El concepte de síndromes mieloproliferatives cròniques (SMPC) engloba un conjunt d'entitats hematològiques amb característiques clíniques i evolutives molt similars i d'etiopatogènia probablement comú. Es tracta de processos caracteritzats per l'expansió clonal d'una cèl·lula mare (stem cell) pluripotent, que dóna com a resultat una hipercel·lularitat medul·lar amb predomini d'una o més línies que arriben a diferenciar-se en elements madurs. Totes les SMPC es troben subjectes a evolució clonal però en un grau força variable: un 90% d'evolució a leucèmia aguda en la leucèmia mieloide crònica front un 1-2% a la trombocitèmia essencial. Les SMPC clàssiques comprenen quatre entitats: la leucèmia mieloide crònica (LMC), la mielofibrosi idiopàtica (MI), la policitèmia vera (PV) i la trombocitèmia essencial (TE). Aquesta tesi pretén caracteritzar biologicament millor la PV i la TE.La PV és el resultat de la proliferació anormal d'una cèl·lula mare pluripotent, que dóna lloc a una hemopoesi clonal d'hematies, granulòcits i plaquetes, amb predomini d'hiperplàsia eritroide sobre la resta de línies hemopoètiques. La TE és una SMPC caracteritzada per un increment persistent de la xifra de plaquetes i per una hiperplàsia megacariocítica en la medul·la òssia.Un dels criteris diagnòstics majors de la PV i majoria dels criteris diagnòstics de la TE són criteris d'exclusió. Aquest fet fa que constantment s'estiguin buscant nous biomarcadors que ajudin al diagnòstics d'aquestes patologies. Les tècniques que s'han utilitzat en aquestes tesi amb aquest propòsit han sigut:1. Citogenètica convencional: - PV: Al moment del diagnòstic entre el 13-18% dels pacients presenten un cariotip alterat mitjançant tècniques de citogenètica convencional. Les alteracions més freqüents són: del(20q) (25%), trisomia 8 (16%), trisomia 9 (16%) (tampoc era rar trobar les dues trisomies 8 i 9 juntes en el mateix pacient), duplicacions de bandes inespecífiques d'1q o trisomies d'1q (10%), seguit per del(13q), del(11q), del(7q), del(5q) i trisomia 21.- TE: Al moment del diagnòstic entre el 5% i 10% dels casos presenten alteracions cromosòmiques. Entre les alteracions citogenètiques més descrites en la TE trobem les delecions dels braços llargs dels cromosomes 20 (del(20q)) i 13 (del(13q)) i les trisomies 8 i 9. 2. Hibridació in situ fluorescent:- PV: El percentatge de pacients amb alteracions cromosòmiques que es detecten mitjançant la tècnica de FISH varia entre 14.3% i 71.5% en funció de cada sèrie.- TE: El percentatge de pacients amb alteracions cromosòmiques que es detecten mitjançant la tècnica de FISH varia entre 15% i 55% en funció de cada sèrie.3. Estudi de clonalitat mitjançant el gen HUMARA:- PV: El percentatge de clonalitat entre les pacients afectes de PV oscil·la entre el 41% i el 73%.- TE: El percentatge de clonalitat entre les pacients afectes de TE oscil·la entre el 18.7% i el 68%.La tècnica més útil com a nou biomarcador ha estat l'estudi de clonalitat mitjançant el gen HUMARA. Ara bé, la recerca constant de possibles biomarcadors (ex. PRV-1, JAK2...) poden superar la eficacia d'aquesta tècnica. / Essential thrombocythemia (ET) and polycythemia vera (PV) are chronic myeloproliferative disorders (MPD) arising from the clonal expansion of a pluripotential stem cell. Specific genetic lesions have not been recognized for both disorders, so, diagnostic criteria still are based on the presence or absence of particular clinical and laboratory features In recent years, there have been attempts to find new positive criteria that could help in the diagnosis of ET and PV, such as spontaneous in vitro colony formation of erythroid and megakaryocytic progenitors, conventional cytogenetics, fluorescence in situ hybridization techniques and analysis of X-chromosome inactivation patterns (XCIPs). This thesis wants to better characterize PV and ET. For this propose it has been used the following methodologies:1. Conventional Cytogenetics:- PV: At diagnosis between 13-18% of patients has an abnormal karyotype with conventional cytogenetics methodologies. The most frequent abnormalities are del(20q) (25%), trisomy 8 (16%), trisomy 9 (16%) (we can also find both alterations together in the same patient), duplications of unspecific bands from 1q or trisomy 1q (10%), del(13q), del(11q), del(7q), del(5q) and trisomy 21.- TE: At diagnosis between 5-10% of patients has an abnormal karyotype with conventional cytogenetics methodology. The most frequent abnormalities are del(20q)), del(13q) and trisomy 8 and 9. 2. Fluorescent in situ hybridization:- PV: The percentage of patients with abnormalities detected by FISH goes from 14.3% to 71.5% depending on the series.- TE: The percentage of patients with abnormalities detected by FISH goes from 15% to 55% depending on the series. 3. Clonality study with HUMARA gene:- PV: The percentage of clonality between patients goes from 41% to 73%.- TE: The percentage of clonality between patients goes from 18.7% to 68%.The most useful technique as a biomarker has been the clonality study with the HUMARA gene. But the constant investigation of new possible biomarkers (ex. PRV-1, JAK2...) could be even more useful than this one.

