La gran mayoría de planarias son capaces de regenerar, y cuando lo hacen, invariablemente mantienen la polaridad de regeneración; es decir, siempre regeneran una cabeza en las heridas anteriores y una cola en las posteriores al ser amputadas transversalmente. Entender los mecanismos que subyacen dicho fenómeno ha sido objeto de investigación desde finales del siglo XIX. Asimismo, muchos investigadores se han interesado en comprender como una planaria mantiene las proporciones corporales durante la homeostasis, ya que estos organismos experimentan cambios continuos de tamaño. Con la ayuda del genoma secuenciado de la planaria de agua dulce Schmidtea mediterranea y de varios métodos de análisis genéticos (ARN de interferencia, inmunohistoquímica, etc), en esta tesis doctoral he abordado estas cuestiones desde una perspectiva molecular. En concreto, he caracterizado el papel de la vía Wnt/βcatenina en la regeneración y homeostasis del eje antero-posterior (AP) de la planaria S. mediterranea; puesto que durante el desarrollo embrionario de la mayoría de animales estudiados, así como durante la regeneración de cnidarios, esta vía establece el eje primario del cuerpo. Con el fin de analizar las consecuencias de una perdida de función de la vía Wnt/βcatenina en planarias, durante el primer tramo de la tesis doctoral he caracterizado dos parálogos de la βcatenina (Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2). La βcatenina es una proteína típicamente bifuncional implicada en transducir la señal Wnt al núcleo y en mediar las uniones adherentes a la membrana celular. Sin embargo, el análisis de las secuencias aminoacídicas de Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2, junto con los experimentos de ARNi en planarias y de sobreexpresión heteróloga en embriones de Xenopus, sugieren que los dos parálogos de S. mediterránea se han subfuncionalizado en dos proteínas monofuncionales que retienen solo una de estas dos funciones características. Notablemente, Smed- βcatenina-1, pero no la Smed- βcatenina-2, tiene conservada la función de transducir la señal Wnt y su pérdida de función en planarias resulta en la regeneración de una cabeza en vez de una cola (fenotipo two-headed) y en una anteriorización progresiva durante la homeostasis. En el segundo tramo de la tesis doctoral he analizado las consecuencias de una activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina en planarias. A tal fin, he caracterizado dos parálogos de la Axina (Smed-axinA y Smed-axinB), puesto que este componente de la vía Wnt es un regulador negativo intracelular muy conservado a lo largo de la filogenia animal. Los experimentos de ARNi simple o conjunta sugieren que Smed-axinA y Smed-axinB actúan de manera sinérgica en planarias regulando negativamente la Smed-βcatenina-1. Así, la pérdida de función de ambas axinas resulta en un fenotipo two-tailed y el triple ARNi contra las axinas y Smed-βcatenina-1 resulta en un fenotipo two-headed. De manera interesante, la formación de una cola ectópica en heridas anteriores no inhibe la regeneración inicial del cerebro en la interfase blastema-postblastema; es más, muchos de los heteromorfos two-tailed con el transcurso del tiempo diferencian otro primordio de cerebro justo al lado de la faringe normal. En conjunto, los datos obtenidos en esta tesis demuestran que la vía Wnt/βcatenina es esencial para restablecer y mantener todas las estructuras del eje AP durante el desarrollo post-embrionario de la planaria S. mediterranea. Además, ponen de manifiesto que en un contexto posteriorizado, existen mecanismos que siguen instruyendo la diferenciación de un primordio de cerebro en el tejido preexistente de manera auto-reguladora. Estos resultados han sido publicados en dos revistas de impacto internacional (Iglesias et al., Development 2008; Iglesias et al., Developmental Biology 2011) contribuyendo significativamente al campo de la regeneración y al de la biología del desarrollo en general. / The main objective of my thesis has been to characterize the role of Wnt/βcatenin pathway in anterior-posterior (AP) axis re-establishment and maintenance during planarian regeneration and tissue homeostasis. To address this issue, I characterized two βcatenin homologs in the planarian Schmidtea mediterranea, Smed-βcatenin-1 and Smed-βcatenin-2. Loss of function of Smed-βcatenin-1, but not Smed-βcatenin-2, in both regenerating and intact planarians, generates two-headed planarians that evolve to a radial-like hypercephalized phenotype in which the AP axis disappears but the DV axis remains unaffected. This anteriorized phenotype supports a conserved role for canonical Wnt signalling in AP axis specification, whereas the role of βcatenin in DV axis establishment would be a vertebrate innovation. When considered alongside the protein domains present in each Smed-βcatenin and the results of functional assays in Xenopus embryos demonstrating nuclear accumulation and axis induction with Smed-βcatenin-1, but not Smed-βcatenin-2, these data suggest that Smed-βcatenins could be functionally specialized and that only Smed-βcatenin-1 is involved in Wnt signalling (Iglesias et al. 2008). In a second set of experiments, I showed that 2-tailed planarians formed after loss-of-function of Smed-axinA/B (well known negative regulators of the Wnt/βcatenin signalling) but form a brain anlage at their anterior wound site. This shows that mechanisms underlying early brain regeneration can be uncoupled from the re-establishment of AP identity mediated by Wnt/βcatenin pathway in planarians. Interestingly, these brain primordia do not grow and develop into a well-elaborated brain illustrating a specific role of the Wnt/βcatenin pathway in later brain morphogenesis. The two-tailed phenotype eventually differentiate another brain primordia next to the normal pharynx and forms two opposed body axes composed of tail, pharynx and brain primordium tissues as a remodelling response (Iglesias et al. 2011). Taken together, these data shows that Wnt/βcatenin pathway is essential to re-establish and maintain the AP axis during planarian post-embryonic development.

