance of the signal recovery-related proteins in shaping the photoresponse. This is reflected in relaxed evolutionary constraint on those proteins that exert the greatest dynamic influence. Meanwhile, the proteins most central to the process, while less important dynamically, are strongly constrained due to their essentiality in proper signal transduction. / La fototransducció és el procés bioquímic pel qual un estímul de llum es converteix en un senyal neuronal. El procés funciona a través d'interaccions complexes entre moltes proteïnes, que funcionen en conjunt per controlar estretament la dinàmica de la fotoresposta. L'objectiu principal d'aquesta tesi és descriure com la topologia i la cinètica d'aquestes interaccions han donat lloc a patrons detectables d'evolució molecular. Amb aquesta finalitat, un objectiu secundari és el desenvolupament d'un model matemàtic integral de la fototransducció en mamífers, primer a través de la millora d'un model existent del sistema d'amfibis i després a través de la refinament d'aquest model per ajustar-lo a les dades de mamífers. Els resultats mostren una importància notable de les proteïnes relacionades amb la recuperació del senyal en la fotoresposta. Això es reflecteix en una relaxació de les constriccions evolutives en les proteïnes que exerceixen la major influència dinàmica. Alhora, les proteïnes més centrals per al procés, tot i essent menys importants dinàmicament, es troben fortament limitades degut a la seva essencialitat en la correcta transducció de senyal.

El carcinoma de pulmó de cèl·lula no petita (CPCNP) és un dels tumors més freqüents en la població caucàsica en què la histologia més comuna és l’adenocarcinoma. En diversos estudis clínics es va observar que un subgrup de pacients amb CPCNP avançat, amb unes característiques molt concretes (sexe femení, d’histologia adenocarcinoma i no fumador), es beneficiaven del tractament amb uns inhibidors de l’activitat tirosina quinasa (ITQ) d’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Les mutacions en aquest domini del gen EGFR, descobertes l’any 2004, van ser descrites com les responsables de les respostes als ITQ. El 90% d’aquestes mutacions són delecions en l’exó 19 i una mutació puntual en la posició L858R de l’exó 21. Tot i així, més de la meitat dels pacients amb les mutacions de sensibilitat tractats amb ITQ recauen. Una de causes més comunes és l’aparició de la mutació de resistència T790M en l’exó 20. El mètode estàndard per estudiar alteracions genètiques és la seqüenciació Sanger. Com que la seva sensibilitat de detecció es situa al voltant del 20%, en aquest treball s’han optimitzat altres tècniques més sensibles, com l’anàlisi de fragments per detectar les delecions de l’exó 19 (GeneScan) i la discriminació al·lèlica per TaqMan per a les mutacions L858R i T790M en mostres de teixit tumoral inclòs en parafina i per a mostres amb poca cel·lularitat tumoral. A continuació, s’ha realitzat tant la validació analítica (límit de detecció; quantitat mínima d’ADN mutat necessària per detectar la mutació; sensibilitat, especificitat i repetibilitat de les tècniques, i estudi de l’heterogeneïtat de les mutacions dins el tumor) com la validació clínica (respostes al tractament, supervivència i PFS dels pacients amb mutació de l’Spanish Lung Adenocarcinoma Data Base (SLADB)). Aquesta validació ha permès l’aplicació d’aquestes tècniques en l’estudi de les mutacions dels pacients inclosos en l’assaig EURTAC (primer estudi realitzat amb pacients caucàsics mutats) i la seva relació amb la resposta, supervivència i PFS dels pacients tractats amb erlotinib respecte als tractats amb quimioteràpia convencional. Per una altra banda, l’obtenció de mostra de teixit inclòs en parafina no és viable en molts pacients avançats. Es va pensar en l’ADN circulant de la sang perifèrica com a font d’informació de l’estat mutacional del tumor ja que es pot obtenir d’una manera no agressiva del pacient i permet la seva monitorització al llarg del temps. Malgrat que els processos tumorals alliberen ADN al torrent sanguini, hi ha molts altres processos biològics que incrementen la concentració d’al·lels wild type (wt). Per tal de detectar aquesta baixa concentració d’al·lels mutats en sang perifèrica, s’han optimitzat les tècniques de GeneScan i TaqMan afegint la sonda PNA en les reaccions per inhibir l’amplificació dels al·lels wt. S’ha