Es presenta un resum dels resultats i les conclusions de cadascun dels capítols en què es divideix la tesi.1. La circumscripció i la classificació intragenèrica de Campanula és altament controvertida. Per tal de dilucidar les relacions filogenètiques de Campanula i gèneres aliats, així com explorar els processos biològics que van ocórrer durant l'evolució d'aquest gènere, s'han obtingut un total de 105 noves seqüències de la regió de DNA cloroplàstic trnL-F i 41 noves seqüències de la regió nuclear ITS de diferents espècies de Campanula i gèneres afins. El mostreig inclou les principals seccions i subgèneres de Campanula, així com gèneres propers. S'ha construït una matriu de seqüències per a cada regió afegint-hi altres disponibles a la base de dades Genebank, per tal d'analitzar les matrius independentment i de forma combinada mitjançant els mètodes de Parsimònia i Inferència Bayesiana. S'han mapat en els arbres filogenètics resultants dades per cercar patrons evolutius: nombre cromosòmic, tipus de corol.la, hàbit, tipus de dehiscència de la càpsula. Les anàlisis filogenètiques han revelat que Campanula, en la seva circumscripció actual, no és un gènere monofilètic. Aquest gènere es divideix en dos clades principals: el primer és un ampli clade format per la majoria d'espècies de Campanula incloent gèneres propers (Adenophora, Asyneuma, Azorina, Campanulastrum, Diosphaera, Edraianthus, Githopsis, Hanabusaya, Heterocodon, Legousia, Michauxia, Petromarula, Physoplexis, Phyteuma, Trachelium and Triodanis); i el segon és un clade constituït per Musschia més dos espècies de Campanula. L'ampli clade de Campanula es compòn de dos grups, un tipus Rapunculus i un tipus Campanula. Tant l'anàlisi bayesiana com la de Parsimònia indiquen que els principals caràcters morfològics utilitzats en les classificacions tals com la forma de la flor i la dehiscència de la càpsula han aparegut paral.lelament. Per explicar la convergència floral es suggereixen fortes pressions selectives per part dels pol.linitzadors. Plantegem dues propostes diferents per tal d'obtenir una classificació de Campanula que reflecteixi més acuradament l'evolució d'aquest gènere.2. En aquest estudi hem explorat l'evolució espaial i temporal (en termes d'àrees ancestrals i episodis de divergència) de les Campanulàcies en sentit estricte, i de Campanula en particular, mitjançant una aproximació bayesiana de la datació molecular i de l'ànalisi de dispersió-vicariança que té en compte la incertesa filogenètica. Per resoldre les relacions filogenètiques en els grups majors (Wahlenbergieae-Campanuleae), hem seqüenciat la regió conservada rbcL incloent tàxons dels principals llinatges de Platycodoneae i Wahlenbergieae. Les anàlisis de datació i biogeografia s'han aplicat a les noves dades del marcador rbcL i a les dades del marcador trnL-F obtingudes en l'estudi previ. Les anàlisis filogenètiques mostren que Platycodoneae és el grup germà de les Wahlenbergiae-Campanulae, les quals apareixen combinades entre sí. Els resultats suggereixen que l'oest d'Àsia i l'est de la Mediterrània han jugat un paper important com a centres de migració i diversificació del grup Campanula. La història biogeogràfica d'aquest gènere sembla que ha estat molt complexe. Les taxes de diversificació de Campanula haurien incrementat durant el període Messinià. Suggerim que els canvis climàtics i l'expansió de regions muntanyoses durant aquest període actuaren com a fortes pressions selectives que expliquen el fet que moltes espècies de Campanula estan adaptades a ambients secs, freds o alterats.3. Campanula subgènere Roucela comprèn espècies que conformen unitats evolutives difícilment delimitables morfològicament degut a la manca de caràcters estables. Per aquesta raó, el tractament taxonòmic del subgènere Roucela és molt controvertit. S'han obtingut noves seqüències nuclears i cloroplàstiques (ITS, trnG i trnL-trnF) per a construir les respectives matrius i analitzar-les independentment i de forma combinada mitjançant els mètodes de parsimònia i inferència bayesiana, per millorar els coneixements de les relacions filogenètiques d'aquest grup. S'han mapat en els arbres filogenètics els nombres cromosòmics i caràcters morfològics per tal d'esbrinar possibles patrons evolutius. Les anàlisis filogenètiques de Roucela han revelat que la circumscripció actual no és monofilètica. Campanula scutellata presenta tendències morfològiques i moleculars que suggereixen la seva pertanyença a una unitat evolutiva diferent. La resta d'espècies de Roucela conformen un grup monofilètic, tot constituïnt tres clades que no es corresponen amb els principals trets morfològics. Es