Fa aproximadament uns 20 anys del descobriment de la poli(ADP-ribosa), únic homopolímer que s'uneix de manera covalent a les proteïnes cromosòmiques. Des d'aleshores s'han fet detallats estudis de l'estructura, metabolisme, enzimologia, com també de les funcions fisiològiques relacionades amb el polímer. Nombroses evidències suggereixen que la poli(ADP-ribosa) es troba àmpliament distribuïda als eucariotes i està involucrada en la regulació de la proliferació cel·lular, síntesi de proteïnes i metabolisme dels àcids nucleics.Així mateix, també hi ha força dades que indiquen que la mono(ADP-ribosilació) és una manera comuna de modificar covalentment les proteïnes i la seva funció. L'ADP-ribosilació es l'única reacció bioquímica en la qual el NAD, un coenzim respiratori, és utilitzat com a donador de grups ADP-ribosil.La importància dels nucleòtids de piridina NAD i NADP com a coenzims de les reaccions d'oxidació-reducció cel·lulars pot observar-se fàcilment en considerar la utilització d'aquests compostos per les deshidrogenases i reductases que ocupen posicions crítiques de les vies metabòliques. El fet que el NAD sigui el més abundant dels coenzims ha suggerit que la funció d'aquest nucleòtid no es limita a les oxidacions biològiques. L'altre paper important del NAD és servir de substrat per a la modificació de les proteïnes per ADP-ribosilació.

Los discos imaginales de Drosophila melanogaster son los primordios de las estructuras cuticulares del adulto. El disco imaginal dará lugar al ala adulta, constituida por dos capas celulares continuas donde podemos diferenciar tres componentes básicos: las estructuras del margen, las venas y las regiones de intervena. El primer objetivo de esta tesis fue el estudio de una colección de mutantes generados por inserción de un elemento P-lacW en el cromosoma III de Drosophila melanogaster con la finalidad de identificar mutaciones que afectasen a la proliferación, morfogénesis y/o diferenciación de los discos imaginales y estudiar su función. De un total de 2.368 líneas mutantes se estudiaron las líneas letales en larva III/pupa y las líneas semiletales o viables. De entre todas las líneas se seleccionó la línea I(3)112411, constituyendo su estudio monográfico, el segundo objetivo de este trabajo.

La tesi doctoral "Selenoproteïnes i estrès oxidatiu a Drosophila: regulació negativa de la via Ras/MAPK i activació de l'apoptosi" està dividida en els següents apartats: 1. La Introducció tracta la temàtica de les selenoproteïnes i els radicals lliures, i presenta el mutant selD[ptuf] de Drosophila melanogaster com a model d'estudi. Les selenoproteïnes són proteïnes que es caracteritzen per la presencia de Seleni en forma de l'aminoàcid selenocisteïna (Sec). Les selenoproteïnes identificades de les quals es coneix la seva funció actuen com antioxidants protegint les cèl·lules de l'acció nociva dels radicals lliures. Els radicals lliures són la conseqüència del metabolisme aeròbic i per tant es generen constantment. Si bé en determinades situacions els radicals lliures tenen una funció fisiològica, també són nocius per la cèl·lules que han desenvolupat mecanismes de defensa entre els que destaquen les selenoproteïnes. La mutació selD[ptuf] és una mutació nul·la en un element de la ruta de biosíntesi de les selenoproteïnes. Així el mutant selD[ptuf] no té selenoproteïnes i acumula radicals lliures el que el converteix en un model perfecte per a l'estudi dels efectes de l'estrès oxidatiu durant el desenvolupament. 2. Objectius. Els objectius concrets d'aquests tesi doctoral han estat:- estudiar la relació entre les selenoproteïnes i la via de transducció del senyal Ras/MAPK- analitzar quina o quines vies apoptòtiques s'engeguen en resposta a una situació d'estrès oxidatiu- identificar selenoproteïnes concretes que poguessin explicar els fenotips observats3. L'apartat de Resultats està dividit en tres capítols:- Capítol 1: En aquest capítol es mostra com l'increment de radicals lliures causat per la mutació selD[ptuf] regula negativament la via Ras/MAPK (Morey et al., 2001 Dev Biol 238:145-156). També es demostra que el mutant és sensible a situacions d'estrès oxidatiu (Morey et al., 2003 FEBS Lett 534:111-114).- Capítol 2: En aquest capítol es mostra com l'increment de radicals lliures causat per la mutació indueix apoptosi a través de la via Dmp53/Rpr (Morey et al., enviat a J. Cell Sci)- Capítol 3: En aquest capítol es presenta la identificació dues noves selenoproteïnes: dselM i dselG (Castellano et al., 2001 EMBO Rep. 2: 697-702), les quals podrien ser les responsables dels fenotips observats .4. L'apartat de Discussió està dividit en cinc seccions cada una de les quals prosa una funció del gen selD.- La mutació selD[ptuf] genera una situació d'estrès oxidatiu.- Importància de les selenoproteïnes de Drosophila en el control de ROS- L'increment de ROS modula negativament la via Ras/MAPK- L'increment de ROS activa l'apoptosi a través de la via Dmp53/Rpr- Una visió integrada: defectes en proliferació i activació de l'apoptosi en el mutant selD[ptuf]5. Conclusions. D'aquest treball se n'extreuen les següents conclusions:- El gen selD modula la via Ras/MAPK a través de la síntesi de selenoproteïnes i la seva funció antioxidant- L'increment de radicals lliures causat per la mutació selD[ptuf] engega l'apoptosi majoritàriament a través de la via depenent de caspases Dmp53/Rpr.- A part de la selenoproteïna Sps2, Drosophila té dues altres selenoproteïnes: dselG i dselM.