realitzat tant la validació analítica (límit de detecció; quantitat mínima d’ADN mutat necessària per detectar la mutació; sensibilitat, especificitat i repetibilitat de les tècniques) com la validació clínica (respostes al tractament, supervivència i PFS dels pacients mutats en sang perifèrica, de l’SLADB i l’EURTAC). S’ha comprovat que aquestes tècniques són adequades, no només en l’estudi de les mutacions en teixit inclòs en parafina sinó també en mostres de sang perifèrica, en obtenir-se resultats molt semblants als descrits en la bibliografia. / Non-small-cell lung cancer (NSCLC) is a major cause of death from cancer in the Caucasian population. Some clinical studies of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) that target the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene in patients with advanced NSCLC showed that some patients with clinical and pathological factors -such as female sex, adenocarcinoma histology (the most frequent histology in NSCLC) and never smoker status- experienced rapid responses. In 2004, it was reported that the presence of somatic mutations in the kinase domain of EGFR strongly correlates with increased responsiveness to EGFR TKIs. Two types of mutation, short in-frame deletions in exon 19 and the exon 21 point mutation L858R, have been reported to comprise up to 90% of all activating EGFR mutations. However, about half of patients with these activating mutations who present dramatic initial responses will eventually develop resistance to TKI treatment. Such resistance is associated with the secondary T790M resistance mutation in exon 20. Thus far, Sanger sequencing is the conventional method used for detection of mutations in tumor cells but its sensitivity is suboptimal for clinical tumor samples because it fails to detect mutations in samples with less than 20% mutated alleles. In this study, other methods have been tested such as fragment analysis to detect exon 19 in-frame deletions (GeneScan) and allelic discrimination by TaqMan assay to detect both exon 21 L858R and T90M exon 20 point mutations from formalin fixed paraffin embedded tissue and also from samples with few tumor cells. We performed analytical validation (detection limit, minimum amount of mutated DNA necessary for detection, sensitivity, specificity and repeatability of techniques, and tumor heterogeneity) and clinical validation (treatment response, survival and progression-free survival [PFS] of EGFR mutated patients from the Spanish Lung Adenocarcinoma Data Base [SLADB]. After a successful validation process, EGFR mutations were analyzed from patients in the EURTAC trial, which was the first randomized trial comparing erlotinib with platinum-based chemotherapy as first-line treatment in non-Asian patients with EGFR mutations; treatment response, survival and PFS were assessed. However, the difficulty to obtain tumor tissue, particularly from patients with advanced NSCLC, stimulated interest in analyses using surrogate samples, such as peripheral blood, which frequently contain circulating free DNA derived from tumor tissue. This circulating free DNA could be obtained by non-invasive procedures that allow for serial tumor sampling during lung cancer screening. Although tumor processes release DNA to the bloodstream, other biological and physiological mechanisms increase the concentration of wild-type (wt) alleles. There are several drawbacks that interfere with circulating free DNA mutation detection assays like the low frequency of the mutations that occur in the tumor, their poor release to the bloodstream and the dilution effect of DNA fragments and wt DNA. Genescan and TaqMan assay were optimized to detect EGFR mutations in peripheral blood samples using PNA probe to inhibit the amplification of wt alleles. We performed analytical validation (detection limit, minimum amount of mutated DNA necessary for detection, sensitivity, specificity and repeatability of techniques) and clinical validation (treatment response, survival and PFS of EGFR mutated patients in peripheral blood samples from the SLADB and EURTAC trials). The findings suggest that GeneScan and TaqMan assay are feasible means of determining EGFR mutational status in formalin fixed paraffin embedded tissue and peripheral blood samples of advanced NSCLC patients. The results obtained agree closely with those described in the literature.