suggereix una proposta taxonòmica per tal d'obtenir una circumscripció que es correspongui amb l'evolució del subgènere Roucela. / We present a synthesis of the main results and conclusions of each chapter of the thesis.1. The circumscription and intrageneric classification of Campanula is highly controversial. In order to elucidate the phylogenetic relationships of Campanula and related genera, and explore the biological processes that occurred during the evolution of this genus, we obtained 105 new sequences of the DNA chloroplastic region trnL-F and 41 new sequences of the ITS nuclear region of different species of Campanula and allied genera. An extensive sampling of the main sections and subgenera of Campanula and related genera was done. We constructed a sequence matrix for each region where we added other sequences available in Genebank. Independent and combined data from nuclear and chloroplast sequences were analyzed with Bayesian and Parsimony methods. Chromosome numbers, corolla types, habit and capsule dehiscence were mapped on the phylogenetic trees obtained to search for evolutionary patterns. The phylogenetic analyses revealed that Campanula, as currently circumscribed, is not monophyletic. This genus is divided into two main clades: a large core of Campanula species that includes related genera (Adenophora, Asyneuma, Azorina, Campanulastrum, Diosphaera, Edraianthus, Githopsis, Hanabusaya, Heterocodon, Legousia, Michauxia, Petromarula, Physoplexis, Phyteuma, Trachelium and Triodanis), and a clade constituted by Musschia plus two Campanula species. The large core of Campanula is divided into two main groups, a rapunculoid and a campanuloid group. Both Bayesian and Parsimony analyses indicate that the main morphological characters used in classifications such as flower shape and capsule dehiscence have arisen in parallel. Strong selective pressures from pollinators are suggested to explain floral convergence. We put forward two different proposals in order to accomplish a classification of Campanula that more accurately reflects the evolution of this genus.2. In this study, we explored the spatial and temporal evolution in terms of ancestral areas and divergence episodes of the Campanulaceae s. str. and Campanula alliance in particular, by applying a Bayesian approach to molecular dating and dispersal-vicariance analysis that takes into account phylogenetic uncertainty. To better resolve relationships among major groups (Wahlenbergieae-Campanuleae) and the position of some genera such as Trachelium L. with respect to Campanula, we have sequenced the rbcL-conserved region including taxa of some major lineages within Platycodoneae and Wahlenbergieae. Dating and biogeographic analyses were applied to the new rbcL data and to the trnL-F data obtained in a previous study. The phylogenetic analysis showed that Platycodoneae is the sister group of Wahlenbergiae-Campanulae, which appeared inter-graded. The results obtained suggest that Western Asia and Eastern Mediterranean seem to have played an important role as centers of migration and diversification of the Campanula core. The biogeographical history of this genus seems to be highly complex. Rates of species diversification of Campanula seem to have increased during the Messinian period. Strong selective pressures from the climate changes and the expansion of mountainous regions during this period are suggested to explain the fact that many species of Campanula are adapted to drought, cold or disturbed environments.3. Campanula subgenus Roucela includes species that constitute evolutionary units very difficult to delimit morphologically due to the lack of stable characters. Because of this, the taxonomic treatment of Roucela is highly controversial. We obtained new nuclear and chloroplast sequences (ITS, trnG and trnL-trnF) to analyze these data with Bayesian Inference and Parsimony methods to elucidate the phylogenetic relationships of Roucela, in order to ameliorate the understanding of its phylogenetic relationships. Chromosome numbers, and morphological characters were mapped on the phylogenetic trees searching for evolutionary patterns. The phylogenetic analyses revealed that Roucela, as currently circumscribed, is not monophyletic. Campanula scutellata shows morphological and molecular trends that suggest that it belongs to a different evolutionary unit. The rest of the Roucela species constitute a monophyletic group with three different lineages, which are not in consonance with the main morphological features. We suggest a taxonomic proposal in order to obtain a more natural circumscription for the subgenus Roucela.