Durant el desenvolupament dels organismes multicel·lulars els fenòmens de transducció de senyals estan íntimament lligats als mecanismes de comunicació cèl·lula-cèl·lula. En el marc d'un teixit epitelial, la formació i manteniment de l'arquitectura cel·lular i dels contactes que estableixen les cèl·lules són processos altament regulats. Una de les vies de senyalització més coneguda, i alhora estudiada, és la via de Ras/Raf/MAPK. L'activació d'aquesta via es dóna per lligands externs a la cèl·lula i s'interpreta per factors de membrana i citosòlics que transduiran el senyal intracel·lular cap al nucli. Aquesta via està altament conservada en tots els organismes eucariotes i s'usa reiteradament durant el desenvolupament en processos tan importants com la diferenciació cel·lular, la proliferació, l'apoptosi o la supervivència cel·lular. Per això, és indispensable entendre com es modula la via de Ras/Raf/MAPK, ja que segons la durada, magnitud i compartimentalització d'aquest senyal es pot donar una resposta cel·lular específica. Per tal d'identificar nous factors implicats en la regulació de la via Ras/Raf/MAPK es va dissenyar un screening genètic a Drosophila utilitzant com a model la determinació del fotoreceptor R7 durant el desenvolupament de l'ull. Per l'especificació d'aquest fotoreceptor es requereix de l'activació de dos receptors tirosina quinasa, Sevenless (Sev) i Epidermal growth factor receptor (Egfr). Una activació constitutiva del receptor Sev es manifesta en un increment en el nombre de fotoreceptors R7 en l'omatidi, i l'ull esdevé rugós. L'screening genètic per guany de funció en aquest fons sensibilitzat es basava en la cerca de factors que suprimissin aquest fenotip d'ull rugós i per extensió, factors que serien reguladors negatius de la via. D'entre els resultats que es van obtenir es va identificar un gen, center divider (cdi), la funció del qual està vinculada a la reorganització del citoesquelet d'actina cortical. Cdi és una serina/treonina quinasa encarregada de fosforilar per inactivar el factor despolimeritzador dels filaments d'actina, la ADF/Cofilina. En la present Tesi Doctoral s'ha estudiat el patró d'expressió i la funció del gen cdi en el desenvolupament de l'ull de Drosophila. Un guany de funció d'aquest gen és capaç de promoure un acúmul d'actina polimeritzada en el grup de cèl·lules de l'omatidi. També s'ha demostrat que tant el guany com la pèrdua de funció de cdi alteren la localització en l'eix apico-basal de factors integrals de les unions adherents i dels receptors i lligands propis de la via de Sev. A banda d'altres estudis fets en Drosophila per caracteritzar la funció de cdi i entendre el mecanisme d'acció en la regulació de la via de Sev, s'ha emprat el model de cèl·lules en cultiu de mamífers per analitzar el paper que té TESK1, l'homòleg de cdi en mamífers, en la regulació de la via Ras/Raf/MAPK. S'ha observat que TESK1 té l'habilitat d'inhibir la diferenciació neuronal de les cèl·lules PC12, i també que aquesta proteïna interacciona i modifica el perfil de l'activació de la MAPK. / "Celular Architecture and Signal Transduction:cdi/TESK1 gene as a modulator of Sevenless"How cellular behaviors such as cell-to-cell communication, epithelial organization and cell shape reorganization are coordinated during development is poorly understood. The developing Drosophila eye offers an ideal model system to study these processes. Localized actin polymerization is required to constrict the apical surface of epithelial cells of the eye imaginal disc to maintain the refined arrangement of the developing ommatidia. The identity of each photoreceptor cell within the epithelium is determined by cell-to-cell contacts involving signal transduction events. The R7 photoreceptor cell requires the activity of the Sevenless RTK to adopt a proper cell fate. We performed an EP screen for negative regulators of this inductive process, and we identified the serine/threonine kinase Center divider (cdi) as a suppressor of the phenotype caused by an activated Sevenless receptor. Cdi is homologous to the human testis-specific kinase 1 (TESK1), a member of the LIM kinases involved in cytoskeleton control through ADF/cofilin phosphorylation. We have analyzed the effects of gain- and loss-of-function of cdi and found alterations in actin organization and in the adherens junctions proteins DE-cadherin and β-catenin, as well as in Sevenless apical localization. Interference with the function of the ADF/cofilin phosphatase Slingshot (ssh), which antagonizes Cdi, also results in a suppression of signaling triggered by the Sevenless RTK. The results of this first chapter of the Thesis reveal a critical interplay between the localization of molecules involved in epithelial organization and signal transduction.In the second chapter of this Thesis we describe the role of the mammalian homolog of cdi, testis-specific kinase 1 (TESK1), in PC12 neuronal cell differentiation and fibroblast proliferation. In addition, we show data indicating that TESK1 interferes with both the magnitude and duration of the ERK activation profile.

