Mutacions en els gens de les presenilines 1 i 2 són causants d'un 50% dels casos d'un determinat tipus de malaltia d'Alzheimer, conegut com a Alzheimer presenil, d'herència autosòmica dominant. En aquesta tesi doctoral, s'ha utilitzat l'homòleg de les presenilines a Drosophila melanogaster per realitzar una aproximació a la funció d'aquesta proteïna.Es coneix que la presenilina es sintetitza en el reticle endoplasmàtic com a precursor, amb 8 dominis transmembrana. Aquesta proteïna, experimenta un tall proteolític, anomenat presenilinasa, que genera dos fragments: un fragment aminoterminal o NTF i un fragment carboxiterminal o CTF, que són la forma de presenilina majoritària, estable i funcional. En aquest treball, s'ha pogut determinar que els fragments NTF i CTF formen homodímers amb ells mateixos i un heterodímer NTF:CTF. D'aquest resultat, es pot concloure que la presenilina és un tetràmer, amb dos fragments NTF i dos fragments CTF. S'ha provat d'acotar les regions dins de cada fragment implicades en aquestes interaccions i s'ha observat que una regió hidrofílica encarada cap a la llum del reticle endoplasmàtic que connecta les regions transmembrana I i II (HL1), és capaç d'homodimeritzar i, per tant, participa en l'homodímer NTF:NTF. A més, en aquesta regió altament conservada en l'escala evolutiva, es concentren un elevat nombre de mutacions causants d'Alzheimer. Es van introduir en l'HL1, mitjançant mutagènesi dirigida algues de les mutacions, i es va observar que totes elles alteren de forma significativa, tant per increment com per decrement, la interacció entre dos HL1. Per tal d'aprofundir en l'estructura d'aquest tetràmer, es van realitzar una sèrie de delecions de diferents regions de la presenilina, mitjançant les quals es va poder observar que totes les regions transmembrana participen en la formació de l'homodímer NTF:NTF i de l'homodímer CTF:CTF. La substitució de l'HL1 dins del fragment NTF per una altra regió hidrofílica de longitud molt inferior produeix, en l'homodímer NTF:NTF, un increment de la interacció. D'aquestes dades s'hipotetitza que aquesta regió hidrofílica tindria el rol de regular la interacció entre els dos fragments NTF o de determinar la col·locació de les regions transmembrana i, en definitiva, del tetràmer. Les darreres dades de la literatura indiquen que la presenilina forma part d'un complex proteic que contindria l'activitat gamma-secretasa, responsable de produir, entre d'altres, el pèptid beta-amiloide el qual forma dipòsits insolubles característics de la malaltia d'Alzheimer a partir de la seva proteïna precursora, i d'alliberar el domini intracel·lular del receptor Notch. S'ha hipotetitzat que la presenilina és la pròpia gamma-secretasa que s'autoactivaria pel tall presenilinasa, i que dos residus aspàrtics situats a les regions transmembrana VI i VII formarien un grup di-aspartil catalític. Es van realitzar experiments en cèl·lules en cultiu de Drosophila melanogaster, en les quals es va sobreexpressar de forma transitòria diferents variants mutades de la presenilina. D'una banda, es va observar que la presenilina és sensible a la introducció de seqüències extres, que codifiquen per epítops que en permeten la immunodetecció, en els dos extrems, amino i carboxiterminal. De l'altra banda, es va poder corroborar que la substitució d'un dels residus aspàrtic catalític inhibeix el tall proteolític de la presenilina. La substitució de l'HL1 també produeix una inhibició de l'endoproteòlisi. Les dades de la literatura postulen que la presenilina s'autoactiva per endoproteòlisi. Les dades generades en aquest treball indiquen que la presenilina és un tetràmer, i obren la possibilitat que el tall productor dels fragments NTF i CTF es pugui produir de forma intramolecular i/o intermolecular, entre dues presenilines. Es va explorar aquesta possibilitat mitjançant la coexpressió transitòria de dues variants de presenilina en cèl·lules SL2, i es va obtenir un resultat molt preliminar indicatiu que el tall es produiria intermolecularment.

Els resultats presentats en aquesta tesi s'emmarquen en el camp de l'estudi de les bases genètiques de l'osteoporosi. L'osteoporosi és un clar exemple de malaltia complexa, on els factors genètics tenen una elevada participació en la seva etiologia. El grup d'osteoporosi de la Universitat de Barcelona treballa en col·laboració amb la unitat URFOA de l'Hospital del Mar en la creació d'una col·lecció de mostres d'ADN de dones postmenopàusiques de l'àrea geogràfica de Barcelona, la cohort BARCOS. En aquesta es recullen, paral·lelament a les mostres biològiques, dades antropomètriques de les participants, valors de densitat mineral òssia i la ocurrència de fractures osteoporòtiques, així com d'altres informacions sobre l'estil de vida o hàbits alimentaris. Tot aquest material ens permet realitzar estudis d'associació genètica per trobar variants polimòrfiques que puguin explicar la variabilitat en els valors de DMO. La DMO s'utilitza com a fenotip quantitatiu per estudiar l'osteoporosi. El coneixement d'aquestes variables associades ha de tenir un valor predictiu de la susceptibilitat de cada individu a patir osteoporosi o fractura osteoporòtica. El principal objectiu d'aquesta tesi ha estat la realització d'un estudi d'associació en el qual es varen testar un grup d'SNPs seleccionats per tal de capturar la màxima variabilitat comuna en el gen LRP5 amb la DMO lumbar i femoral i amb la presència de fractures osteoporòtiques. Es varen obtenir resultats positius per diversos polimorfismes: rs312009 associat amb DMO lumbar, rs2508836 associat amb DMO lumbar i femoral, i rs729635 i rs643892 associats amb fractura (Agueda i col., 2008).D'entre les associacions trobades, és va decidir prosseguir a l'estudi funcional d'una d'elles: el polimorfisme rs312009. Aquest es troba localitzat en la