El BPA es un compuesto que se produce y se emplea anualmente en grandes cantidades. Debido a su amplio uso en la producción de artículos empleados en alimentación, juguetes, odontología y biberones, se considera que es un compuesto al cual estamos expuestos de manera continuada. Estudios realizados en los Estados Unidos de Norte América han demostrado que el 90% de los adultos tienen valores detectables de este compuesto en sangre y orina. Las mujeres embarazadas así como los neonatos son un grupo particular de estudio ya que en ellos se duplican lo valores descritos en adultos tanto en sangre como en orina. En este sentido, es importante señalar que los productos “derivados de la gestación” (líquido amniótico, placenta y leche materna) pueden presentar valores hasta 10 veces más altos. Los efectos del BPA como disruptor hormonal se han estudiado en diferentes modelos de animales así como en cultivos de líneas celulares tanto de humanos como de animales. Sin embargo, los efectos a nivel reproductivo siguen siendo un punto de debate dentro de la comunidad científica. Se ha demostrado que el BPA produce alteraciones en la estructura y función de los ovocitos provenientes de tejido ovárico adulto pero en el caso específico de ovocitos fetales, solo existen unos pocos reportes sobre sus efectos. De hecho los estudios realizados para evaluar los efectos del BPA en ovocitos en profase I han demostrado que tanto en C. elegans como en ratón, este producto afecta el correcto desarrollo de los procesos de apareamiento, sinapsis y recombinación, con las consecuencias que, de ellos, puedan derivarse en las células germinales resultantes. En este sentido, si en animales de experimentación existe poca información, en ovocitos fetales humanos es inexistente. Las características de la gametogénesis femenina en mamíferos incluyendo al humano, en la cual el proceso reproductivo se inicia durante la vida fetal han limitado aún más su estudio. Durante este período se desarrollan diferentes procesos celulares, y sin duda la primera profase meiótica es uno de los más importantes. El correcto desarrollo de los eventos de apareamiento, sinapsis y recombinación durante la profase I permite que durante la edad reproductiva se tengan ovocitos con las características necesarias para ser aptos en el proceso reproductivo. La alteración de estos procesos se relaciona con anormalidades en la segregación, aneuploídias y en general con trastornos en la vida reproductiva de la mujer. De esta manera el objetivo de este trabajo es valorar los efectos del BPA sobre los procesos de apareamiento, sinapsis y recombinación en el ovocito fetal humano expuesto al BPA tanto a nivel citogenético como a nivel de expresión génica. De esta manera, los objetivos planteados durante el desarrollo de este trabajo de tesis doctoral han sido: Objetivo general: Determinar los efectos tóxicos del BPA en ovocitos fetales humanos cultivados in vitro. Objetivos específicos: 1. Desarrollar un modelo de cultivo in vitro que permita: • la progresión meiótica de los ovocitos fetales humanos in vitro. • la recombinación meiótica de los ovocitos fetales humanos in vitro. 2. Evaluar el efecto del BPA en ovocitos fetales humanos cultivados in vitro, con respecto a: • la progresión meiótica de los ovocitos fetales humanos in vitro. • la recombinación meiótica de los ovocitos fetales humanos in vitro. 3. Evaluar la expresión génica de los ovocitos fetales humanos in vitro en: • Ovocitos fetales humanos en cultivo no expuestos a BPA. • Ovocitos fetales humanos en cultivo expuestos a BPA.