Aquesta tesi es centra en la genètica de la migranya. La migranya comuna és un trastorn neurològic caracteritzat per episodis recurrents de mal de cap. Els criteris de la IHS (International Headache Society) subclasifiquen la malaltia en migranya amb aura (MA) i migranya sense aura (MO). L'aura són símptomes neurològics transitoris que poden acompanyar el mal de cap. Les aures més freqüents són les aures visuals, tot i que també existeixen les aures sensorials essent l'aura hemiplègica la seva forma severa. La nostra investigació es va dividir en dues areas d'acord amb la base genètica dels trastorns, d'una banda, s'ha estudiat la genètica complexa de la migranya comuna, d'altra banda s'ha estudiat una forma rara de la migranya que presenta una herència mendeliana anomenada migranya hemiplègica familiar (FHM). Per entendre més la base genètica de la migranya comuna es va utilitzar un estudi d'associació tipus cas-control amb gens candidats. Amb aquesta finalitat es van seleccionar al voltant de 550 pacients amb migranya (MA i MO) i el seu corresponent grup de control. Per tal d'analitzar la seva implicació en la susceptibilitat genètica a la migranya, es van triar gens que codifiquen per als canals de la superfamília heterogeni de potencial receptor transitori (Transient Receptor Potential- TRP) que se sap que estan implicats en les vies nociceptives. Aquesta feina ha donat lloc a una publicació (Carreño et al. SNP variants within the vanilloid TRPV1 and TRPV3 receptor genes are associated with migraine in the Spanish population. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2012). En el cas particular de les formes monogèniques de FHM es coneixen tres gens involucrats en la malatia (CACNA1A, ATP1A2 i SCN1A), les proteïnes codificades per aquests gens tenen un paper rellevant en la neurotransmissió del glutamat. L'anàlisi funcional de les mutacions que causen FHM han mostrat en última instància un augment de l'alliberament de la neurotransmissió. En el cas de mutacions al CACNA1A s'ha vist un efecte de guany de funció, a diferència de les mutacions al ATP1A2 que presenten un efecte de pèrdua de funció. En aquest treball s'ha fet un screening mutacional per identificar mutacions en pacients per seqüenciació directa. Quan les mutacions eren suficientment interessants s'han generat construccions en vectors d'expressió per subseqüents estudis funcionals en cèl·lules eucariotes. Aquesta feina ha donat lloc a tres publicacions. A la primera (Serra et al. A mutation in the first intracellular loop of CACNA1A prevents P/Q channel modulation by SNARE proteins and lowers exocytosis. Proc Natl Acad Sci. 2010) es va identificar un canvi que modula la funció del canal de CACNA1A. Aquest estudi ajuda a explicar la contribució genètica en la heterogeneïtat clínica d'una família i a entendre millor el mecanisme molecular dels canals de calci tipus P/Q. El segon (Carreño et al. Acute striatal necrosis in hemiplegic migraine with the novo CACNA1A mutation. Headache. 2011) és un informe d'un pacient que presenta una necrosi aguda stratial. Té una rellevància clínica a causa de l'aparició primerenca dels símptomes neurològics previs als atacs hemiplègics. El tercer i últim treball (Carreño et al. Screening of the ATP1A2 and CACNA1A genes in patients with hemiplegic migraine: clinical, genetic and functional studies. [work in progress]) recull l'screening mutacional al gens ATP1A2 i CACNA1A en 19 pacients amb FHM. Es van identificar 5 mutacions prèviament descrites i dues mutacions noves. / This Thesis is focused in migraine genetics, migraine is a prevalent neurological disorder characterized by recurrent episodes of headache. This research was divided in two areas according to the genetic basis of the disorders; on the one hand we studied the common migraine with a complex genetics, on the other hand we studied the rare mendelian forms of familial hemiplegic migraine (FHM). To understand more the genetic basis of the common migraine a case-control association study approach was used with candidate genes. For that purpose, around 550 patients with migraine and their corresponding control group were selected. In order to analyze their involvement in the genetic susceptibility to migraine, we chose genes encoding for channels of the heterogeneous superfamily of Transient Receptor Potential (TRP) which are known to be involved in the nociceptive pathway. In the particular case of FHM, a monogenic form of the disorder, there are three genes known to be involved in the FHM (CACNA1A, ATP1A2 and SCN1A), whose encoded proteins are playing a relevant role in the neurotransmission of the glutamate. Functional analysis of the mutations causing FHM have shown ultimately an increased neurotransmission release. CACNA1A previous studies reveled a gain-of-function effect from FHM mutations, unlike mutations on ATP1A2 that present a loss-of-function effect. Our work consisted on identifying mutations in patients by direct sequencing. If the mutations were interesting enough vector constructions were generated for functional studies in eukaryotic cells. This work gave rise to three publications: First; the identification of a change that modulates the function of the CACNA1A channel. This study contributes to explain the genetic contribution in the clinical heterogeneity of one family and to know more about the molecular mechanism of the P/Q calcium channel. Second; a report of a patient that presents an acute stratial necrosis that had clinical relevance because of the early onset of the neurological symptoms previous to the hemiplegic attacks. Third; a mutational screening of ATP1A2 and CACNA1A genes in 19 patients with FHM. 5 previously described mutations and two new mutations were found. Functional studies were carried out for the newly mutations.