regió 5' del gen LRP5 i els programes de predicció indicaven que en la seva posició s'hi podria unir el factor de transcripció osteoblàstic Runx2. Els assaigs de retenció en gel van permetre confirmar aquesta unió. La següent hipòtesi va ser que la presència d'un o altre al·lel de rs312009 (C o T) podria estar afectant la capacitat transcripcional del promotor d'LRP5, i que aquest mecanisme molecular podia ser en part responsable de l'associació trobada. Tanmateix, es va voler aprofundir en l'anàlisi de la implicació del factor de transcripció Runx2 en la transcripció d'LRP5. Aquestes noves preguntes es varen respondre experimentalment per mitjà d'assaigs de gen reporter en dues línies d'osteosarcoma. La construcció amb la regió promotora que contenia l'al·lel T va presentar una capacitat transcripcional significativament superior a la de l'al·lel C. També es va descriure un efecte estimulador de Runx2 sobre el promotor d'LRP5, observat en els estudis de cotransfecció. Seguint en la mateixa línia de recerca de variants genètiques implicades en la determinació dels fenotips osteoporòtics, la cohort BARCOS ha participat en les meta-anàlisis realitzades pel consorci internacional GENOMOS. En el treball concret presentat en aquesta tesi, dues variants de canvi d'aminoàcid del gen LRP5 i una del gen LRP6 (Val667Met, Ala1330Val i Ile1062Val, respectivament) varen ésser interrogades en relació a la seva associació amb DMO i fractura en 37.534 individus de 18 grups europeus i nord-americans (van Meurs i col., 2008). En aquest treball varem trobar associacions consistents amb DMO i fractura per als polimorfismes d'LRP5, però amb efectes molt modestos. Finalment, tres polimorfismes prèviament associats amb DMO en altres cohorts, i amb evidències experimentals de la seva funcionalitat biològica [(Ala222Val (rs1801133) del gen MTHFR, -13910C>T (rs4988235) del gen LCT i Ile1062Val (rs2302685) del gen LRP6], es varen testar en la cohort BARCOS. El principal objectiu d'aquest treball era la replicació dels resultats previs en una cohort independent, una aproximació actualment indispensable per confirmar els resultats trobats en els estudis d'associació (Agueda i col., 2010). / Osteoporosis, a complex disease determined by genetic and environmental factors, is characterized by a reduced bone mineral density (BMD) and an increased risk of fracture. In this thesis we studied the genetic component of osteoporosis through association and functional studies. Firstly, LRP5 was selected for association studies for being a well known candidate gene for osteoporosis. Gene-wide association studies were performed with the BARCOS cohort, a group of postmenopausal women from Barcelona. Several polymorphisms were associated with osteoporotic phenotypes. In addition, two missense variants of this gene were also studied at metaanalysis level within the international Genomos consortium. Significant results were also obatined.In second place, one of the LRP5 polymorphism associated with lumbar spine BMD was selected for further functional studies. This polymorphism is located at LRP5 5' region and seems to affect its transcriptional capacity through differential binding of the transcription factor Runx2. Finally, three functional polymorphism from MTHFR, LCT and LRP6 genes and previously associated with osteoporotic phenotypes were tested for replication in our Spanish cohort BARCOS. The MTHFR Ala222Val polymorphism was associated with vertebral fracture.

El disseny i la producció de zimògens de ribonucleases que puguin ser específicament activats per la proteasa d’un patogen, constitueix un enginyós mecanisme per controlar la seva activitat enzimàtica i, conseqüentment, la seva citotoxicitat. En aquest treball es descriu la construcció de 12 variants de zimògens d’Onconasa® (ONC) i de ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), activables per la proteasa del Virus de la Immunodeficiència Humana (HIV-1 PR). Els zimògens d’ONC i HP-RNasa s’activen in vitro amb la proteasa, mantenint una elevada estabilitat sobretot els zimògens d’ONC. L’augment d’activitat ribonucleolítica de la forma activada respecte el precursor, que resulta baix per les variants d’ONC, és d’unes 150 vegades per les d’HP-RNasa. Els zimògens d’ONC presenten una molt bona internalització en limfòcits-T humans, a més de no presentar, en cap dels casos, citotoxicitat en cèl·lules Jurkat en cultiu abans de l’activació. Finalment, s’ha estudiat l’estructura i dinàmica de la forma intacta d’un dels zimògens d’ONC per Ressonància Magnètica Nuclear (NMR), permetent el desenvolupament i optimització futura de nous zimògens més efectius com a agents antivirals. / Design and production of ribonuclease zymogens that could be specifically activated by proteases of pathogens, would provide an ingenious mechanism to control their activity and, consequently, their cytotoxicity. Here we report the construction of 12 variants of Onconase® (ONC) and Human Pancreatic Ribonuclease (HP-RNase) zymogens that are recognized and activated specifically by the Human Immunodeficiency Virus Protease (HIV-1 PR). ONC- and HP-RNase- zymogens are activated by the HIV-1 PR in vitro, and mantain a high conformational stability mainly in ONC variants. The increase of catalytic efficiency of the activated form compared to the precursor has been low in ONC zymogens, but 150-fold for those of HP-RNase. ONC zymogens can internalize in human T-lymphocyte Jurkat cells efficiently, and all of them do not show any cytotoxicity in this type of cells before their activation. Finally, the structure and dynamics of intact form of one of ONC zymogens has been determined by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR). This represents a first step toward the development and optimization of more effective zymogens, as antiviral agents.