Las bases genéticas de la adaptación ecológica han sido investigadas durante muchos años mediante la exploración de regiones particulares del genoma tales como las reordenaciones cromosómicas, los polimorfismos morfológicos o las aloenzimas. El poder cada vez más apreciado de la genómica comparativa y el creciente número de genomas secuenciados ofrecen la oportunidad de comprender como se relacionan la evolución molecular, la adaptación y la variación fenotípica. Los cambios adaptativos han sido atribuidos a diferentes factores genómicos incluyendo (i) cambios en las regiones codificadoras de los genes; (ii) ganancia o pérdida de genes funcionales; (iii) alteraciones en la regulación de la expresión génica; (iv) actividad asociada a los elementos transponibles; y (v) reordenaciones cromosómics. En este trabajo nos hemos centrado en el valor adaptativo de dos factores genómicos: las inversiones cromosómicas y los genes sometidos a selección positiva. En primer lugar se investigaron siete inversiones fijadas en el cromosoma 2 de D. mojavensis, una especie cactófila que vive bajo condiciones ecológicas extremas. Diferentes mecanismos son responsables de la generación de estas inversiones, incluyendo la recombinación ectópica entre elementos transponibles y la rotura y reparación por unión de extremos no homólogos (NHEJ). Asimismo se identificaron importantes alteraciones génicas en algunas regiones asociadas a los puntos de rotura. En segundo lugar se compararon los genomas de dos especies cactófilas, D. buzzatii y D. mojavensis, con tal de caracterizar los patrones de divergencia de los genes codificantes entre dos especies con una ecología bien definida. Para cumplir con estos objetivos, el genoma de D. buzzatii fue secuenciado y anotado. Además se analizó el perfil de expresión génica a lo largo del desarrollo de D. buzzatii usando experimentos basados en la tecnología del RNAseq. Finalmente, mediante el uso de modelos de sustitución de codones se detectaron más de 1000 genes codificantes bajo selección positiva, probablemente indicativos de evolución adaptativa. / The genetic basis of ecological adaptation has been long investigated by exploring particular regions of the genomes, like chromosomal rearrangements, morphological polymorphisms or allozymes. The increasingly appreciated power of comparative genomics and the explosive number of sequenced genomes have offered the opportunity to better understand how molecular evolution relates to adaptation and phenotypic variation at the organismic level. Adaptive changes have been attributed to different genomic features including (i) changes in the coding sequences of the genes; (ii) gain or loss of functional genes; (iii) alterations of gene expression regulation; (iv) TE activity; and (v) chromosomal rearrangements. In this work we have focused on the adaptive value of two genomic features: chromosomal inversions and genes evolving under positive selection. We first investigated seven inversions fixed in chromosome 2 of D. mojavensis, a cactophilic species that lives under extreme ecological conditions. Different mechanisms were found responsible for their generation, including TE-mediated ectopic recombination and breakage and repair by NHEJ. In addition important gene alterations were identified at some of the breakpoint regions, suggesting that natural selection was the main force driving the fixation of these inversions. Secondly we compared the genomes of two cactophilic flies, D. buzzatii and D. mojavensis, in order to characterize the patterns of protein-coding gene divergence between two species with a well-defined ecology. To accomplish this objective the genome of D. buzzatii was sequenced and annotated. Furthermore, we provided an overview of the transcriptional profile along the D. buzzatii development using RNAseq-based experiments. By using codon substitution models we have detected more than 1000 protein-coding genes evolving under positive selection, likely indicative of adaptive evolution.

La raça bovina Bruna dels Pirineus és una raça càrnia autòctona de les àrees muntanyoses de Catalunya. Els treballs que conformen la present tesi doctoral pretenen optimitzar l’avaluació genètica que actualment es duu a terme en aquesta raça. Les anàlisis s'han realitzat a partir de 8.130 registres de pes al naixement i 1.245 registres de pes al deslletament de vedells nascuts entre els anys 1986 i 2010, i procedents de 12 i dos explotacions, respectivament. En aquest sentit, el primer dels treballs investiga dues fonts noves de variació genètica d'origen patern en els caràcters pes al naixement i pes al deslletament. En concret, la influència dels gens localitzats a la regió no autosòmica del cromosoma Y i la contribució de l'imprinting patern. S’ha determinat que la regió no autosòmica del cromosoma Y aporta un 2 % de la variància fenotípica del pes al naixement i un 6 % del pes al deslletament. A més, l’imprinting patern repercuteix en un 13 % de la variabilitat en el cas del pes al deslletament, però sense afectar al pes al naixement. El segon treball explora la presència d’efectes genètics additius que influeixen la variabilitat residual en el pes al naixement, i caracteritza la tendència genètica dels diferents ramats després d'anys de selecció estabilitzadora per a aquest caràcter. El model de variàncies heterogènies amb els efectes sistemàtics del tipus de part i del ramat-any-estació, també contribuint al terme residual, ha obtingut el millor ajust estadístic, detectant-se variància genètica residual amb una correlació moderada i positiva de 0,44 respecte la variabilitat genètica directa. Es van observar tendències genètiques