Las invasiones biológicas son un tema de especial importancia para los biólogos marinos. Estas invasiones pueden causar daños tanto ecológicos como económicos. El Mar Mediterráneo es uno de los ecosistemas marinos con más biodiversidad de todo el globo. No obstante, es uno de los mares más castigados y contaminados por la gran actividad humana costera y por la explotación de sus recursos. En consecuencia, es una región altamente vulnerable para la introducción de especies de diferentes orígenes. Siguiendo la introducción a una nueva área (dispersión pre-frontera), los procesos post-frontera determinan el éxito en el establecimiento de las especies no indígenas. Sin embargo, se conoce poco sobre cómo estos procesos post-frontera dan forma a la composición genética de las especies no indígenas a escalas regionales. Además, las introducciones recurrentes de especies no indígenas generan interacciones nuevas entre especies residentes que varían con las condiciones locales y la composición de la comunidad receptora. Por otro lado, el estudio de especies invasoras es a menudo confundido por cuestiones taxonómicas y por lo tanto estas especies pueden no ser reconocidas como introducidas en nuevas áreas colonizadas. De entre los organismos marinos invasores, las ascidias se han convertido en un problema global. Puertos, marinas, instalaciones de acuacultura y otras estructuras artificiales suelen ser los hábitats donde son introducidas y proliferan. Concretamente, las ascidias no indígenas son una especial preocupación para la industria de acuacultura y, paradójicamente, el stock de bivalvos representa una importante vía para transportar estas ascidias por todo el mundo. El objetivo principal de esta tesis doctoral es estudiar ciertos aspectos ecológicos y genéticos de la biología de cuatro ascidias invasoras en el Mediterráneo occidental. En el primer capítulo profundizamos en los procesos post-frontera de Microcosmus squamiger estudiando su estructura genética poblacional. Esta ascidia presenta una capacidad relativamente alta de dispersión post-frontera que le permite un flujo genético entre diferentes poblaciones a pequeña escala, además, presenta dos grupos genéticos relacionados con las dos fuentes originarias (Australia) de las poblaciones introducidas mundialmente. Estos acervos genéticos están mezclados a nivel poblacional pero no a nivel de individuo. En el segundo capítulo evaluamos los interacciones biológicas en los primeros estadios del desarrollo de Microcosmus squamiger y Styela plicata entre ellas y con mejillones, otros dominantes en las comunidades bentónicas. Parece que las dos ascidias no presentan interacciones a nivel espermático y tampoco a nivel de asentamiento larvario. En cambio, los mejillones juveniles presentan altos niveles de depredación de las larvas de estas dos ascidias, además de influenciar en su comportamiento larvario. Esto nos demuestra la importancia de la comunidad residente para el establecimiento de especies introducidas. En el tercer capítulo estudiamos el ciclo de vida y la estructura genética poblacional del invasor Didemnum. vexillum. Esta ascidia presenta un ciclo de crecimiento y reproductor claramente estacional, afectado negativamente por las temperaturas cálidas del verano. Además, las poblaciones introducidas en el Mediterráneo muestran una diversidad baja, sugiriendo un proceso de cuello de botella en el proceso de introducción. Finalmente, en el cuarto capítulo estudiamos el ciclo de vida de Clavelina oblonga. Veremos que esta ascidia es una especie introducida en el Mediterráneo desde hace más de 80 años pero que fue erróneamente identificada como C. phlegraea, nativa de la región. Su ciclo reproductor y de crecimiento es marcadamente estacional, favorecido por las temperaturas altas del verano, presentando hibernación en los meses más fríos. / Biological invasions are of special concern to marine biologists. The Mediterranean is one of the most harmed seas by human activities. Among invasive marine organisms, ascidians have become a global problem. The main goal of this PhD thesis is to study ecological and genetic aspects of the biology of four invasive ascidians in the western Mediterranean. In the first chapter, we delve into the post-border processes of the ascidian Microcosmus squamiger studying its population genetic structure. This ascidian has a relatively high capacity of post-border dispersion, which allows gene flow between populations on a small