Material addicional: http://hdl.handle.net/10230/24645 / In this thesis we aimed to study evolutionary implications of low-complexity regions, protein sequences of very simple amino acid composition. Its uncontrolled expansion causes several human diseases, including Huntington’s disease and other neurodegenerative and developmental diseases. However, they are surprisingly abundant in proteins, which seem paradoxical given their high pathogenic potential. Moreover, experimental data has shown that the formation of novel LCRs, or the modification of existing ones, can have functional consequences. First we wanted to perform a descriptive analysis of low-complexity regions in chordates focusing on lineage and age related features of LCR evolution. Second, we want to assess why low-complexity regions are so common in eukaryotic proteins. Two hypotheses have been proposed: on one hand, they may be an important source of genetic variability and might be involved in adaptive processes. To investigate whether LCRs are important players in the acquisition of novel functions, we examined transcription factor gene duplicates. On the other hand, low-complexity regions may also contribute to the formation of novel coding sequences, facilitating the generation of novel protein functions. We have tested this hypothesis by examining the content of low-complexity sequences in proteins of different age. Both analysis let us to conclude that low-complexity regions may be involved in protein diversification, either providing new functional sequences that will modify existing proteins or being involved in the formation of novel protein coding sequences. / L'objectiu d'aquesta tesi és estudiar les implicacions evolutives de les regions de baixa complexitat (LCRs, en anglès), seqüències de proteïnes amb una composició d'aminoàcids molt simple. La seva expansió incontrolada causa diverses malalties humanes, incloent la malaltia de Huntington i altres malalties neurodegeneratives i del desenvolupament. No obstant això, són sorprenentment abundants en les proteïnes, cosa que pot semblar paradoxal, donat el seu potencial patogènic. A més, estudis experimentals han demostrat que la formació de noves LCRs, o la modificació de les ja existents, pot tenir conseqüències funcionals. En primer lloc hem volgut fer una anàlisi descriptiva de les regions de baixa complexitat en cordats, incidint en les característiques relacionades amb el llinatge i l'edat de les LCRs des d'un punt de vista evolutiu. En segon lloc, hem volgut avaluar per què les LCRs són tan freqüents en les proteïnes d'eucariotes. S'han proposat dues hipòtesis: d'una banda, poden ser una important font de variabilitat genètica i podrien estar implicades en processos d'adaptació. Per tal d'investigar si les LCRs juguen un paper important en L'adquisició de noves funcions, hem examinat factors de transcripció que han patit una duplicació o. D'altra banda, les regions de baixa complexitat també poden contribuir a la formació de noves seqüències codificants, facilitant la generació de funcions noves de les proteïnes. Per comprovar aquesta hipòtesi, hem examinat el contingut de les seqüències de baixa complexitat en proteïnes d'edats diferents. Les dues anàlisis permeten concloure que les regions de baixa complexitat poden estar involucrades en la diversificació de les proteïnes, ja sigui proporcionant noves seqüències funcionals que modifiquen les proteïnes existents o participant en la formació de noves seqüències codificants de proteïnes.

La cistinosi i la malaltia de Niemann-Pick tipus C (NPC) són dues patologies hereditàries monogèniques poc freqüents, per aquest motiu estan classificades dins del grup de malalties anomenades rares. La cistinosi està causada per mutacions al gen CTNS, que codifica per una proteïna transmembrana del lisosoma que rep el nom de cistinosina. En canvi, la malaltia de NPC és deguda a mutacions al gen NPC1 o al gen NPC2, que codifiquen per una proteïna integral de la membrana lisosòmica i una proteïna soluble del lisosoma, respectivament, i aquestes reben el mateix nom que el gen, NPC1 i NPC2. El funcionament incorrecte d’aquestes proteïnes de transport dóna lloc a una acumulació de productes, diferent a ambdós casos, a l’interior del lisosoma, sent classificades com a malalties d’acumulació lisosòmica. Aquesta tesi doctoral s’ha centrat en l’anàlisi molecular de pacients afectes d’alguna d’aquestes dues malalties. S’ha realitzat el primer estudi mutacional de cistinosi a la població espanyola, que ha permès la identificació de 15 mutacions diferents, 7 de les quals no havien estat descrites: tres mutacions de canvi de sentit (p.M1T, p.S270F i p.G309V), tres delecions (c.1-19_61del, c.295_310del i c.320_323delATCA) i una mutació de splicing (c.682-1G>T). La deleció de 57 kb és la mutació més freqüent a Espanya (38% dels al•lels) i conjuntament amb altres 5 mutacions representen el 73% dels al•lels estudiats. S’ha establert que els pacients amb fenotip clínic infantil tenen a ambdós al•lels mutacions que trunquen o que afecten aminoàcids conservats de les regions transmembrana de la proteïna. En canvi, la mutació p.S139F s’ha associat a la forma juvenil de la malaltia. L’estudi mutacional realitzat a la malaltia de Niemann-Pick tipus C ha permès establir el genotip d’un gran nombre de pacients, identificant 74 mutacions diferents, 17 de les quals no havien estat descrites: set mutacions de canvi de sentit (p.P474A, p.G535V, p.F995L, p.F1079S, p.L1106P, p.G1209E i p.S1249G), dues mutacions sense sentit (p.Q775X i p.E1089X), dues insercions (p.L1117PfsX4 i p.I1061NfsX4), una deleció en pauta (p.N916del), quatre mutacions de splicing (c.58-3280C>G, c.882-28A>T, c.2604+5G>A i c.3591+5G>A) i la primera gran deleció que afecta al gen NPC1 i gens flanquejants. També s’han pogut establir correlacions genotip-fenotip per a un conjunt de mutacions. També s’ha demostrat la implicació de diferents mecanismes cel•lulars en la malaltia de Niemann-Pick tipus C, segons els tipus de mutacions causants: el “splicing”, el procés de “nonsense-mediated mRNA decay” i la degradació proteica portada a terme pel proteasoma. S’han identificat mutacions intròniques profundes i s’ha caracteritzat el seu efecte en el mRNA, conjuntament amb el de les mutacions de “splicing” que afecten als llocs canònics. El mecanisme de NMD és el responsable de la degradació del mRNA en tots els al•lels analitzats que codifiquen per un PTC al gen NPC1. La majoria de mutacions de canvi de sentit analitzades condueixen a una reducció significativa o a l’absència de la proteïna NPC1, degut a què la proteïna NPC1 mutada és degradada per la via de la ubiquitina-proteasoma. La proteïna NPC1 mutada recuperada, després del tractament amb els inhibidors del proteasoma (ALLN i MG132), és capaç de disminuir els nivells de colesterol a totes les línies cel•lulars NPC estudiades. Aquesta observació podria obrir la porta a l’ús d’aquests fàrmacs com a futur tractament per a la malaltia de NPC causada per determinades mutacions de canvi de sentit. / TITTLE: “Molecular aspects of both lysosomal transport diseases: cystinosis and Niemann-Pick disease type” TEXT: The cystinosis and Niemann-Pick disease type C (NPC) are two rare monogenic hereditary diseases. The cystinosis is caused by mutations in the gene CTNS, which encodes a transmembrane protein of the lysosome that is called cystinosin. NPC disease is caused by mutations in the NPC1 or NPC2 gene, encoding an integral lysosomal membrane protein and a soluble protein of the lysosome, respectively, and these are the same name as the gene, NPC1 and NPC2. The impaired transport leads to an accumulation of products, different in both cases, inside the lysosome, being classified as lysosomal storage disorders. This thesis has focused on the molecular analysis of patients with any of these diseases. Molecular analysis in the Spanish cystinosis patients has allowed the identification of 15 different mutations, 7 of which had not been described. The 57-kb deletion is the most common mutation in Spain (38% of alleles) and together with other 5 mutations accounted for 73% of the studied alleles. The p.S139F mutation has been associated with the juvenile form of the disease. Molecular analysis in NPC disease has established the mutation profile in a large number of patients. 74 different mutations have been identified, 17 of which had not been described previously, including the first large deletion affecting the whole NPC1 gene and flanking genes. Genotype-phenotype correlations have been established for several mutations. Different cellular mechanisms are involving in NPC disease: splicing, nonsense-mediated mRNA decay and proteasomal degradation. Deep intronic mutations have been identified and the effect on the mRNA has been characterized. NMD process is responsible for the mRNA decay for all analyzed NPC1 PTC-encoding mutations. Several missense mutations lead to a significant reduction or absence of NPC1 protein, because the NPC1 mutant protein is degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Treatment with proteasome inhibitors partially reverses the NPC1 decrease and reduces cholesterol levels in all studied NPC cell lines. This observation might represent a therapeutical approach for future treatments of NPC disease caused by specific missense mutations.