Títol addicional: Anàlisi de variants en els gens APC i UNC5C associats a càncer colorectal / PREMISSES: Aquesta tesi s'ha centrat en la caracterització de variants missense en 2 gens associats amb càncer colorectal, el gen APC i gen UNC5C. L'al•lel 11307K del gen APC és considerat un al•lel de risc de moderada penetrància que incrementa el risc de desenvolupar adenomes i carcinomes. Però es desconeix si aquest risc està associat a una activació basal de la via Wnt o a un increment de la taxa de mutació lligat a l'existència d'una regió de vuit adenines consecutives. S'han identificat altres mutacions missense en el gen APC que podrien ser responsables de la predisposició a poliposi com ara l'al•lel APC E1317Q considerat de baixa penetrància o polimorfisme i l'al•lel APC 51028R no descrit fins el moment. Disposem de tècniques, no estandarditzades, que permeten estudiar el seu impacte funcional. El CCRf-X és una síndrome hereditària no poliposa amb un patró d'herència autosòmica dominant, de la qual la seva etiologia genètica segueix sent desconeguda. Per altra banda, hem analitzat l'estat mutacional del gen UNC5C en diferents pacients amb càncer colorectal tipus X (CCRf-X). En aquest gen s'hi ha reportat diferents mutacions que poden causar la pèrdua de funció, i per tant estar implicades en la carcinogènesi colorectal en aquest tipus de càncer familiar. OBJECTIUS: Els objectius d'aquesta tesi són: (i) l'avaluació de la contribució de les variants missense en el gen APC 11307K, 51028R i E1317Q al risc de desenvolupar càncer colorectal; (ii) la identificació de mutacions en el gen UNC5C com a causa de predisposició a càncer colorectal. MÈTODES: Els mètodes utilitzats per estudiar les variants del gen APC inclouen assajos funcionals per valorar in vitro de l'activitat transcripcional mitjançada pel complex 13-catenina/TCF-4 així com l'estudi d'expressió dels gen c-myc i Axina2 . També es va estudiar si el canvi d'aminoàcid tenia un efecte directe en la interacció de la proteïna APC amb 13¬catenina. Finalment vam realitzar estudis in vivo amb línies transfectades valorant l'impacte sobre el potencial tumorigènic així com l'espectre mutacional al gen APC dels tumors induïts. Per l'estudi del gen UNC5C s'han analitzat 562 casos de càncer colorectal familiar. Per les variants identificades s'han realitzat estudis de co-segregació, estudi de presència de mutacions en cohorts de controls i pacients així com prediccions in silico del seu impacte funcional. CONCLUSIONS: (1.) La variant APC 11307K activa la via Wnt, sent aquest increment mediat per una disminució de l'afinitat per 13-catenina, pel que pot incrementar el risc de desenvolupar càncer colorectal. No hem trobat evidencia que recolzi la hipermutabilitat associada a la formació d'una regió de 8 adenines consecutives com a rellevant. (2.) La mutació APC 51028R és molt probable que sigui la responsable de la Poliposi Adenomatosa Familiar Atenuada en el pacient on es va identificar la mutació. Els resultats obtinguts per la variant APC E1317Q no són concloents. (3.) Tot i haver identificat 8 mutacions missense en el gen UNC5C no hem pogut aportar evidencia addicional que ens ajudi a confirmar o descartar que el gen UNC5C jugui un paper rellevant al desenvolupament del càncer colorectal hereditari. / PREMISES: The present dissertation addresses the characterization of missense variants of two genes (APC and UNC5C) associated with colorectal cancer (CRC). 11307K APC gene allele is a moderate risk allele that increases the risk of colorectal adenomas and carcinomas. It is unknown whether the risk associates with an increased activation of wnt pathway or creating a hypermutable tract within the gene. Other missense variants may have a role in CRC predisposition. Familial colorectal cancer type X is an autosomic dominant hereditary condition predisposing to non-polyposis. UNC5C gene mutations have been linked to this syndrome. AIMS: (i) To evaluate the contribution of APC gene variants 11307K, 51028R and E1317Q to the risk of developing CRC; (ii) To identify mutations in the UNC5C gene as cause of hereditary CRC. METHODS: Regarding APC mutations in vitro functional assays for 13-catenin/TCF4 mediated transcription, analysis of c-myc and axin genes expression as well as the interaction between APC protein and 13-catenin was assessed. In vivo assessment of tumorigenic potential as well mutational analysis of the APC gene was performed. Regarding the UNC5C gene 544 familial colorectal cancer cases were assessed. For the variants identified co-segregation studies, analysis in cohorts as well as in silico predictions were determined. CONCLUSIONS: 1. 11307K APC variant activates the wnt pathway being this activation mediated by a diminished affinity for 13-catenin. This increase may account for the increased risk for colorectal cancer. No evidence for hypermutability of the (A)8 tract has been found. 2. APC 51028R variant is likely responsible of the attenuated polyposis in the patient identified. Unconclusive results were obtained for the E1317Q APC variant. 3. In spite of having identified 8 missense mutations in the UNC5C gene no additional evidence supporting or ruling out a role for this gene in CRC risk has been obtained.

Development of the posterior spinal cord involves secondary neurulation, a process poorly understood in which neural tube is formed by cavitation of the tail bud. Comprehension of secondary neurulation is required to understand the morphogenetic origin of high prevalence neural tube defects such as spina bifida. In zebrafish embryos neurulation goes through a stage of neural rod; a neural primordium that hollows a lumen in the middle. To form a single continuous lumen, cells converge to the tissue center, divide in stereotyped orientations perpendicular to it (the so-called C-Divisions), and form a tissue midline composed by apical polarity components that will later originate the central lumen. Polarizing events start with the centrosomes positioning in the midline under the control of unknown cues. Sonic Hedgehog has been widely described as a midline signaling protein in other systems, and its components are located in the apical cilium and the underlying basal body, formed by a centrosome. Shh expression onset occurs during gastrulation in embryonic midline structures —notochord and floor plate- and maintained along neurulation, suggesting a role of Shh in neural tube morphogenesis. Treatment with the Shh inhibitor cyclopamine disrupts the lumina! surface, while Shh pathway activation (Shh-GOF) produces partial to total lumen duplication. Shh-LOF/Shh-GOF display defects in neural lumen positioning and/or formation, confirming a role of Shh in lumen formation. Shh-LOF and Shh-GOF preserve their apicobasal polarity and tissue architecture. Analysis of the dynamics of tissue convergence in ShhGOF embryos shows that compared to the same WT stages the neural plate is wider and the neural plate borders stop converging later in development, suggesting delayed cell convergence movements. However comparison between Shh-GOF and WT cell trajectories to the midline reveals no differences in motion. We found that trajectories of cells committing C-Divisions had indistinguishable motion properties compared to their neighbouring cells, and that Shh-GOF cellular motion properties —velocity and persistency- are resistant to Shh activity. We next analyzed