El compost energètic que utilitzen les cèl·lules per realitzar les seves funcions biològiques bàsiques és l’ATP, produït a través de la respiració oxidativa mitocondrial. Durant aquest procés es produeixen de manera secundària espècies reactives d’oxigen (ROS) que són capaces d’atacar i danyar diferents estructures cel·lulars, entre elles el DNA. Si es produeix un desequilibri i les ROS generen dany considerem que la cèl·lula es troba condicions d’estrès oxidatiu. La present tesi doctoral aporta nous coneixements sobre els mecanismes de reparació del dany al DNA en fase replicativa i en condicions d’estrès oxidatiu. Està centrada en l’estudi de dos mecanismes de reparació del dany: la ruta de senyalització de l’Anèmia de Fanconi (FA) i l’acció de l’antigen de proliferació nuclear (PCNA). FA és una malaltia genètica rara i altament heterogènia causada per mutacions en 15 gens coneguts. Està caracteritzada per disfuncions al moll de l’os, susceptibilitat a càncer i fragilitat cromosòmica. Les cèl·lules FA presenten un defecte en la reparació dels enllaços creuats entre cadenes (ICLs) del DNA en fase replicativa. Les 15 proteïnes derivades actuen en una ruta de senyalització conjunta per la reparació dels ICLs. Es considera que la ruta està activada quan es produeix la monoubiquitinació de la proteïna central FANCD2. Fins l’actualitat no es coneix cap inductor de ICLs, tant endogen com exogen, que sigui capaç d’explicar el fenotip observat. En el present treball s’explora l’estrès oxidatiu endogen com una de les possibles causes per explicar el fenotip de FA. Es coneix que les cèl·lules FA presenten nivells elevats de la base oxidada 8-oxoG al DNA. Els resultats presentats aquí descarten un defecte en el processament de les lesions oxidatives per part de la ruta FA i, per tant, els nivells elevats de 8-oxoG en cèl·lules són deguts a una superproducció de dany. El dany oxidatiu indueix de manera secundària trencaments de doble cadena (DSBs) i es demostra un processament d’aquest tipus de lesió per part de la ruta FA. L’Atàxia telengectasia (A-T) és una altra malaltia genètica rara caracteritzada per un defecte en la reparació del DNA i causada per mutacions en la proteïna de control del cicle cel·lular i de resposta a dany ATM. A-T presenta certs trets característics comuns amb FA tals com els nivells elevats de 8-oxoG en cèl·lules i pacients. El nostre treball planteja un model comú entre FA i A-T en la reparació del dany oxidatiu: ATM fosforila FANCD2 al residu S222 en resposta a lesions secundàries induïdes pel dany oxidatiu tals com els DSBs per a l’establiment del punt de control del cicle cel·lular en fase S del cicle. Aquest fet podria explicar el perquè el fenotip dels pacients FA amb mutacions al gen de FANCD2 presenten una major severitat respecte la resta de pacients del grup central de FA. Així doncs, FANCD2 és una proteïna amb funcions duals en la resposta a dany oxidatiu: està involucrat en la reparació per se dels DSBs (monoubiquitinació) i intervé en el correcte establiment del punt de control de fase S del cicle cel·lular (fosforilació). L’última part del treball descriu una nova ruta de reparació del dany oxidatiu mitjançant la monoubiquitinació de PCNA depenent de fase replicativa del cicle cel·lular i de la lligasa d’ubiquitina RAD18. La monouibiquitinació de PCNA és un conegut mecanisme d’activació del procés de síntesi per translesió (TLS). Aquest procés està caracteritzat pel reclutament de les polimerases de TLS per a la síntesi de DNA circumval·lant la lesió. El treball proposa un model de la circumval·lació de les lesions oxidatives mitjançant la monoubiquitinació de PCNA i el reclutament de manera específica de la polimerasa de TLS DNA polι. / ATP is the molecular unit of currency of intracellular energy transfer. ATP is produced normally during the oxidative phosphorylation inside the mitocondria, the process induces by side effects reactive oxigen species (ROS) capable to induce damage to all cellular structures, including DNA. Cells have developed during evolution several mechanisms to control ROS damage. If these mechanisms fails, we consider the cell under oxidative stress conditions. The thesis sheds light on the