Las filogenias que incorporan información procedente de distintos loci del genoma son fundamentales para resolver las relaciones evolutivas de los seres vivos, así como para determinar con precisión los tiempos de divergencia de las distintas especies y poblaciones y estudiar fenómenos como el flujo genético. En primer lugar, se analizaron los genomas completos de las bases de datos públicas de varias especies de mamíferos y se extrajeron todos los intrones. A continuación se desarrollaron una serie de filtros computacionales automatizados para seleccionar los intrones más adecuados para ser empleados en la filogenia de especies cercanas de mamíferos de acuerdo a criterios de tamaño, copia única, reloj molecular y divergencia, obteniéndose un total de 224 nuevos marcadores intrónicos. Se amplificaron varios de estos marcadores en varias parejas de especies cercanas de mamíferos, confirmando que eran efectivamente variables interespecíficamente, y también intraespecíficamente A continuación, se emplearon 8 de estos intrones junto con marcadores mitocondriales para realizar el primer estudio filogeográfico del desmán ibérico (Galemys pyrenaicus), un mamífero endémico semiacuático de la Península Ibérica. Se obtuvieron muestras de excrementos y tejidos de toda la distribución de la especie, y las secuencias mitocondriales obtenidas revelaron una fuerte estructura filogeográfica con cuatro linajes de distribución parapátrica entre los que no se observó prácticamente flujo genético (si bien los datos nucleares sugirieron cierta presencia de flujo genético en algunas de las zonas de contacto). Los niveles de diversidad genética calculados para G. pyrenaicus fueron muy bajos comparados con la media de los mamíferos, y se observaron importantes diferencias entre los distintos clados mitocondriales, hallándose la mayor diversidad en la zona noroeste de la Península Ibérica (lo que indicaría la presencia de un refugio glacial en esta área) y la menor en los Pirineos (que serían producto de una rápida colonización postglacial). Este escenario se vio corroborado por la elaboración de un modelo de distribución de la especie y la posterior proyección a las condiciones del Último Máximo Glacial, que indicó que la zona de mayor probabilidad de presencia asociada era el Noroeste de la Península Ibérica. Por último, se realizó un estudio de los tiempos de especiación y divergencia de los musgaños europeos del género Neomys empleando metodologías que estiman el árbol de especies incorporando predicciones de la teoría de la coalescencia. Para ello se emplearon 13 intrones del conjunto desarrollado anteriormente, y se halló una notable divergencia entre dos subespecies de Neomys anomalus (N. a. anomalus y N. a. milleri). La estima del árbol de especies permitió datar esta divergencia en medio millón de años, y la aplicación de un modelo de aislamiento con divergencia permitió detectar que no se había producido flujo genético significativo entre ambas. Esto sugiere que la actual clasificación taxonómica no refleja de forma correcta la realidad biológica de estos organismos. La comparación de distintas estrategias en las estimas de árboles de especies y tiempos de divergencia reveló el riesgo asociado a no emplear tasas evolutivas específicas de los organismos y de los marcadores empleados en este tipo de estudios. / Initially, several publicly available genome sequences of mammalian species were analysed and all the introns were extracted. A bioinformatic pipeline was then developed to control for orthology and to filter them following several criteria: that they had an adequate size and molecular clock, they were divergent and single copy. The final result was a new set of 224 introns to be used in closely related species mammalian phylogenetics. Then 8 of these introns, along with mitochondrial markers, were used to perform a phylogeographic study of the Iberian Desman, that is an endangered semiaquatic mammal endemic to the Iberian Peninsula. A strong phylogeographic structure with several mitochondrial lineages with no mixing was revealed, although nuclear DNA data suggest some degree of mixing in some of the contact zones. A low overall genetic diversity for the whole species was found but there were also striking differences between the clades, with the diversity being higher in the Northwestern part of the Peninsula (thus being a potential glacial refugium) and lower in the Pyrenees (which would be the result of a recent colonization). The dating of the origin of all the desman mitochondrial haplotypes to the Middle Pleistocene and the projection of a species distribution model to the conditions of the Last Glacial Maximum also support this scenario, thus highlighting the importance of the Pleistocene glacial cycles in shaping the current genetic structure of this species. Finally, 13 introns were used to obtain the species tree of the genus of European water shrews Neomys using a multilocus coalescent approach. The divergence of two subespecies of Neomys anomalus was estimated at about 0.5 million years ago, and no significant gene flow was detected since their divergence, which suggests that their current taxonomic status might not reflect the biological reality of these taxa. A series of tests to measure the effects of different ways of estimating the rates of the partitions used on the estimation of divergence in species trees were performed. These tests highlighted the importance of using lineage and marker specific estimated rates.