tant positives, com negatives i nul·les per als valors millorants directes, fet que suggereix l’aplicació real de criteris heterogenis de selecció per a aquest caràcter per part dels ramaders de la raça Bruna dels Pirineus. Per als efectes genètics residuals no es van detectar tendències genètiques rellevants a excepció d'un ramat que incrementava sistemàticament la variabilitat durant els darrers anys. Finalment, a l’últim treball es descriu la presència de purga de la depressió endogàmica tenint en compte la contribució combinada de coeficients parcials de consanguinitat i del nombre de generacions transcorregudes entre l’individu consanguini i l’ancestre que origina la consanguinitat (de 1,5 a 7,5 generacions en aquestes anàlisis). En el cas de la Bruna dels Pirineus s'ha determinat un 14,6 % de vedells consanguinis amb una consanguinitat mitjana lleugerament inferior al 10 %. Aquests han representat el punt de partida per identificar un efecte decreixent de la depressió endogàmica sobre el pes al naixement a mesura que augmentava la distància generacional entre l'individu consanguini i l'ancestre que originava la consanguinitat. A tall d'exemple, un coeficient de consanguinitat parcial del 15% originaria una reducció en el pes al naixement de més de mig quilogram si el seu origen es situa 1,5 generacions enrere, mentre que es reduiria a poc més de cent grams si l'ancestre responsable es troba a l'inici de la genealogia, a 7,5 generacions de distància. En conjunt, aquests estudis aporten noves parametritzacions per capturar fonts de variabilitat genètica additiva que actualment escapen dels procediments sistemàtics d'avaluació genètica de la raça, així com modelen detalladament la contribució de la depressió endogàmica, la qual no s'acostuma a considerar en els models d'avaluació genètica. A més de la importància específica per a la Bruna dels Pirineus, les contribucions científiques derivades d'aquesta tesi doctoral representen un punt de partida molt destacable per a la indústria bovina càrnia d’arreu del món, optimitzant procediments d'avaluació que poden ser adaptats a la majoria de races. / The Bruna dels Pirineus beef cattle breed is an autochthonous breed located in the mountainous regions of Catalonia. The researches involved in this dissertation aimed to optimize the genetic evaluation procedures currently used in this cattle breed. All analyses were performed on 8,130 records of birth weight and 1,245 records of weaning weight from calves born between years 1986 and 2010 from 12 and two herds, respectively. The first research studied two new sources of sire-specific genetic variance on birth and weaning weight. More specifically, this accounted for the contribution of loci located in the non-autosomal region of Y-chromosome and paternal imprinting. It has been demonstrated that the non-autosomal region of Y-chromosome contributed 2 % of the phenotypic variance of birth weight, whereas this percentage rose up to 6 % for weaning weight. Additionally, paternal imprinting accounted 13 % of the phenotypic variability of weaning weight, although without contributing on birth weight. The second research evaluated the presence of additive genetic effects influencing residual variability of birth weight; moreover, this also characterized the within-herd genetic trend after several years of stabilizing selection. The model accounting for heterogeneous residual variance included two systematic effects in the residual term (birth type and herd-year-season) and obtained the best goodness-of-fit. This model detected a relevant source of residual additive genetic variability, that being moderately and positively correlated with direct additive genetic variability (genetic correlation: 0.44). Positive, negative and even null within-herd genetic trends were described for direct genetic effects, these suggesting heterogeneous selection criteria across herds. Focusing on residual genetic effects, there were not relevant within-herd genetic trends with the only exception of one herd that systematically increased residual variability during last years. The last research described the purge of inbreeding depression on birth weight in the Bruna dels Pirineus, after accounting for the combined contribution of partial inbreeding coefficients and the number of generations between the inbred calf and the ancestor originating identity-by-descent (from 1.5 to 7.5 generations in our case). The data set included a moderate percentage of inbred calves (14.6 %), with the average inbreeding coefficient being slightly smaller than 10 %. The effect of inbreeding depression on birth weight decreased when increasing the number of generations between the inbred calf and the ancestor originating identity-by-descent. As a representative example, a 15% partial inbreeding coefficient reduced birth weight in ~500 g or ~100 g, depending on the number of generations elapsed (1.5 and 7.5 generations, respectively). As a whole, these studies contribute novel parameterizations capturing new sources of additive genetic variability; note that they currently escape from systematic procedures of genetic evaluation in the Bruna dels Pirineus beef cattle breed. Moreover, inbreeding depression has been modeled in detail, and this parameterization can be updated in a broad range of genetic evaluation models. It is important to note that in addition to the relevance for the Bruna dels Pirineus itself, scientific developments and results from this dissertation must be viewed as a very appealing starting point for the beef industry worldwide, optimizing genetic evaluation procedures that could be applied to the majority of breeds.