scale. Moreover there are two genetic clusters related to the two original sources of the introduced worldwide populations. These genetic pools are mixed at the population level but not at the individual level. In the second chapter, we evaluate biological interactions in early-life history stages of Microcosmus squamiger and Styelaplicata, among themselves and with mussels. No interactions between the two ascidians were found in fertilization or larval settlement and metamorphosis processes. In contrast, larvae of both ascidians were consumed by the juvenile mussels, and the ascidians also presented shifts in larval behavior in the presence of the mussels. This highlights the importance of the resident community for the establishment of introduced species. In the third chapter, we study the life cycle and population genetic structure of the invasive Didemnum vexillum. The ascidian showed a marked seasonal growth and reproductive cycle, negatively influenced by warm summer temperatures. Additionally, introduced populations in the Mediterranean showed low diversity, suggesting a bottleneck process in the introduction. Finally, in the fourth chapter, we study the life cycle of Clavelina oblonga. This ascidian is in fact an introduced species in the Mediterranean for more than 80 years ago but was erroneously identified as C. phlegraea, native to the region. Their reproductive and growth cycle was markedly seasonal, favored by warm summer temperatures, hibernating in colder months.

One of the most important challenges in marine ecology is understanding the dispersal capabilities of species. Connectivity, if from en evolutionary perspective or a more current ecological perspective, is highly important in determining the natural regulation of populations. By considering both time scales, it is possible to estimate the persistence of a species and its populations. Hence, correct management decisions on conservation issues should include genetic population data combined with oceanographic processes as well as direct measurements of larval dispersal for the full understanding of the population dynamics of species. Therefore, in this thesis I evaluated the population structure, larval dispersal and gene expression in several fish species from the Mediterranean Sea. In this thesis, I approach a variety of ecological and evolutionary challenges from different angles. In chapter 3.1 I analyze the genetic population structure of two different Mediterranean fish species. The first analysis focuses on the conservation of the endangered species Epinephelus marginatus and attempts to give indications on the status of the species as well as population genetic information for the correct design of management strategies. As it becomes clear that oceanographic processes, such as fronts and currents, are important factors in influencing genetic population structure, I proceed with a more multi-disciplinary analysis of the genetic structuring of Serranus cabrilla, a common Mediterranean fish species. The approach includes the comparison of genetic data with oceanographic particle simulations and can give indications on the degree of influence that the physical environment can have on a species genetic distribution. In chapter 3.2 I move from a population approach to the individual level approach. The development, physiology and behavior of an organism determine the life history traits as well as the adaptability to changing conditions. I investigate this by evaluating the differences in gene expression and function for males displaying alternative reproductive tactics as well as females. This is the first genome-wide study for a non-molecular model species in the context of alternative mating strategies and provides essential information on the molecular basis of social dominance. With the production of a de novo transcriptome assembly in chapter 3.2, it can be possible to identify in silico single nucleotide polymorphism markers from this type of data. I start in chapter 3.3 with the development of such markers in Tripterygion delaisi exploring for an optimal protocol allowing future SNP developments in non-model species. This type of genetic markers permits a more time and resource-efficient genotyping for a large amount of samples. Therefore, I used SNPs to explore connectivity patterns by using paternity analysis. The direct evidence of dispersal requires a large amount of individuals, but can provide very important insights and is essential to understanding current connectivity patterns in different marine habitats. This study especially complements the investigations in chapter 3.1 granting a wholesome understanding of population connectivity on evolutionary as well as ecological time scales. / Uno de los retos más importantes en ecología marina es la comprensión de las capacidades de dispersión de las especies. En consecuencia, las decisiones sobre la conservación correcta de nuestros ecosistemas marinos deben incluir datos de genética de poblaciones y procesos oceanográficos, así como medidas directas de la dispersión larvaria para una comprensión más completa sobre la dinámica