Tesi realitzada a l'Institut de Medicina Predictiva i Personalitzada del Càncer (IMPPC) / In the era of “omics” data, the use of computational approaches to store, integrate and analyze biological information is becoming a priority, particularly in the field of biomedicine and the study of diseases. Bioinformatics methods have been successfully applied to numerous problems derived from this data explosion, such as the integration of experimentally-derived raw data with other sources of biological information in order to analyze it, the identification of features specific for biologically relevant sets of genes (such as those related to disease) or the prioritization of long lists of genes and mutations potentially associated to different phenotypes. In this thesis we will develop a new relational database of genes and mutations associated to disorders where annotations will be mapped to ontologies. By doing so, we will overcome some limitations of existing databases, such as their lack of normalization of annotations. This will provide us an optimal framework to investigate the use of ontologies and enrichment analysis to identify disease-specific mutation features that, hopefully, will help us in understanding some aspects of the underlying molecular biology of these diseases. Finally, we will explore whether networks derived from different types are better are predicting different diseases. Moreover, we will also test several combinations of these networks in order to see if they perform better than the networks alone. / La generación masiva de datos provocada por el incremento en el uso de tecnologías de alcance genómico hace que las técnicas de análisis de datos bioinformáticos sean más necesarias que nunca. En el campo de la identificación de genes y mutaciones asociados a enfermedad, hay dos grupos de técnicas que se están convirtiendo en muy populares para la priorización de listas de genes y mutaciones candidatos: el análisis de enriquecimiento y el uso de redes biológicas. En esta tesis hemos evaluado el uso de estas técnicas para (I) identificar propiedades biológicas que asociadas a mutaciones específicas de ciertas enfermedades y (II) el uso de distintas redes de información biológica y diferentes algoritmos de la teoría de redes para priorizar genes asociados a 5 tipos de enfermedades distintas. Para ello hemos creado una base de datos relacional con información sobre genes y mutaciones asociados a enfermedades y las propiedades biológicas que se alteran en las enfermedades. Todas las anotaciones han sido hechas con ontologías o vocavularios controlados. El análisis de enriquecimiento nos ha permitido identificar propiedades enriquecidas o deplecionadas en mutaciones asociadas a distintas enfermedades. Entre ellas destacan el empobrecimiento en mutaciones asociadas a cáncer en puentes disulfuro, péptidos señal y dominios transmembrana, o el enriquecimiento de mutaciones de cáncer en regions intrínsecamente desesctruturadas, regiones de composición de sesgada y regiones ricas en serina. Nuestra hipótesis es que las propiedades empobrecidas se deben a que su mutación es deleterea para la célula tumoral. Ello se debe a que las células tumorales tienen preactivada una via que puede llevar a apoptosis, la via de respuesta a proteínas malplegadas. La mutación en puentes disulfuro, dominios transmembrana o péptidos señal provoca una acumulación de proteínas en el retículo endoplásmico y una sobractivación de dicha via, provocando la apoptosis de la célula. Por otro lado, creemos que las propiedades enriquecidas en mutaciones de cáncer lo son porqué permiten alterar interacciones proteína-proteína y alterar el proteoma, una propiedad que se ha asociado con propiedades tumorales. En cuanto al uso de redes biológicas para predecir nuevos genes asociados a distintas enfermedades, hemos usado 5 algoritmos distintos, 4 redes con asociaciones derivadas de distintos tipos de información biológica para predecir genes asociados a 5 enfermedades distintas. Los 5 algoritmos usados son: el contaje de vecinos hasta distancias 1, 2 y 3 (DN1, DN y DN3), el Diffusion Kernel (DK) y el caminador aleatorio (RWR). Los 2 últimos pertenecen a un grupo de algoritmos llamados "algoritmos de difusión" y, según publicaciones previas, tienen una mayor capacidad de predicción que los 3 primeros (las variantes del contaje de vecinos). No obstante, según nuestros resultados, esta superioridad no es generalizable y depende en gran medida del tipo de red usada y la enfermedad predecida. Las 4 redes que hemos empleado representan proteínas conectadas por distintos tipos de relaciones: interacciones físicas (que hemos obtenido de HPRD), paralogía (de ENSEMBL), pertenencia a la misma via de señalización o coexpresión en tejido humano sano. El tipo de red más usado con el fin de predecir genes asociados a enfermedad es aquella derivada de datos de interacción, no obstante, nuestros datos demuestran que los otros 3 tipos de redes pueden funcionar tan bien o incluso mejor que ésta para este fin. A continuación hemos tratado de combinar las redes de distinta forma con el fin de mejorar su poder de predicción. Para ello hemos usado distintos algoritmos que pueden ser clasificados en dos grupos en función del momento de combinación de la información: "a priori" (aquellos métodos que combinan las puntuaciones obtenidas para cada gen en las redes independientes, en nuestro caso un clasificador Bayesiano) y "a posteriori" (la combinación de la información se hace antes de usar el algoritmo de redes, en nuestro caso hemos sumado los nodos y las aristas de las redes). De acuerdo a nuestros datos es mejor usar métodos "a priori", ya que el clasificador Bayesiano siempre tiene un menor poder predictivo que la suma de redes. Además, parece que es muy complicado obtener una suma de redes que funcione mejor, en términos de AUC, que la mejor red independiente, ya que sólo para una de las enfermedades, diabetes, hemos encontrado una combinación de redes que cumpliera con estos requisitos. También hemos observado que no existe una correlación entre el número de tipos de información biológica usados para crear la combinación de redes y su capacidad de predicción. Finalmente, hemos comprobado el poder predictivo de una de las mejores combinaciones de redes en un set de datos independiente que hemos obtenido de COSMIC. Este set de datos contiene genes mutados en, al menos, 15 muestras de cáncer colorectal y que no están presentes en nuestra base de datos. Hemos podido predecir estos genes tanto en términos de AUC como en términos de enriquecimiento de "ranking".