El cáncer gástrico es el resultado final de un largo proceso multifactorial que se desarrolla en distintas etapas y en el que intervienen un elevado número de factores ambientales y genéticos. Los genes TFFs y MUCs codifican para las principales proteínas de formación y mantenimiento de la mucosa gástrica, mucinas y péptidos trefoil, que ejercen un papel importante en la protección del epitelio contra patógenos y otras agresiones externas, así como intervienen en la regulación de diversos procesos celulares durante la homeostasis gástrica normal. Sin embargo, su implicación en la carcinogénesis gástrica todavía es poco conocida aunque cada vez hay más evidencias de su importancia. Este trabajo profundiza en el conocimiento de los factores de susceptibilidad genética al cáncer gástrico y su objetivo principal es el análisis de la variabilidad polimórfica de los genes MUC y TFF de la mucosa gástrica y de su asociación con el cáncer gástrico y la evolución de las lesiones precursoras. Para analizar la variabilidad de estos genes se realizó una búsqueda y selección de polimorfismos en regiones funcionales de TFF1, TFF2 y TFF3 que nos permitió identificar y validar 13 variantes potencialmente funcionales (7 de ellas nuevas), que se seleccionaron para el análisis de asociación. Además, se utilizó la información de HapMap para realizar un análisis de desequilibrio de ligamiento e identificación de haplotipos en las regiones de los tres genes TFF y de los genes MUC1, MUC2 y MUC6, que nos permitió seleccionar marcadores (tagSNPs) de su variabilidad genética. Los estudios de asociación se realizaron en una población de 453 pacientes con lesiones gástricas precursoras de cáncer, en los que se evaluó la evolución de las lesiones al final de un seguimiento medio de 13 años; también se analizó una población caso-control de cáncer gástrico (365 casos y 1284 controles), anidada en la cohorte europea EPIC. En relación a la evolución de las lesiones gástricas, tres polimorfismos de la región 3’ de MUC2 se asociaron como factores protectores de la progresión, mientras que otros cuatro polimorfismos de la región 5’ se asociaron con la regresión. El análisis de haplotipos confirmó la asociación con la variabilidad genética de MUC2, cuyo efecto solo fue significativo en los pacientes infectados por H.pylori, indicando una interacción genética con la bacteria. Además, polimorfismos de MUC2 también se asociaron con cáncer gástrico, especialmente del tipo intestinal y del no cardia, sugiriendo una implicación de la mucina secretada en la carcinogénesis gástrica. Un SNP de MUC1, rs4072037, también se asoció al cáncer gástrico y, específicamente y en mayor medida, al tipo intestinal, y probablemente el del cardias, replicando las asociaciones encontradas en estudios previos. Tres variantes en la región genómica a 5’ de TFF1 se asociaron con la regresión de las lesiones y un SNP intrónico se asoció con un mayor riesgo de progresión. Además, ocho variantes en este gen y regiones reguladoras adyacentes modificaron el riesgo del cáncer gástrico del tipo intestinal. El análisis de haplotipos confirmó la asociación, evidenciando la gran variabilidad de TFF1 y sus distintos efectos en la carcinogénesis en función de las variantes que se combinen en el haplotipo. Aunque la asociación con los genes TFF2, TFF3 y MUC6 no fue tan evidente, algunos resultados indican que estos genes también podrían desempeñar un papel importante en el desarrollo de cáncer gástrico. Finalmente, polimorfismos en los genes CD14, CDH1, TLR4, TNF y PTNP11 se asociaron con la evolución de las lesiones gástricas, sugiriendo un efecto sobre las fases iniciales de la carcinogénesis gástrica, de la variabilidad en genes relacionados con la vía de señalización y respuesta inmunoinflamatoria a la infección por H.pylori. / Gastric cancer is the result of a long multistep and multifactorial process that involves well-characterized sequential stages and where a large number of environmental and genetic factors play a role. Different TFF and MUC genes encode for the main proteins involved in the formation, maintenance and repair of the protective mucous layer of the gastrointestinal tract, where they have a central defensive role against pathogens and other external challenges, as well as having a central regulatory role in cellular processes needed to maintain epithelial homeostasis. However, their role in gastric carcinogenesis is still poorly known despite recent evidences on their importance. This study has been designed with the purpose