poblacional de las especies. Por lo tanto, en esta tesis evalúo la estructura poblacional, la dispersión larvaria y expresión génica en varias especies de peces del mar Mediterráneo. El primer análisis se centra en la conservación de la especie amenazada Epinephelus marginatus para dar indicaciones sobre el estado de la especie, así como la información genética de las poblaciones para la gestión adecuada de la especie. Se demuestra que los procesos oceanográficos, como frentes y corrientes, influyen en la estructura genética de las poblaciones, se procede a un análisis más multidisciplinar de la estructuración genética de Serranus cabrilla, una especie común de peces del Mediterráneo. El enfoque incluye la comparación de los datos genéticos con simulaciones de partículas oceanográficos y da indicaciones del grado de influencia que el entorno físico puede tener en una distribución de una especie. En el próximo capítulo investigo la base molecular de las diferencias entre tipos de machos con tácticas reproductivas alternativas mediante la evaluación de las diferencias en la expresión génica. Este es el primer estudio de una especie no-modelo con estrategias de apareamiento alternativas y proporciona información esencial sobre la base molecular de la dominación social. El ultimo capitulo trata con el desarrollo de marcadores SNPs de datos de ultra secuenciación para Tripterygion delaisi explorando un protocolo óptimo que permite el desarrollo de SNPs en especies no -modelos. Finalmente, he usado SNPs para explorar los patrones de conectividad mediante el uso de análisis de paternidad. La evidencia directa de la dispersión requiere una gran cantidad de muestras, pero puede proporcionar información muy importante y es esencial para la comprensión de los patrones de conectividad actuales en diferentes hábitats marinos.

RTK/Ras/MAPK signaling is one of the most common pathways for intercellular communication during development and in the adult organism. In addition, abnormal RTK signaling is associated with many pathological conditions, including cancer. Taking advantage of the available genetic tools of Drosophila, we use the DV axis specification as a model to study the molecular mechanisms by which RTK signaling regulates gene expression and how the same signaling pathway is interpreted differently in distinct tissues. Specifically, we have studied the mechanisms by which the localized activation of the RTK EGFR signaling pathway in the dorsal region of the follicular epithelium restricts pipe gene expression to ventral positions. pipe encodes a sulfotransferase enzyme which is essential for transfering DV polarity from the egg chamber to the embryo. Our results have shown that EGFR activity on pipe is mediated by Mirror, a homeodomain transcription factor induced by the pathway in dorsal-anterior cells. Mirror acts as a direct repressor of pipe by binding to a conserved motif (r1) in the pipe regulatory region. We also have characterized an additional aspect of pipe regulation that depends on Capicua (Cic), a HMG-box transcription factor post-transcriptionally downregulated by RTK/Ras/MAPK signaling. We have shown that the role of Cic is to support pipe expression in ventral follicle cells by repressing mirror in this region. On the other hand, we have analyzed the relevance of the negative post-transcriptional regulation of Cic by EGFR/Ras/MAPK signaling in the establishment of the initial DV asymmetries during oogenesis. Our results suggest a competition mechanism between Cic-mediated repression and EGFR-dependent and –independent activation of mirr, which leads to graded expression of mirr in dorsal and lateral follicle cells. We propose a model where the EGFR-dependent downregulation of Cic modulates the spatial distribution of Mirror protein in the lateral and dorsal-posterior follicle cells, where low, but functional Mirr activity defines the precise position at which the pipe expression border is formed. Finally, we have studied in collaboration with S. Y. Shvartsman group, the function of Cic in response to the RTK Torso signaling pathway in the early embryo. Together with previous results, our work has shown that Cic also participates in the DV subdivision of the embryo acting as a repressor of dorsal zygotic genes, as zerknüllt (zen), and that this activity is inhibited at the poles by Torso signaling. Taking together this result and other previous studies in collaboration with S. Y. Shvartsman group, we have proposed in a new model of gene regulation based in MAPK substrate competition. Molecular competition among MAPK substrates affects the expression of genes such as zen, reveals a new mechanism of integrating anterior, dorso-ventral and terminal systems. To summarize, in this thesis we show that different RTK/Ras/MAPK pathways with key roles in Drosophila development operate through common mechanisms that involve the post-transcriptional downregulation of Cic. By downregulating Cic activity, RTK signals create gradients or boundaries of Cic repressor activity that are then translated into complementary patterns of target gene expression. Since different Cic