the behaviour of dividing cells and observed that mitosis progressively lengthened along neurulation. Detailed analysis of the mitotic phases shows that Shh-GOF cells show shortened mitoses from condensation to anaphase, but spend the same time –or slightly longer- in metaphase. C-Divisions need orient their metaphase plate so they divide perpendicularly to the midline, giving rise to daughter cells that lie at the sides of the prospective lumen. In C-Divisions, metaphase plate rotations are decreased and slower. We next assessed if division orientation was compromised along neural tube formation. Analysis of division orientation shows higher variability in ShhGOF embryos especially at early stages, a fact that would have morphogenetic consequences in the C-Divisions and lumen formation. With similar cell motion properties and similar metaphase duration between WT and ShhGOF mitotic cells, the latter have quicker mitoses, less metaphase rotations and the stereotyped orientation of polarizing C-Divisions is altered, thereby affecting lumen formation. / Los vertebrados amniotas forman el tubo neural posterior por neurulación secundaria, un proceso apenas estudiado en el que el tubo abre un lumen en el centro. Proponemos el pez cebra (Danio rerio) como modelo para entender el origen embrionario de defectos derivados de fallos en la neurulación secundaria, como es la espina bífida. Durante la neurulación del pez cebra los progenitores neurales compaginan proliferación y convergencia hacia el centro del tejido. Tras la formación de un primordio neural condensado,las células orientan su eje de división perpendicular al eje central (C-Divisions), originando una linea media de polaridad apical que formará el lumen. La polarización empieza con la localización medial del centrosoma, que en interfase constituye la base del cilio. Los componentes de la vía Sonic Hedgehog (Shh) se hallan en el cilio, empezando shh a expresarse en estructuras mediales de la gástrula y néurula -futuras notocorda y placa del suelo-. La inhibición de Shh perturba la continuidad del lumen, y la activación de Shh (Shh-GOF)produce fenotipos de duplicación luminal, sugiriendo que Shh regula la localización/formación del lumen. La polaridad apicobasal de las células permanece intacta, pero el primordio neural es más ancho durante la neurulación. Sin embargo la motilidad de los núcleos y los cilios hacia la línea media es resistente a la actividad de Shh. La duración de las mitosis incrementa a lo largo de la neurulación, y las células Shh-GOF presentan mitosis más rápidas, sin acortamiento de la metafase. Lo mismo sucede en las C-Divisions, en las que la metafase presenta menor rotación y mayor variabilidad en el plano final de división, originando líneas medias ectópicas y duplicación del lumen. Los cambios en los niveles de activación de Shh conllevan consecuencias en la morfogénesis del lumen a través de la regulación de las divisiones durante la formación del tubo neural.

Lysosomal storage disorders (LSDs) are a group of more than 50 different genetic disorders due to the lack of degradation of substrates within lysosomes. Most of them are caused by mutations in genes coding for lysosomal hydrolases. LSDs are mainly inherited in an autosomal recessive manner. Although in the last 25 years there has been much effort and progress to develop therapies aiming the correction of metabolic defects for these diseases, yet there is no effective therapy for many of them, and patients are exclusively treated with supportive care. For several non-neurological LSDs, enzyme replacement therapy may be an option. However, this approach is not efficient, at the moment, for neurological patients. Thus, new therapeutic approaches need to be developed. One of these approaches is the use of drugs that are able to produce a read-through of premature stop codons. One advantage of this strategy is that, if successful, it can be applied to any disease, provided that the molecular cause is a nonsense mutation. The most extensively studied approach involves read-through by drugs affecting the ribosome-decoding site. Niemann-Pick A/B (NPA/B) and Niemann-Pick C (NPC) are two rare inherited monogenic diseases. Although initially were defined as types of the same disease, subsequently they have been considered independent diseases due to the fact that they have different biochemical and molecular features. NPA/B disease is caused by mutations in the SMPD1 gene, localized in chromosome 11, which codes for the enzyme acid sphingomyelinase, a soluble lysosome hydrolase. NPC disease is caused by mutations in the NPC1 gene, localized in chromosome 18, which codes for a lysosomal membrane protein, involved in cholesterol transport. NPC disease also may be caused by mutations in the NPC2 gene, localized in chromosome 14, which codes for a lysosomal soluble protein, involved in cholesterol transport too. The abnormal action of these proteins in patients promotes the accumulation of lipids, which differ in each disease, inside the lysosomes, causing their dysfunction. This thesis makes contributions to the field of LSDs study. Various aspects have been addressed: therapeutic approaches have been tested as a first step in the achievement of a successful therapy for those LSDs bearing nonsense mutations. Important steps in the generation of a new cellular model for NPA/B have been achieved. This model would be helpful to understand the molecular processes that contribute to the development of this pathology and would be a valuable tool for the search of successful treatments. Finally, two new mouse models for NPC have been generated and characterized while one dies few days after birth, the other mimics the main characteristics of the disease and will be useful to probe specific treatments. / Las enfermedades de acúmulo lisosómico (LSDs) son un grupo de más de 50 trastornos genéticos diferentes, debido a la falta de degradación de sustratos dentro de los lisosomas. La mayoría de ellas están causadas por mutaciones en los genes que codifican para las hidrolasas lisosomales. Las LSDs se heredan principalmente de forma autosómica recesiva. Aunque en los últimos 25 años ha habido un gran esfuerzo y progreso para desarrollar terapias dirigidas a la corrección de los defectos metabólicos de estas enfermedades, sin embargo, no hay un tratamiento eficaz para muchas de ellas, y los pacientes son tratados exclusivamente con terapias de soporte. Para muchas LSDs sin afectación neurológica, la terapia de reemplazo enzimático puede ser una opción. Sin embargo, este enfoque no es eficiente por el momento para los pacientes con afectación neurológica. Por lo tanto, nuevos aproximaciones terapéuticas han de ser desarrolladas. Una de estas aproximaciones es el uso de fármacos que son capaces de proseguir la lectura a través de los codones de parada prematuros. La ventaja de esta estrategia es que, si tiene éxito, se puede aplicar a cualquier enfermedad cuya causa molecular sea una mutación sin sentido. Niemann-Pick A/B (NPA/B) y Niemann-Pick C (NPC) son dos enfermedades raras, monogénicas y hereditarias. Aunque inicialmente se definieron como tipos de la misma enfermedad, posteriormente se han considerado enfermedades independientes debido al hecho de que tienen diferentes características bioquímicas y moleculares. La enfermedad de NPA/B está causada por mutaciones en el gen SMPD1, localizado en