of analyzing the genetic variability of the MUC and TFF genes of the gastric mucous layer and its association with gastric cancer and with the evolution of its precursor lesions. Through database searches and gene scanning of the functional regions of TFF1, TFF2 and TFF3 we could identify and validate a total of 13 potentially functional variants, seven of which hadn’t been previously reported, that we selected for association analyses. Furthermore, through linkage disequilibrium and haplotype analyses of HapMap information for each of the three TFF and the MUC1, MUC2 and MUC6 genomic regions, we selected tagSNPs of the most common genetic variation of these regions. For the association analyses we used a population of 453 patients with gastric cancer precursor lesions whose evolution was followed for a mean period of 13 years; A case-control population (365 gastric cancer cases y 1284 controls), nested in the European EPIC cohort, was also analyzed. Three polymorphisms of the 3’ region of MUC2 were significantly and inversely associated with the progression of the lesions, appearing as protective against it, while another four polymorphisms of the 5’ region of the gene were associated with regression. Haplotype analyses confirmed this association with genetic variability of MUC2, which was significant only in H.pylori infected patients, thus suggesting a genetic interaction with the bacterium. MUC2 polymorphisms were also found associated with gastric cancer, particularly of the intestinal-type and non cardia localization, thus suggesting a role of this secreted mucin in gastric carcinogenesis. A MUC1 SNP, rs4072037, was also found associated with gastric cancer, with a stronger association with the intestinal-type and, probably, the cardia localization, which was in agreement with previous reports. Three variants at the 5’ region upstream of TFF1 were associated with the regression of the gastric lesions and an intronic SNP was associated with an increased progression risk. Furthermore, eight variants in this gene and its adjacent regulatory were associated with gastric cancer of the intestinal type. This association was confirmed by haplotype analyses, which put into evidence the large variability of TFF1 and the different effects on gastric carcinogenesis according to the different haplotypes. Although association with TFF2, TFF3 and MUC6 was not so clear, some results suggest that these genes could also have an important role in gastric carcinogenesis. Finally, polymorphisms in the CD14, CDH1, TLR4, TNF and PTNP11 genes were associated with the evolution of gastric lesions, suggesting that genetic variability in genes involved in the H.pylori signaling pathway and immunoinflamatory response, may influence the initial stages of gastric carcinogenesis.

Ara que es comença a treure l’entrellat -o si més no a tenir una nova perspectiva- de la diversitat de microorganismes present als oceans gràcies a la biologia molecular i a la metagenòmica, el següent pas és esbrinar quines són les noves funcions que aquesta amaga i com són utilitzades i per qui a l’oceà. La regulació de l’expressió gènica és la base de la versatilitat i l’adaptabilitat de qualsevol organisme al medi on viu. De l’estudi dels gens expressats d’un organisme es poden deduir correctament moltes de les característiques del medi on la seva vida es desenvolupa habitualment. En cada situació els organismes expressen solament una part del seus gens, responent tant a factors interns (per exemple el cicle cel·lular) com a factors externs (temperatura, llum, aport de nutrients...). Les tecnologies de seqüenciació massiva també s’han aplicat en l’estudi de l’expressió de les comunitats microbianes marines (metatranscriptòmica). Tanmateix, aquestes tecnologies encara no estan prou optimitzades i sovint proporcionen seqüències que no poden ser assignades a cap gen conegut. En aquesta tesi ens hem plantejat l’estudi de l’expressió gènica dels microorganismes marins a tres escales diferents: a escala de comunitat, de genoma, i de gen. L’esforç més gran ha estat estudiar l’expressió gènica a escala de comunitat, on el nostre repte ha estat desenvolupar una tècnica equivalent als mètodes “d’empremta dactilar” (fingerprinting) del DNA que s’usen de forma rutinària –com la DGGE o l’ARISA- per tal d’explorar la dinàmica dels patrons d’expressió gènica de les comunitats de microbis marins, permetent la comparació d’un gran nombre de mostres a un preu assequible i sense la necessitat prèvia de saber les seqüències dels