targets are regulated in different contexts, our results support the view that RTK specificity arises mainly at the level of downstream enhancers responding to general RTK effectors (including Cic) and additional ubiquitous and tissue-specific factors. / La vía RTK/Ras/MAPK es una de las cascadas de señalización evolutivamente conservadas más común durante el desarrollo de los metazoos. En concreto, la vía de EGFR es una de las más destacadas en la inducción de respuestas espacialmente localizadas en Drosophila. Concretamente, en esta tesis hemos estudiado el modo en que la activación localizada de la vía RTK de EGFR en la región dorsal del epitelio folicular restringe la expresión del gen pipe a posiciones ventrales. Pipe codifica para un enzima con actividad sulfotransferasa que resulta esencial para la transmisión de información posicional desde el ovario hasta el embrión. Nuestros resultados han mostrado que la actividad de EGFR sobre pipe está mediada por el factor Mirror, el cual actúa como represor directo de pipe uniéndose a las secuencias reguladoras del gen. Además, hemos caracterizado un aspecto adicional de la regulación de pipe que depende de Capicua (Cic), un factor de transcripción inhibido por señales RTK en diversos sistemas. Así, hemos demostrado que Capicua mantiene la expresión de pipe en la región ventral del epitelio folicular reprimiendo a su vez a Mirror en esa región. Por otro lado, hemos analizado la relevancia de la regulación post-transcripcional negativa de Cic en respuesta a la señal de EGFR para el establecimiento de esta polaridad inicial durante la oogénesis. Proponemos un modelo en el que la regulación negativa de Cic por la vía de EGFR modula la distribución espacial de Mirror en las células foliculares laterales definiendo la posición precisa del borde de expresión de pipe. Finalmente, hemos estudiado la función de Capicua en respuesta a la señal RTK de Torso en el embrión temprano. Junto con resultados previos, nuestro trabajo ha mostrado que Capicua también participa en la subdivisión dorsoventral del embrión actuando como represor de genes cigóticos dorsales como zerknüllt, y que esta actividad se encuentra inhibida en regiones terminales por la vía de Torso.

In the present Thesis, we observed that vitrifying-warming porcine embryos had detrimental effects. Indeed, vitrification and warming were seen to reduce developmental ability and quality of in vitro produced porcine blastocysts, with increased levels of DNA fragmentation, raised levels of reactive oxygen species and alterations in the expression of pluripotency and thermal shock-related genes. This suggested that establishing effective cryopreservation methods was required. Following this, we found that embryo cryotolerance did not only depend on the cryopreservation procedures but also on the composition of the culture medium. On the other hand, beneficial effects were also obtained from exposing embryos to antioxidants. Specifically, L-ascorbic acid addition during culture and/or vitrification and warming enhanced embryo survival, redox status and thermal stress response / En aquesta tesi s’ha observat que els processos de vitrificació i escalfament sotmeten els embrions porcins produïts in vitro a situacions d’estrès. Els resultats obtinguts quant a la capacitat dels embrions a l’hora de sobreviure a la criopreservació i a la qualitat dels embrions vitrificats, amb augments en els nivells de fragmentació del DNA i en les espècies reactives d’oxigen i amb alteracions en el perfil d’expressió de gens involucrats en la pluripotencialitat i en la resposta al xoc tèrmic, suggereixen la necessitat d’incrementar l’efectivitat dels mètodes de criopreservació. S’ha determinat, a més, que la criotolerància embrionària no només depèn dels processos de criopreservació sinó també de la composició dels medis de cultiu. Finalment, s’ha observat que l’exposició dels embrions a molècules antioxidants desencadena efectes beneficiosos. Concretament, l’addició d’àcid ascòrbic en els medis de cultiu i vitrificació-escalfament millora la supervivència, l’estat d’oxidació/reducció i la resposta a l’estrès tèrmic

Dugesia is a genus of free-living flatworms which species inhabit freshwater bodies across a wide distribution range that includes Africa, Madagascar, Eurasia and Australasia. They do not survive in salt water or under desiccation conditions. All Dugesia species have a characteristic triangular-shaped head with two eyes and an elongated and dorsoventrally flattened body. This general shape makes them recognizable to non-experts that also know them because of their regeneration capabilities. The two first works of this thesis are focused on the Dugesia historical biogeography. In first place we studied its species on Greece, because of its complex and well-known geological history and the high diversity of species known on the area. The results showed interesting evidences of the diversification of the genus on the area driven by its history of geological breakage since the Neogene, by the contact and severing of ancient freshwater bodies, and probably by changes in the sea level of