el cromosoma 11, que codifica para la enzima esfingomielinasa ácida, una hidrolasa soluble lisosomal. La enfermedad de NPC está causada por mutaciones en el gen NPC1, localizado en el cromosoma 18, que codifica para una proteína de membrana lisosomal, dicha proteína participa en el transporte del colesterol. La enfermedad de NPC también puede estar causada por mutaciones en el gen NPC2, localizado en el cromosoma 14, que codifica para una proteína soluble lisosomal, que también participa en el transporte del colesterol. La acción anormal de estas proteínas en los pacientes promueve la acumulación de lípidos, diferentes en cada enfermedad, el interior de los lisosomas, provocando su disfunción. Esta tesis realiza contribuciones en el campo de estudio de las LSDs. Se han abordado diversos aspectos. Varias aproximaciones terapéuticas han sido probadas como un primer paso en el logro de una terapia satisfactoria para aquellas LSDs causadas por mutaciones sin sentido. Se han alcanzado importantes avances en la generación de un nuevo modelo celular para NPA/B. Este modelo podría ser útil para entender los procesos moleculares que contribuyen al desarrollo de dicha patología y podría ser una valiosa herramienta para la búsqueda de tratamientos. Por último, se han generado dos nuevos modelos de ratón de NPC y se han caracterizado. Uno de ellos muere pocos días después de su nacimiento, el otro imita las principales características de la enfermedad y podría ser útil para la investigación de tratamientos específicos.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / To direct post-transcriptionally gene silencing, RNAi machinery exploits the formation of base pairs between the loaded guide strand and the complementary mRNA. The Ago2 protein is the “slicer” effector of the RISC and drives the endonucleolytic cleavage only when the siRNA guide strand is full paired with its RNA counterpart. Ago2 is able to incorporate a duplex siRNA molecule, unwinds the double helix and holds one strand while discarding the other. Ago2 bearing only the guide strand is defined “active” and can guide multiple cleavage reactions against the complementary mRNAs. Structural insights into Ago2 assembly process have speculated that early interactions between the siRNA and the Ago2 relies on specific recognition by the PAZ domain. Thus, proper PAZ domain recognition contributes to the specific and productive incorporation of siRNAs into the Ago2. Interactions between PAZ domain and siRNA molecule are essentially asymmetric. The guide strand with its 2-nt 3’overhang is involved in the majority of the contacts between the PAZ pocket and the siRNA, whereas the passenger strand interacts only with its 5’ end residue. In principle, overhang modifications (i.e. 2’-deoxy units) were just introduced to protect the RNA duplex integrity. Only after the understanding of the Ago2 architecture, overhang modifications were also harnessed to improve the siRNA potency and specificity. The comprehension of the PAZ lodging/dislodging motion during the formation of binary (Ago2 + guide) and ternary complex (Ago2 + guide + mRNA) pointed out the importance of adequate affinity between the guide overhang and the PAZ cleft during the Ago2 multi-turnover cleavage process. Affinity analysis on PAZ/siRNA overhang complex has proved the influence of the overhang presence for efficient binding. SiRNA duplexes with shorter overhang (1-nt) or blunt end have respectively highlighted 85-fold and >5000-fold reduced affinity. Hence, taking advantage of more efficient interactions between the PAZ pocket and the strand bearing the unpaired di-nucleotides structure, structural asymmetric siRNA molecules bearing only the antisense overhang were successful employed to bias the RISC strand selection. Moreover, competition between siRNAs, resulting in preferential incorporation of one siRNA type into the RISC machinery, is influenced by the distinct loading kinetics of siRNA molecules. Thus, the knockdown ability of siRNA mixtures is often compromised due to competition between siRNAs. It also has been reported that the simultaneous transfection of two or more siRNAs causes reduced silencing activity of one siRNA species whereas the potency of the other siRNAs were not affected. Even if siRNA competition effects are essentially produced by the interactions with the Ago2 protein, up to now, no available data about a specific Ago2 domain involvement into the siRNA competition have been described. We have been hypothesized that the PAZ domain, playing an important role in the first steps of the strand loading could be specifically involved in the siRNA competition. Given this background we are questioning how the di-nucleotide unpaired structure can influence the siRNA silencing efficiency and specificity. To explore the structural hallmarks critical for the PAZ pocket interaction, we modified the siRNA overhangs with several modifications. In detail, 2 units of β-L-nucleosides (mirror image L-Thymidine), 2’-deoxyribitol, GNA (glycerol nucleic acids)-Thymine and acyclic L-threoninol were introduced at overhang level and the silencing potency (IC50) was measured. Such modifications may provide fundamental clues on structural prerequisite needed for the PAZ recognition and strand loading into the Ago2. / Para dirigir el silenciamiento génico post-transcripcional, la maquinaria de RNAi explota la formación de pares de bases entre la hebra guía cargado y el ARNm complementario. La proteína Ago2 (Argonauta 2) es la "máquina de cortar" del complejo RISC y dirige la rotura endonucleolítica sólo cuando la hebra guía del siRNA está completamente apareada con su homóloga de ARN. Ago2 es capaz de incorporar una molécula de dúplex de siRNA, desenrolla la doble hélice y mantiene una hebra mientras se descarta la otra cadena. Ago2 cargada con la hebra guía se define "activa" y puede guiar múltiples reacciones de escisión contra los ARNm complementarios. El análisis estructural del proceso de ensamblaje de Ago2 ha llevado a la conclusión de que las primeras interacciones entre el siRNA y la proteina Ago2 se basa en el reconocimiento específico por el dominio PAZ. Por lo tanto, el correcto reconocimiento de dominio PAZ contribuye a la incorporación específica y productiva de los siRNAs en el Ago2. La hebra guía con su extremo 3' protuberante que tiene 2-nt está implicada en la mayoría de los contactos entre la cavidad presente en el dominio PAZ. En principio, las modificaciones en los extremos protuberantes se introdujeron para proteger la integridad del dúplex de ARN. Sólo después de la comprensión de la arquitectura de Ago2, se pensó en la utilización de las modificaciones en los extremos protuberantes para mejorar la potencia y especificidad de los siRNAs. Para explorar las características estructurales críticas para la interacción entre la cavidad PAZ, modificamos los extremos protuberantes de los siRNA con varias modificaciones. Específicamente, 2 unidades de un beta-L-nucleósido como la L-timidina (imagen especular de la timidina), de 2'-desoxiribitol, de GNA (glycerol nucleic acids)- timina y del derivado acíclico L-treoninol se introdujeron a los extremos protuberantes y se midió la potencia de silenciamiento (IC50). Tales modificaciones pueden proporcionar pistas fundamentales sobre el requisito estructural necesario para el reconocimiento y carga de la cadena del dominio PAZ de Ago2.