La mucopolisacaridosi l, la mucopolisacaridosi II i la leucodistròfia metacromàtica sòn tres malalties Iisosòmiques hereditàries. Totes tres són degudes al defecte funcional d'un enzim Iisosòmic que és incapaç de degradar les macromolècules procedents del recanvi cel•lular. Aquests substrats a mig degradar s'acumulen a les cèl.lules i són els causants del deteriorament i empitjorament de la clínica de forma progressiva. Els pacients amb aquestes malalites presenten un curs fatal, amb quadre degeneratiu progressiu sever i, en alguns casos, dismòrfies, alteracions òssies diverses, afectació ocular i organomegàlies. La mucopolisacaridosi I o malaltia de HurlerlScheie (MPS I; MIM 252800) és una malaltia hereditària d'acumulació lisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim alfa-L-iduronidasa. Aquest enzim participa en la degradació dels glucosaminoglicans heparan sulfat i dermatan sulfat. És una malaltia autosòmica recessiva. Els pacients amb MPS I presenten hepatoesplenomegàlia, deformitats esquelètiques, trets facials toscos, rigidesa d'articulacions, retard mental, sordesa i opacitat cornial. Es classifiquen els pacients en tres formes segons d'edat d'aparició dels símptomes: Forma severa o Hurler, forma íntermèdia o HurlerlScheíe i forma lleu o Scheíe. El gen que codifica per l'alfa-L-iduronidasa (IOUA; EC 3.2.1.76) està localitzat al locus 4p16.3, ocupa 16 kb, té 14 exons i un trànscrit de 2.7 kb que codifica per una proteïna de 653 aminoàcids. Fins a l'actualitat s'han descrit una quarantena de mutacions diferents al gen IOUA i algunes d'elles s'han vist amb certa freqüència. També s'han identificat una trentena de polimorfismes al gen IOUA. S'han estudiat 27 pacients espanyols amb MPS I; dels 54 al.lels estudiats, en 32 (un 59.3%) s'ha Identificat la mutació W402X, en 5 al.lels (9.3%) s'ha identificat la mutació P533R i en 4 (7.4%) la mutació Q70X. Així doncs, amb l'estudi d'aquestes tres mutacions es cobreix un 76% dels al.lels de la malaltia i un 63% dels genotips, el que fa recomanable començar l'estudi de nous pacients analitzant aquestes tres mutacions. Així mateix, ja anteriorment s'havia descrit que aquestes mutacions estaven associades a la forma severa de la malaltia, i els resultats en pacients espanyols reforcen aquestes observacions. La mucopolisacaridosi II o malaltia de Hunter (MPS II; MIM 309900) és una malaltia hereditària d'acumulació Iisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim iduronat-2-sulfatasa. Aquest enzim participa també en la degradació dels glucosaminoglicans heparan sulfat i dermatan sulfat. És una malaltia recessiva lligada al cromosoma X. Els pacients amb MPS II presenten una clínica molt similar a la que presenten els pacients amb MPS I, amb l'excepciò que els pacients Hunter no acostumen a presentar opacitat cornial. Es classifiquen els pacients en tres formes segons l'afectació neurològica: Forma severa, forma intermèdia i forma lleu. El gen que codifica per l'iduronat-2-sulfatasa (lOS; EC 3.1.6.13) està localitzat al locus Xq28, ocupa 24 kb, té 9 exons i un trànscrit de 2.3 kb que codifica per una proteïna de 550 aminoàcids. Respecte les mutacions descrites al gen lOS, s'ha vist que entre un 15 i un 20% dels pacients presenten grans delecions o reordenaments del gen, respecte les mutacions puntuals fins a l'actualitat se n'han descrit unes dues-centes de diferents. Gairebé totes sòn de caràcter particular, o sigui que cada família presenta una mutació diferent. Els exons que presenten major nombre de mutacions són l'exó III, V, VIII i IX. S'han estudiat 36 pacients espanyols amb MPS II,4 d'ells (11.1%) presenten una deleció total, parcial o un reordenament del gen, els 32 restants presenten 26 mutacions puntuals diferents, 21 de les quals han estat descrites per primera vegada. Totes les mutacions puntuals s'han identificat en una sola família a excepció de les mutacions G374G i R443X que s'han identificat en tres pacients cada una, i la R468Q que s'ha identificat en dos pacients. Això mostra que en aquesta malaltia existeix una gran heterogeneïtat al•lèlica. Els exons que presenten més mutacions als pacients espanyols són el VIII i el IX. L'existència d'aquesta gran heterogeneïtat genètica en aquesta malaltia dificulta el poder establir una correlació genotip-fenotip, sols els pacients que presenten grans delecions o reordenaments del gen s'ha vist que presenten sempre la forma severa de la malaltia. El fet que cada pacient í cada família presenti una mutació diferent fa difícil el poder establir una estratègia de recerca de mutacions, ja que cada nou cas comporta l'estudi del gen sencer, és per això que es considera que una bona estratègia de cara al diagnòstic de les familiars femenines dels nous pacients és l'estudi indirecte per marcadors polimòrfics intra i/o extragènics propers al gen. La leucodistròfia metacromàtica (LOM; MIM 250100) és una malaltia hereditària d'acumulació lisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim arilsulfatasa A que afecta el metabolisme de la mielina. Aquest enzim participa en la degradació dels sulfolipids gaiactosil sulfat (o cerebròsid sulfat) i lactosil sulfat. La seva deficiència provoca l'acumulació en la substància blanca del sistema nerviós central i als nervis perifèrics d'aquests substrats a mig degradar i són els causants del deteriorament i empitjorament de la clínica de forma progressiva. És una malaltia autosòmica recessiva. Els pacients amb LDM presenten desmielinització progressiva, atrófia óptica, demència i moren en estat decerebrat. Els pacients es classifiquen en tres formes segons l'edat d'aparició dels slmptomes: Forma infantil, forma juvenil i forma adulta. El gen que codifica per l'arilsulfatasa A (ARSA; EC 3.1.6.8) està localitzat al locus 22q13.31-qter, ocupa 3.2Kb, té 8 exons i un trànscrit de 2.1Kb que codifica per una proteïna de 507 aminoàcids. Fins a l'actualitat s'han descrit unes setenta mutacions diferents al gen ARSA, algunes d'elles amb certa freqüència a diferents poblacions i tambè s'han identificat nou polimorfismes diferents. S'han estudiat 20 pacients espanyols amb LDM i s'han identificat 18 mutacions diferents en els 40 al.lels analitzats, de les quals 12 són mutacions descrites per primera vegada. Aixl mateix s'han identificat tres nous polimorfismes. De les 18 mutacions identificades, tres d'elles s'han trobat amb certa freqüència en la Nostra població. Aquest és el cas de la mutació IVS2+1G -> A que s'ha identificat en 10 dels 40 al.lels (25%), la mutació D255H que s'ha identificat en 7 dels al.lels (17.5%) i la mutació nova T3271 que s'ha identificat en 4 al.lels més (10%). Aixi, amb l'estudi d'aquestes tres mutacions es cobreix un 52.5% dels al.lels LDM. Aixi mateix s'ha pogut veure per estudi d'haplotips que aquestes mutacions freqüents estan cada una d'elles en desequilibri de lligament amb un determinat haplotip, el que indicaria un possible origen únic per cada d'aquestes mutacions. Anteriorment s'havia observat que la mutació IVS2+1 G -> A estava associada a la forma infantil de la malaltia, els resultats en pacients espanyols recolzen aquesta observació i, d'altra banda, és la primera vegada que s'estableix la correlació entre la mutació D255H i la forma infantil de la malaltia. També s'ha pogut observar que existeix una correlació clara entre l'activitat enzimàtica i ia clinica dels pacients. Aixi doncs, en aquesta malaltia, ès recomanable iniciar l'estudi dels nous pacients analitzant les tres mutacions freqüents IVS2+1G-> A, D255H i T3271. / Mucopolysaccharidosis I (MPS I, M/M 252800), mucopo/ysaccharidosis II (MPS II, MIM 309900) and metachromatic leukodystrophy (MLD, M/M 250100) are three hereditary Iysosomal storage diseases due to the deficiency of a Iysosomal enzyme. We have studied the genes codifying the defective enzymes in the Spanish patients. MPS / is an autosomal recessive disease. We studied 27 patients. We identified mutation W402X in 59.3% of MPS I alleles, mutation P533R in 9.3% and mutation Q70X in 7.4%. We cover 76% of the alleles and 63% of the genotypes with the analysis of these three mutations. Correlation between these three mutations and the severe form of the disease seen in the Spanish patients agrees with previous results in other populations. MPS II is an X-Iinked recessive disease. We studied 36 patients. Four patients had a total or partial deletion or a rearrangement of the gene. These gene alterations are related with the severe form of the disease. The rest of the patients presented with a particular point mutation, showing the existence of a high genetic heterogeneity in this disease. Such heterogeneity would difficult the routine molecular diagnosis, although it remains as the best issue for detection. MLD is an autosomal recessive disease. We studied 20 patients. Mutation IVS2+1G -> A was identified in 25% of the alleles. This change is associated with the late-infantile form of the disease. Mutation D255H was identified in 17.5% of the alleles and for the first time we have established a c1ear correlation between this mutation and MLD severe forms. The newly identified mutation T3271 was found in 10% of the alleles. Analysis of these three mutations allows to cover 52.5% of the mutated alleles. Haplotype analyses showed that these three frequent mutations might have a unique origin.

En el presente trabajo investigamos algunos de los mecanismos endocrinos implicados en el crecimiento oocitario del lenguado senegalés (Solea senegalensis), así como el desarrollo de métodos para el control de su reproducción en cautividad. La tesis se dividió en tres partes diferentes:(i) Capítulo 1: Introducción General donde se resume el estado actual de conocimientos sobre los mecanismos endocrinos implicados en la reproducción de teleósteos, y se introduce al lector en los beneficios y problemas actuales de la acuicultura de peces planos, especialmente del lenguado senegalés (Solea senegalensis);(ii) Capítulos 2 y 3, donde se investiga el proceso de vitelogénesis en el lenguado senegalés. En el Capítulo 2, se caracteriza el ADN complementario de ambas isoformas del receptor de lipoproteínas de muy baja densidad/vitelogenina (Vtg), vtgr, y de una nueva proteína de unión a ácidos grasos (FABP), FABP11, encontrada exclusivamente en peces teleósteos. El análisis de expresión de estos genes en ovario de lenguado senegalés, sugiere que el nivel de los transcritos de vtgr puede ser utilizado como marcador molecular para determinar el número de oocitos reclutados en vitelogénesis, mientras que los niveles de expresión de fabp11 pueden funcionar como un marcador molecular muy útil para determinar los procesos celulares y factores ambientales que regulan el proceso de la atresia folicular. En el Capítulo 3, se valida un ELISA homologo para determinar la concentración de Vtg en plasma. Mediante este análisis se correlacionan las variaciones anuales de Vtg con los niveles de 17-estradiol, índice gonadosomático y porcentaje de oocitos en diferente estadio de desarrollo oocitario; y(iii) Capítulos 4 y 5, donde se investiga la aplicación de diferentes métodos hormonales para inducir a la ovulación y a la espermiación en lenguado senegalés en condiciones de cautividad. En el Capítulo 4, se tratan machos y hembras con un agonista de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHa), tanto mediante inyecciones sucesivas como mediante implantes de liberación sostenida. El tratamiento con GnRHa resulta eficaz para inducir la ovulación y la puesta en hembras F1 incapaces de reproducirse en cautividad. En cambio, el mismo tratamiento con GnRHa en machos es aparentemente ineficaz para aumentar la producción de esperma y/o estimular la espermatogénesis. En el Capítulo 5, el tratamiento de machos adultos con GnRHa en combinación con 11-ketoandrostenediona (OA), precursor de 11-ketotestosterona (11-KT), acelera la espermatogénesis y aumenta los niveles plasmáticos de los metabolitos 5β-reducidos de 17α,20β-dihidroxi-4-pregnan-3-ona (17,20βP), esteroide implicado en la maduración del esperma en salmónidos. Además, la motilidad del esperma producido por los machos tratados con GnRHa+OA, se ve duplicada respecto al esperma producido por el grupo control o el grupo tratado sólo con GnRHa. Por tanto, el tratamiento de machos de lenguado senegalés con GnRHa+OA puede ser empleado como potencial terapia hormonal para mejorar disfunciones reproductivas de machos de lenguado senegalés en condiciones de cautividad.En resumen, la presente tesis ha contribuido a profundizar en el conocimiento de los mecanismos endocrinos implicados en la gametogénesis del lenguado senegalés, y ha establecido algunos protocolos para la inducción de la ovulación y la espermiogénesis a través de terapias hormonales en esta especie de elevado interés comercial. / The present work was aimed at the investigation of some endocrine mechanisms involved in