RNA missatgers. Aquesta tècnica, batejada com a TFA (de “Transcriptome Fingerprinting Analysis”), ens ha permès estudiar I) les variacions estacionals en els patrons d’expressió gènica dels picoeucariotes marins de l’Observatori Microbià de la Badia de Blanes durant 4 anys, i II) les variacions dels patrons d’expressió al llarg d’un gradient espacial horitzontal i vertical i d’un gradient temporal. En ambdós casos, els canvis d’expressió s’han comparat amb els canvis en l’estructura de la comunitat (mitjançant l’ARISA). A escala genòmica hem estudiat la resposta transcripcional global d’un microorganisme heteròtrof a la llum. La llum és responsable d’una gran quantitat de respostes fisiològiques. Una gran part dels microorganismes del mar que utilitzen la llum ho fan mitjançant la fotosíntesis, però existeixen d’altres microorganismes que utilitzen la llum de manera diferent, com els fotoheteròtrofs, que la utilitzen per generar energia però no fixen CO2. En un dels estudis de genòmica ambiental es va descobrir la presència d’una proteïna fotoactiva, la proteorodopsina, associada a un grup de bacteris marins no cultivats. Les proteorodopsines són responsables d’un nou mecanisme de fototrofia als oceans; funcionen com a bombes de protons accionades per la llum que generen un gradient de protons a la membrana per tal de sintetitzar ATP. A escala de gen, en aquesta tesi hem estudiat mitjançant RT-PCR l’expressió del gen de la proteorodopsina en un cultiu d’una flavobacteria marina i hem vist que la llum augmentava els seus nivells d’expressió. / Recent advances have been crucial to understand, or at least to have a new perspective, on the diversity of microorganisms present in the oceans through molecular biology and metagenomics. The next step is to find out what functions are hidden within this diversity and how and when are they used. The regulation of gene expression is the basis of the versatility and adaptability of any living organism to the environment. The study of the genes expressed in an organism can help to deduce many of the characteristics of the environment. Usually, organisms express only a portion of their genes in response to both internal factors (e.g. cell cycle) and external factors (temperature, light, nutrients, etc.). Massive sequencing technologies have also been applied to the study of the expression of genes in marine microbial communities (metatranscriptomics). However, these technologies are not yet sufficiently optimized and often provide sequences that cannot be assigned to known genes. In this PhD thesis I have studied gene expression of marine organisms at three different levels: at the community level, at the genome level, and at the gene level. The major effort was dedicated to gene expression at the community level, where the challenge was to develop a technique equivalent to DNA fingerprinting methods that are routinely used -such as ARISA or DGGE- in order to explore the dynamics of gene expression patterns in marine microbial communities, allowing the comparison of a large number of samples at an affordable price and without the need for prior knowledge of the messenger RNA sequences. This technique, called TFA (from “Transcriptome Fingerprinting Analysis”), has then been used to study I) seasonal variations in gene expression patterns of marine picoeukaryotes at the Blanes Bay Microbial Observatory during 4 years, and II) changes in expression patterns along spatial horizontal and vertical gradients and diel cycles. In both cases, expression changes were compared with changes in community structure (by ARISA). At the genomic level I have studied the global transcriptional response to light of a heterotrophic microorganism. Light is responsible for a large number of physiological responses. A large fraction of marine microorganisms that use light perform photosynthesis, but there are other organisms as photo-heterotrophs, who use light to generate energy but do not fix CO2. At the gene level, we have studied the proteorhodopsin gene expression by RT-PCR in a culture of a marine flavobacterium. In a study of environmental genomics, the presence of this photoactive protein was found to be associated with a group of uncultivated marine bacteria. Proteorhodopsins are responsible of a new mechanism of phototrophy in the oceans; they act as proton pumps powered by light that generate a membrane proton gradient in order to synthesize ATP. In the present study it was found that light increased the expression levels of the proteorhodopsin gene.