To understand the origin of opisthokonts or infer evolutionary transitions within the group that contains two multicellular lineages (animals and fungi), it is first fundamental to understand the phylogenetic relationships between extant living species. Phylogeny and particularly phylogenomics (such the supermatrix approach) is the only valid procedure to infer evolutionary relationships between species, as morphological or molecular synapomorphies or rare genomic changes are cyclic arguments and really taxon dependent. This is why we have used genomic and transcriptomic data to build a novel dataset of Single Copy Protein Domains and test phylogenetic hypotheses with multiple methods to discard problems of systematic error. We have confirmed the division between Holomycota (Nucleariids, Opisthosporidia, chytrid fungi and fungi) and Holozoa (Ichthyosporea, Filasterea, Choanomonada and Metazoa). We also have generated RNAseq data to place a specially elusive species: Corallochytrium limacisporum and found it placed as sister group to Ichthyosporea, another osmotrophic holozoan group. With this solid phylogenetic background we can start to speculate on evolutionary transitions between groups, but not before reconstructing ancestral character states in different opisthokont lineages and also the extant living outgroups: Apusomonadida and Breviatea. So we conclude that there is no clear link between biflagellated free-living gliding bacterivores (outgroup) and any opisthokont lineage (ingroup). The Last Opisthokont Common Ancestor was probably uniflagellated but retained all other ancestral characters such amoeboid movement, filopodia, phagotrophy, etc. but had a less constrained cell shape or feeding mode. Then, we studied the similarities found between non-related groups of opisthokonts, such the walled osmotrophs or the naked filose amoebae through comparative genomics. For example, we found that Ministeria vibrans (Filasterea) and C. limacisporum (Ichthyosporea) have a flagellar apparatus previously unnoticed, and with a molecular pattern of flagellum reduction also seen in fungi and other eukaryotes. Also, Ichthyosporea probably use a chitin-like substance to build their cell wall (similar to fungi) but with an independently diversified pathway. / Per entendre l’origen dels Opistoconts (grup taxonòmic que conté animals, fongs i diversos llinatges protists emparentats) o inferir les seves transicions evolutives, és fonamental primer entendre les relacions filogenètiques entre les espècies existents en l’actualitat. La filogènia, particularment la filogenòmica, és el procediment vàlid per inferir relacions evolutives entre espècies, ja que la morfologia, les sinapomorfies moleculars o els canvis genètics singulars són arguments cíclics dependents del mostreig taxonòmic. Per aquesta raó hem fet servir dades genòmiques i transcriptòmiques per a construir un nou conjunt de dades format per dominis proteics de còpia única i els hem analitzat mitjançat diversos mètodes per prevenir errors sistemàtics. Hem pogut així confirmar la divisió entre Holomycota (Nucleariids, Opisthosporidia, quitridiomiciets i fongs) i Holozoa (Ichthyosporea, Filasterea, Choanomonada i Metazoa). També hem obtingut dades de RNAseq per situar espècies particularment ambigües com: Corallochytrium limacisporum la qual hem situat com a grup germà de Ichthyosporea, un altre grup holozou osmotròfic. Partint d’aquesta base filogenètica es pot començar a especular sobre les transicions evolutives entre els grups. No obstant, abans cal reconstruir els ancestres dels llinatges dels Opistoconts com també dels seus grups externs actuals: Apusomonadida i Breviatea. Els resultats indiquen que no existeix cap lligam definit entre els bacterívors ancestrals biflagelats (grup extern) i cap dels llinatges Opistoconts (grup d’interès). També que el darrer avantpassat comú dels Opistoconts probablement conservaria quasi tots els caràcters ancestrals com el moviment ameboide, filopodis, la fagotrofia, etc.; però seria uniflagel·lat, amb una forma cel·lular menys restringida pel tipus d’alimentació. Mitjançant la genòmica comparada hem estudiat les similituds entre grups no emparentats d’Opistoconts com els osmòtrofs amb paret cel·lular o les amebes filopodials nues. Per exemple, hem trobat que Ministeria vibrans (Filasterea) i C. limacisporum (Ichthyosporea) presenten un aparell flagel·lar fins ara desconegut amb un patró similar al que formen fongs i altres eucariotes. També que Ichthyosporea fa servir un material semblant a la quitina per construir la seva paret cel·lular. Aquestes similituds plantegen hipòtesis de convergència evolutiva o paral·lelisme entre llinatges propers que s’hauran de comprovar en un futur.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / The final size of a developing organ has to be finely modulated in order to give rise to fully functional organs and organisms. Final size is regulated by the nutritional status of the feeding animal through the activity of nutrient sensing pathways, such as Insulin and TOR signaling pathways. In addition, intrinsic signals operate in an autonomous way to control growth and also shape of an organ. How cells integrate distinct inputs (extrinsic and intrinsic signals) to generate organs of appropriate size and shape remains largely unknown. The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-phosphatase with tensin homology (PTEN) and tuberous sclerosis complex (TSC)-target of rapamycin (TOR) pathways are frequently activated in human cancer, and this activation is often causative of tumorigenesis. One interesting and yet poorly understood issue is how cells depleted of tumor suppressor genes outcompete neighboring wild type cells, especially during early stages of tumorigenesis after initial mutagenesis and transformation. We utilized the Ga14-UAS system in Drosophila imaginal primordia, highly proliferative and growing tissues, to analyze the impact of restricted activation of these pathways on neighboring wild type cell populations. The results presented in this thesis show that activation of these pathways leads to an expected autonomous induction of tissue overgrowth and to a remarkable non-autonomous reduction in growth and proliferation rates of adjacent cell populations. We show that this non-autonomous response occurs independently of where these pathways are activated, is functional all throughout development, takes place across compartments, is independent of apoptosis and, as such, distinct from cell competition, and is not influenced by the nutritional status of the animal. We present evidence that the observed autonomous and non-autonomous effects on tissue growth rely on the upregulation of the proteoglycan Dally, a major element involved in modulating the spreading, stability, and activity of the growth promoting Decapentaplegic (Dpp)/transforming growth factor 13 (TGF-13) signaling molecule. This conclusion is based on the experimental evidence that activation of the PI3K/PTEN and TSC/TOR pathways induce a cell autonomous increase in Dally expression levels, that Dally overexpression phenocopies the autonomous effects on tissue size and, most interestingly, that the non-autonomous effects on tissue size, growth and proliferation rates, and on Dpp availability and signaling are fully rescued by Dally depletion. We propose that the non-autonomous reduction in tissue size is a consequence of reduced Dpp signaling, most