oocyte growth in the Senegalese sole (Solea senegalensis), as well as to develop methods for the control of reproduction of this species in captivity. The thesis was divided into three separate parts:(i) Chapter 1, a General Introduction where it was reviewed the endocrine regulation of reproduction in teleosts, and it introduced the reader into the significance and current problems in the culture of flatfish, particularly the Senegalese sole;(ii) Chapters 2 and 3, in which it was investigated the vitellogenic process of Senegalese sole. In chapter 2, it is described the isolation of complementary DNAs encoding two isoforms of very low-density lipoprotein/vitellogenin receptor (VtgR) and a novel fatty acid-binding protein (FABP), FAB11. The analysis of expression of these genes suggested that the the level of vtgr transcripts in the ovary may be used as a functional marker to quantify the number of oocytes recruited for vitellogenesis, while that of fabp11 may be a very useful molecular marker for determining cellular events and environmental factors that regulate follicular atresia. In chapter 3, an homologous EIA to quantify plasma vitellogenin was developed, and annual plasma levels of vitellogenin were correlated with changes in plasma 17-estradiol, gonadosomatic index, and percentage of oocyte at different developmental stage in the ovary; and(iii) Chapters 4 and 5, in which it was investigated the induction of ovulation and spermiation in Senegalese sole. In chapter 4, males and females were treated with gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa). Treatment was able to induce ovulation and spawning of F1 females that often fail to reproduce. However, this treatment was ineffective in males. Further studies were performed in chapter 5, where GnRHa treatment in combination with a biosynthetic precursor of 11-ketotestosterone, stimulated spermatogenesis, increasing the production of conjugated forms of 17,20-dihydroxy-4-pregnen-3-one, enhancing the motility of spermatozoa by 2-fold. In conclusion, the present work has contributed with novel information on the endocrine mechanisms involved in gametogenesis in Senegalese sole, and has established some protocols for the induction of ovulation and spermiation in this species through hormonal therapies.

A stereotyped tubular epithelial network forms many of our bodies’ organs and, defects in the formation of these tubules often leads to organ failure. My Thesis project aims to further understand the mechanisms underling the formation of tubular networks using the tracheal system of Drosophila melanogaster as a model system. Tramtrack (Ttk) is a widely expressed transcription factor (TF) whose function has been analysed in different adult and embryonic tissues in Drosophila. Interestingly, previous work from our lab showed Ttk as a key tracheal regulator. Ttk is involved in a wide range of developmental decisions, ranging from early embryonic patterning to differentiation processes in organogenesis (Araújo et al., 2007). Given the wide spectrum of functions and pleiotropic effects that hinder a comprehensive characterisation, many of the tissue specific functions of this transcription factor are poorly understood. We profiled gene expression experiments after Ttk loss- and gain-of-function in whole embryos and cell populations enriched for tracheal cells in order to identified some of the underlying genetic components that are responsible for the tracheal phenotypes of Ttk mutants. Our transcriptomes analysis revealed widespread changes in gene expression. Interestingly, one of the most prominent gene classes that showed significant opposing responses to loss- and gain-of-function was annotated with functions in chitin metabolism, along with additional genes that are linked to cellular responses, which are impaired in ttk mutants. The expression changes of these genes were validated by quantitative real-time PCR and further functional analysis of these candidate genes and other genes also expected to control tracheal tube size revealed at least a partial explanation of Ttk’s role in tube size regulation (Rotstein et al., 2011). In addition, from all the target genes found in this study, we identified and selected one of them expressed in the tracheal system, CG13188, for further functional analysis. After validating CG13188 differential expression by quantitative PCR, we corroborated and refined CG13188 expression pattern by generating an anti-CG13188 antibody. This protein accumulation analysis recapitulated the predicted CG13188 mRNA expression, but also indicated that CG13188 has a dynamic sub-cellular accumulation during the development of the tracheal system. We have confirmed that CG13188 protein expression levels are, as expected, dependent on the general regulator ttk. Interestingly, we saw that ttk also controls CG13188 protein localization, as in ttk mutant embryos, CG13188 protein did not accumulate apically in the tracheal cells at late embryonic stages, as compared to wild-type. These results suggested on one hand, that CG13188 in order to perform its function might need to be transported from the cytoplasm to the apical membrane of the tracheal cells. On the other hand, the CG13188 protein accumulation differences observed could be just a consequence of CG13188 protein levels between the conditions analysed. We have also observed that CG13188 expression is also controlled by the branch specific regulator spalt. CG13188-RNAi down-regulation in the tracheal system gave tracheal morphogenesis defects during mid and late embryonic stages. In particular, we observed that from embryonic stage 15, CG13188-RNAi embryos can not accumulate chitin into the luminal space of the most dorsal and ventral tracheal branches. These experiments indicated that CG13188 gene is required to form the chitin luminal cable in a branch specific manner. Its down-regulation in the tracheal system produced also physiological maturation phenotypes at late embryonic stages, as CG13188-RNAi embryos did not gas filled completely. Together our results suggested on one hand, the possibility of coexistence of more than one ECM assembly mechanism involved in tracheal tube size control. This novel chitin organisation mechanism might be dependent on branch type. On the other hand, our results might provide a first evidence of a link between chitin cable formation and gas filling tube morphogenesis processes.