the Mediterranean. We also observed patterns of dispersion in the Greek mainland and the Peloponnese. In a second work we included the whole Dugesia distribution range. The aim was to test the previous hypotheses on the antiquity and dispersal routes of the genus to its present geographical distribution. The last hypothesis proposed an African origin in a Gondwanan scenario during the Mesozoic period followed by a dispersion in Eurasia through the impact of the Indian subcontinent or through the impact of the Arabian plate. Our results suggest an older origin, being the genus already present on Pangaea before its breakage. Taking into account this old origin and the internal and external homogeneity of the Dugesia genus species, this is probably a case of long-term or extreme morphological stasis. The copulatory apparatus is essential for Dugesia species description and identification. However, fissiparous specimens do not have this organ, making impossible to know which species are we dealing with. In other cases the inner morphology is very similar or identical among different species, hindering the species identification. In these cases the use of molecular species delimitation methods are of major interest in order to try to overcome these morphology associated drawbacks. In a third work we used one of these methods called General Mixed Yule-Coalescent (GMYC) together with morphological data in an integrative taxonomy framework in order to describe new species from Greece and to give more support to those already described. We formally described four new Dugesia species and the new genus Recurva containing two species and a putative third one. For those clades delimited by the GMYC method for which we did not have any or incomplete morphological data we proposed two different categories: Unconfirmed or Confirmed Candidate Species. The use of molecular species delimitation methods seems to be very convenient when dealing with freshwater flatworms. At the beginning of this thesis we aimed to obtain more molecular markers by the obtention of complete mitogenomes from different triclad species. Unfortunately, this work was delayed and finally we did not succeed in the obtention of a Dugesia mitogenome but of Crenobia alpina (Planariidae) and Obama sp. (Geoplanidae). We took advantatge of these new free-living flatworm mitogenomes and we carried out an evolutionary analysis comparing them with those of parasitic flatworms in order to test if, as previously thought, the different lifecycles have had a selective effect on the nucleotide composition of the mitogenomes. Surprisingly, our results showed a more relaxed selection in the Geoplanoidea species (Dugesia, Obama and Schmidtea) in comparison with the parasitic platihelminths and Crenobia. / Dugesia és un gènere de planàries de vida lliure que habita en les l'aigües dolces d'Àfrica, Madagascar, Eurasia i Australàsia. Són organismes fràgils que no poden sobreviure en aigua salada ni en condicions de dessecació. Les Dugesia tenen un cap triangular amb dos ulls molt característic i un cos allargat i aplanat dorsoventralment. Són conegudes popularment per les seves capacitats de regeneració. Els dos primers treballs d'aquesta tesi s'ha centrat en la biogeografia històrica de les Dugesia. Primerament vam fer un estudi de les espècies que habiten a Grècia, degut a la seva història geològica complexa i ben coneguda. Els resultats mostraren evidències de la diversificació del gènere com a conseqüència de la fragmentació d'aquesta regió, del contacte i aïllament històric dels diferents cossos d'aigua dolça i dels canvis eustàtics. El segon treball de biogeografia històrica inclou tota la distribució de Dugesia, amb el propòsit de testar les hipòtesis prèvies que han volgut explicar l'antiguitat i rutes de dispersió del gènere fins a ocupar la distribució actual. Els nostres resultats descarten un origen sobre Gondwana, com s'havia proposat anteriorment, seguit per una dispersió a Eurasia a través de l'Índia o per la península Aràbiga. Dugesia s'hauria originat al supercontinent Pangea abans del seu trencament. En un tercer treball hem emprat el mètode molecular de delimitació d'espècies General Mixed Yule-Coalescent (GMYC) sobre Dugesia gregues. Vam combinar-ne els resultats amb els d'anàlisis morfològiques per identificar i descriure diverses espècies. Aquells clades delimitats pel GMYC pels quals no disposavem de dades morfològiques o bé eren incompletes van ser proposats com a espècies candidates confirmades o per confirmar. Vam descriure formalment quatre espècies de Dugesia i el nou gènere Recurva. En un treball diferent vam obtenir els mitogenomes de Crenobia alpina (Planariidae) i Obama sp. (Geoplanidae). Malgrat no aconseguir un mitogenoma de Dugesia vam aprofitar la disponibilitat de les noves molècules per realitzar una anàlisi evolutiva comparant-les amb les de platihelmints paràsits per comprovar si, tal i com s'havia proposat, els diferents tipus de vida tenen un efecte selectiu sobre la composició dels nuclèotids. Sorprenentment els nostres resultats mostren una selecció més relaxada en planàries de vida lliure.