probably reflecting increased number of Dpp molecules bound to the overgrowing (Dally overexpressing) tissue and a consequent reduction in the number of available Dpp molecules in the neighboring cell population. In this way, a reduction in the amount of available Dpp growth factor contributes to the out-competition of wild type cells by overgrowing cell populations. This is further supported by the fact that increased levels of the Dpp receptor Tkv, which withdraws the Dpp ligand from the extracellular space, also causes a non-autonomous reduction in tissue size. Whereas nutrient-sensing pathways modulate the final size of the adult structure according to nutrient availability to the feeding animal, Dpp plays an organ-intrinsic role in the coordination of growth and patterning. Our results also unravel a role of Dally as a molecular bridge between the organ-intrinsic and organ-extrinsic mechanisms that regulate organ size. As such, it contributes to integrate nutrient sensing and organ scaling, the fitting of pattern to size. / Para obtener organismos estructuralmente funcionales, el tamaño de sus órganos tiene que estar altamente regulado durante el desarrollo. Por un lado, dicho tamaño final depende del estado nutricional del organismo y de la actividad de vías de señalización que responden a la disponibilidad de nutrientes. Por otro lado, existen señales intrínsecas en estos órganos que operan de forma autónoma para controlar su crecimiento y su forma. Cómo integran las células y los tejidos estas señales extrínsecas e intrínsecas para generar órganos del tamaño y forma apropiados sigue siendo, en gran parte, una incógnita. Las vías de señalización PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase)/PTEN (Phosphatase with Tensin Homology) y TSC (Tuberous Sclerosis Complex)/TOR (Target of Rapamycin) que responden a la disponibilidad de nutrientes están involucradas en el control del crecimiento. Además, se encuentran hiper-activadas con frecuencia en diferentes cánceres humanos, y su activación es muchas veces la causa inicial del desarrollo de los tumores. Una pregunta interesante, y todavía poco explorada, es entender cómo células mutantes para genes supresores de tumores compiten con las células adyacentes salvajes hasta llegar a eliminarlas completamente. Para analizar el impacto de la activación restringida a determinadas regiones de estas vías de señalización sobre poblaciones celulares adyacentes de tipo salvaje, hemos utilizado como sistema modelo los primordios imaginales de Drosophila, tejidos epiteliales altamente proliferativos y en continuo crecimiento durante el desarrollo larvario. La activación restringida a determinadas regiones de estas vías genera, como esperábamos, un sobre-crecimiento del tejido afectado y, sorprendentemente, una clara reducción del crecimiento y la proliferación de las poblaciones celulares adyacentes no afectadas. Demostramos que los efectos observados, tanto autónomos como no autónomos, están mediados por Dally, un proteoglicano implicado en la regulación de la difusión, la estabilidad y la actividad del factor de crecimiento Dpp (Decapentaplegic). Proponemos que ese incremento en los niveles de Dally conlleva un mayor secuestro de moléculas de Dpp y, como consecuencia, una reducción del número de moléculas de Dpp disponibles para las poblaciones celulares adyacentes. Asimismo, sugerimos que ambas poblaciones celulares compiten por la cantidad de moléculas de Dpp, y que la reducción de estas promueve la eliminación de las células salvajes por parte de la población celular que está sobrecreciendo. Mientras que las vías de señalización que detectan los nutrientes modulan el tamaño final de las estructuras adultas de un organismo en función al estado nutricional, Dpp juega un papel intrínseco a nivel del órgano en la coordinación de crecimiento con la generación de patrón. Por lo tanto, nuestros resultados revelan una función de Dally como un puente molecular entre los mecanismos intrínsecos y extrínsecos que regulan el tamaño final de los órganos. Como tal, contribuye a integrar la disponibilidad de nutrientes con el “scaling” de los órganos.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) i a l'Institut Català d'Oncologia (ICO) / BACKGROUND: MMR deficiency is a hallmark of tumors from Lynch syndrome LS) patients, who harbor germline mutations in MMR genes. No germline alterations are detected in a significant proportion of suspected LS now known as Lynch-like syndrome (LLS) cases. HYPOTHESIS: In LS-suspected patients there may be other responsible causes for the MMR-deficiency in tumors, such as unidentified germline mutations or epimutations in MMR genes, or mutations in other CRC-associated genes (germline or somatic). AIMS: To elucidate the molecular basis of MMR deficiency in LS-suspected cases without identified germline MMR mutation. SPECIFIC AIMS: To refine and complete the analysis of MMR gene including the promoter regions. To study the contribution of MUTYH mutations to LLS. To study the relative contribution of germline and somatic mutations in other CRC-associated genes. PATIENTS AND METHODS: We have analyzed a series of 260 LS-suspected patients, thirty-four harboring MLH1-methylated tumors and 226 classified as LLS (BRAF negative, MLH1 methylation negative and MMR wildtype). Promoter sequencing of MMR genes was performed by Sanger. Methylation analyses were analyzed by multiple techniques including MS-MLPA, MS-Melting Curve Analysis (MCA), bisulfite sequencing or pyrosequencing. Pathogenicity assessment of MSH2 VUS was performed by multifactorial models and cDNA analysis. MUTYH Spanish variants were analyzed by Sanger or MCA and other CRC-associated genes by a customized subexome panel. MAIN RESULTS AND CONCLUSIONS: In LLS somatic methylation in MSH2 and MSH6-deficient tumors is absent and does not of help in ruling out LS. MLH1 constitutional epimutations account for about 2% of suspected LS cases. Pathogenicity assessment of MSH2 variants allows the reclassification of the majority of them (90%). Germline biallelic MUTYH mutations are responsible for up to 3% of LLS. FAN1 probable pathogenic variants may account for 10% of LLS. The combined germline and somatic assessment of the mutational status of CRC-associated genes by means of a subexome panel is useful to elucidate the molecular basis of a relevant number of LLS. / ANTECEDENTES: La deficiencia de reparación de bases desapareadas es una característica de los tumores de pacientes con síndrome de Lynch (SL) con mutaciones germinales en genes reparadores (MMR). En una proporción significativa de pacientes con sospecha de SL no se detecta mutación germinal en MMR, ellos se conocen como pacientes con síndrome “Lynch-like” (LLS). HIPÓTESIS: En pacientes con sospecha de SL podría haber otra causa responsable de la deficiencia reparadora, como (epi)mutaciones germinales en genes MMR o en otros asociados a cáncer colorectal (CCR). OBJETIVO: Elucidar la base molecular de la deficiencia MMR en pacientes con sospecha de SL sin mutación germinal identificada en genes MMR. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Refinar el análisis de genes MMR incluyendo regiones promotoras. Estudiar la contribución de mutaciones en MUTYH a LLS. Estudiar la contribución relativa de mutaciones germinales y somáticas en otros genes asociados a CCR. PACIENTES Y MÉTODOS: Hemos analizado una serie de 260 pacientes con sospecha de SL, 34 tenían tumores MLH1 metilados y 226 eran LLS (BRAF wildtype, sin metilación en MLH1 y MMR wildtype). La secuenciación del promotor en genes MMR se hizo por Sanger. Los análisis de metilación por múltiples técnicas incluyendo análisis de curvas de disociación (MCA) específica de metilación, MLPA específico de metilación, secuenciación con bisulfito o pirosecuenciación. Las VSDs en MSH2 se estudiaron por análisis multifactoriales y de cDNA. Las variantes patogénicas Españolas de MUTYH se analizaron por Sanger o MCA y otros genes asociados a CCR se estudiaron por secuenciación masiva con un panel del subexoma. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: En LLS el estudio de metilación somática en tumores MSH2- y/o MSH6- no ayuda a descartar pacientes con SL. Epimutaciones constitucionales en MLH1 representan alrededor del 2% del SL. La evaluación de la patogenicidad de las VUS en MSH2 permitió su re-clasificación en la mayoría (90%). Mutaciones bialélicas germinales en MUTYH son responsables de ~3% de LLS. Mutaciones en FAN1 podrían ser responsables de un 10% del LLS. La combinación del análisis germinal y somático de mutaciones asociadas a CCR por medio de paneles de subexomas es útil para elucidar la base molecular del LLS.

Epithelial layers constitute the skeleton of early embryos and most tissues and organs and their remodelling during development is essential for reshaping the embryo and for tissue architecture. Epithelial expansion in particular, has fundamental roles during early embryogenesis in both vertebrates and invertebrates. Some well-established invertebrate models have contributed greatly to our knowledge of this process. However, we are still far from having a global understanding of the cellular, molecular and mechanical changes involved in this process, the diversity, and relationship between them. With this in mind, we decided to explore a less well known model for epithelial expansion, epiboly in the vertebrate zebrafish. Epiboly is the expansion of the blastoderm around a big yolk cell to finally engulf it. Three different layers are involved in this process, an epithelial layer, a mesenquimal layer and a big yolk cell. Although teleost epiboly has been studied for many years a clear understanding of the process was still missing. We analysed the cellular, molecular and mechanical elements involved in this process and found that epithelial expansion is in this process a passive event driven by the pulling of the adjacent layer, the yolk syncytium. The increase in area of this epithelia is achieved by cell shape changes (flattening) and the RhoGTPase Rac1 activity seems to be necessary for these passive changes in shape. The contraction in the yolk syncytium is accompanied by the formation of membrane folds and endocytic vesicles in this area and the different mechanical properties of the elements at both sides of these contractile domains are, together with endocytosis, essential to understand the expansion. In relation to this, we found that Rab5ab activity in the yolk is essential for the expansion and for doming of the internal part of the yolk. In addition, we showed that the main constituent of the embryo at this stage, the yolk granules, behave as an hydrodynamic fluid at low Reynolds number that passively flow during epiboly by the activity at the surface. We learned that the spherical geometry of the embryo together with volume conservation and the transmission of forces between the different elements involved in the process are essential to understand the changes observed in the blastoderm during this process and its global coordination. We generated a non-intrusivemethodology to extract the mechanical changes involved in a given morphogenetic event from microscopy data based on the relation between the active elements (elastic, visco-elastic) and the passive ones (fluids). We applied this method to the process of epiboly and validated the results obtained by atomic force microscopy (AFM) indentation and laser microsurgery experiments. Finally, we generated an enhancer trap screen using the Gal4/UAS binary system with the aim of being able to spatially restrict gene expression during epiboly. However, and although we found several interesting lines that drove specific gene expression, we could not find any with sufficient early expression to be useful for our epiboly studies. Overall, we learnt that an isotropic actomyosin contraction generates an anisotropic stress pattern and movement by the properties of the surrounding elements. To get a precise understanding of epiboly we had to consider the transmission of forces between the different layer and volume conservation. For that, it was important to take into account both the contribution from the active elements (cortex) and from the passive ones (fluid). The role that unselective membrane removal has in morphogenesis has been barely explored. We anticipate that membrane tension and removal and its relationship to actomyosin contraction and shape changes will become an emerging and exciting field and that zebrafish epiboly will become a great model to study these relationships / La expansión de epitelios es esencial durante la embriogénesis de muchos organismos tanto invertebrados como vertebrados y también juega un papel importante en el organismo adulto como, por ejemplo, durante el proceso de cicatrización de heridas. Para ampliar nuestros conocimiento sobre los mecanismo celulares, moleculares y mecánicos responsables de este cambio morfogenético estudiamos la epibolia del vertebrado pez cebra. La epibolia de pez cebra consiste en la expansión del blastodermo alrededor del vitelo para finalmente embolverlo. Elaboramos un análisis descriptivo, funcional y mecánico del procesos que nos llevó a concluir que la expansión de este epitelio (EVL) es pasiva y generada por la contracción y la endocitosis del córtex de la capa adyacente, el sincitio del vitelo. La actividad de la RhoGTPasa Rac en el epitelio parece importante para este cambio de forma celular pasivo, mientras que la endocitosis mediada por la RhoGTPasa Rab5ab en el sincitio adyacente es esencial para la expansión del epitelio. Encontramos que la contracción isotrópica del córtex del sincitio genera un movimiento unidireccional por las diferentes propiedades mecánicas de las dos estructuras adyacentes. Por otro lado, descubrimos que los gránulos del vitelo, el mayor componente del huevo en este estadio, se comportan como un fluido viscoso incompresible que se mueven pasivamente durante el proceso de expansión por la actividad generada en la superficie. Además, el movimiento de estos gránulos durante el proceso puede explicar el cambio de forma del blastodermo durante el proceso. Finalmente, generamos un método para extraer los cambios mecánicos durante la epibolia a partir de imágenes de microscopia, basado en la relación entre la actividad elástica del córtex y el movimiento del fluido. Los resultados obtenidos con este método fueron validados por microscopía de fuerza atómica y microcirugía del córtex. En resumen, hemos obtenido un conocimiento global de la epibolia y aprendido que para explicar este proceso es necesario considerar las diferentes propiedades mecánicas de los diferentes elementos involucrados y la transmisión de fuerzas entre estos teniendo en cuenta la conservación del volumen y la forma esférica del embrión. Creemos que estos conceptos resultarán aplicables a otros procesos morfogenéticos.

Durant el desenvolupament d’aquesta tesi doctoral hem identificat i caracteritzat la variant d’histona H1 present a la línia germinal i l’embrió primerenc de Drosophila melanogaster. Els metazous contenen múltiples variants d’histona H1. Particularment, la majoria d’espècies estudiades contenen diverses variants d’histona H1 que reemplacen les H1 somàtiques a la línia germinal i als primers estadis del desenvolupament embrionari. Drosophila era l’excepció ja que, fins ara tan sols es coneixia una única histona H1, que s’expressa des de la cel·lularització de l’embrió i que perdura durant tot el cicle biològic de la mosca. En aquest treball hem identificat la histona H1 embrionària i de la línia germinal de D.melanogaster, dBigH1. dBigH1 és molt abundant durant els primers estadis embrionaris, abans de la cel·lularització de l’embrió, quan la histona H1 somàtica (dH1) és absent i el genoma zigòtic es troba silenciat. Durant la cel·lularització, quan el genoma del zigot s’activa progressivament, dH1 reemplaça dBigH1 a les cèl·lules somàtiques. Tot i això, dBigH1 es reté a les primordial germ cells (PGCs) com a mínim fins l’estadi 12. Aquestes cèl·lules donaran lloc a la línia germinal del futur organisme. En aquest treball vam generar una mutació de falta de funció de dBigH1 a la qual vam anomenar dbigH1100. Els embrions mutants dbigH1100 presenten una activació prematura del genoma zigòtic, tan a les cèl·lules somàtiques com a les PGCs. Els embrions mutants dbigH1100 moren abans de la cel·lularització i presenten un augment dels nivells de RNA Polimerasa II elongant i un augment de trànscrits zigòtics. A més a més, la letalitat va acompanyada de dany al DNA i defectes mitòtics. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 té una funció essencial en la regulació de l’activació del genoma zigòtic durant la cel·lularització. De la mateixa forma que altres metazous, dBigH1 també es troba present a la línia germinal femenina. Tot i això, a diferència d’altres espècies estudiades, on existeixen variants d’H1 específiques de mascle, dBigH1 també es troba present a la línia germinal masculina. Tan a les gònades masculines com a les femenines, dBigH1 està expressada a les cèl·lules mare germinals (GSC), que es troben adherides a un nínxol que ajuda al seu manteniment com a cèl·lules mare. A les gònades masculines dBigH1 no està present a la regió proliferativa, on hi ha els grups d’espermatogònies, i torna a expressar-se als espermatòcits. A les gònades femenines, dBigH1 té un patró de localització similar ja que es troba absent a les oogònies proliferants, però torna a expressar-se a les cambres ovàriques. En una condició de falta de funció de dBigH1 es produeixen defectes en la gametogènesi masculina i es detecta una acumulació d’espermatogònies. En aquestes gònades es produeix un augment dels nivells de Bam, un factor de diferenciació clau en aquest procés. En una situació control, els nivells de Bam augmenten durant la fase proliferativa, però aquest gen es torna a mantenir silenciat per tal que les espermatogònies deixin de proliferar i es diferenciïn a espermatòcits. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 té una contribució en la regulació de l’expressió de bam durant la diferenciació de les espermatogònies. A més a més, també hem mostrat que la distribució de dBigH1 al llarg de la cromatina dels espermatòcits correlaciona negativament amb l’expressió gènica. Així doncs, els gens que es troben silenciats tenen un contingut alt en dBigH1, mentre que els gens més expressats tenen un contingut menor en la proteïna. De fet, en una situació de falta de funció de dBigH1 als espermatòcits, es produeix un augment de l’expressió d’aquells gens que, en una situació control, es troben silenciats. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 també té una contribució en la regulació de l’expressió gènica durant la gametogènesi masculina. / During the development of this thesis we have descrived the germline and embryonic histone H1 variant of Drosophila melanogaster. Metazoans usually contain multiple histone H1 variants. In particular, specific variants replace somatic histone H1s in the germline and early embryogenesis. In this regard, Drosophila was an exception because a single dH1 was known. During this work, we identified the embryonic histone H1 of Drosophila, dBigH1. dBigH1 is abundant during early embryogenesis before cellularization occurs, when the somatic H1 is absent and the zygotic genome is inactive. Upon cellularization, when the zygotic genome si progressively activated, dH1 replaces dBigH1 in the soma, but not in the primordial germ cells (PGCs). dBigH1 loss-of-function mutant embryos show premature zygotic genome activation, both in the soma and the PGCs. Mutant embryos die at cellularization, showing increased levels of active RNApol II and zygotic transcripts, along with DNA damage and mitotic defects. These results show an essential function of dBigH1 in zygotic genome activation regulation. Like in other metazoans, dBigH1 is present in the female germline. However, it is also present in the male germline, while other metazoans contain diferent male-specific H1s. In the gonads, dBigH1 is expressed in the germ stem cells attached to the stem cell niche, both in males and females. In male gonads it is also present in the spermatocytes and, in the female gonads, it is also present in the egg chambers. dBigH1 knock-down testis have problems in the regulation of spermatogenesis, which results in spermatogonia accumulation and a decrease in male fertility. This is due to an upregulation of bam, a key regulator of this process. These results show a dBigH1 contribution in the regulation of bam expression during gametogenesis. Moreover, we also show that dBigH1 distribution across spermatocytes chromatin negativelly correlates with gene expression. dBigH1 is accumulated in genes which must remain silenced, whereas genes highly expressed in these cells contain less dBigH1 content. In this regard, a dBigH1 knock-down condition show an upregulation of these silenced genes. These results show that dBigH1 also contributes to transcriptional regulation in the germline.