DNA repair mechanisms in replicative phase of cell cycle under oxidative stress conditions. Is focused on the study of two DNA repair pathways: the Fanconi Anemia (FA) pathway and the role of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in response to oxidative insults. FA is a highly heterogenic rare genetic disease. Mutations in any of the 15 known FA gens cause FA. FA is characterized by bone marrow failure, chromosome fragility and increased cancer susceptibility. FA cells are sensitive to interstrand crosslinking (ICLs) agents. All 15 FA proteins cooperate in a common pathway to repair the ICLs lesions during replicative phases of cell cycle. We consider FA pathway activated when the central FA protein FANCD2 is monoubiquitinated in response to DNA damage. Until now, is not known any natural source of ICLs, either endogenous or exogenous, to explain FA phenotype. We tried to solve in the thesis if the endogenous oxidative damage could explain, at least partially, FA phenotype. Is known that FA cells present high level of the oxidated lesion 8-oxoG in their DNA. The results presented here discard a repair defect of FA cells in response to oxidative lesions such as 8-oxoG and other oxidative base lesions processed by BER. So and most probably, the high levels of 8-oxoG observed in FA cells are due to increase of 8-oxoG production rather than DNA repair defect of these kind of lesion. We showed here that DNA oxidative damage inducer H2O2 induces secondarily DNA double strand breaks and that this DNA lesion is processed by FA pathway. Ataxia telengectasia (A-T) is another rare genetic disease characterized by DNA repair defects caused by mutations in the cell cycle and DNA repair protein ATM. A-T shares some phenotypic common tracks with FA such as the increased levels of 8-oxoG in their DNA. Our work suggest a common and coordinated model between A-T and FA in response to oxidative damage inducer H2O2: ATM phosphorylates residue S222 of FANCD2 protein in response to DSBs induced by oxidative damage to correctly establish the cell cycle checkpoint in S-phase to repair the damage. This model could also explain why FANCD2 patients have more sever phenotype respect FA core complex patients. In summary, we showed here that FANCD2 has dual functions in response to oxidative damage inducer H2O2, is both monoubiquitinated through ATR and FA pathway and phosphorylated through ATM kinase for proper response to oxidative endogenous insults. The last part of the work describes a novel DNA repair pathway in response to oxidative damage mediated by PCNA and dependent on replicative phase of the cell cycle. PCNA is monoubiquitinated in response to oxidative DNA damage lesions by RAD18 ubiquitin ligase in a translesion synthesis (TLS) like process. Monoubiquitinated PCNA is then able to recruit TLS polymerases to bypass oxidative DNA lesions. We suggest here a putative and novel role for the unknown DNA polymerase iota to bypass such kind of oxidative lesions in an error free manner.

El Retinoblastoma és el tumor intraocular maligne més freqüent en l'edat pediàtrica, amb una incidència d'entre 1/16.000 i 1/25.000 nascuts vius. És hereditari en el 40% dels casos, amb una segregació de caràcter autosòmic dominant, i no hereditari en el 60%.Per a determinar si un pacient presenta la forma hereditària o no hereditària de la malaltia, cal un diagnòstic genètic, pel que l'objectiu principal d'aquest treball va ser l'establiment d'un protocol de diagnòstic addient.Es va realitzar un estudi citogenètic i d'hibridació in situ fluorescent, i un estudi molecular, utilitzant les tècniques de detecció directa de mutacions per PCR i digestió enzimàtica, la tècnica de SSCP, i la seqüenciació automàtica. Es va portar a terme d'altra banda un estudi indirecte per anàlisi de lligament, en famílies amb al menys dues generacions d'individus afectesA partir d'aquest treball s'han obtingut els resultats i conclusions següents:1.- Mitjançant l'estudi citogenètic s'ha detectat un 4,2% d'anomalies constitucionals que justifiquen el fenotip dels pacients2.- Mitjançant FISH s'han detectat mutacions constitucionals en el 14,3% dels individus estudiats, que justifiquen el seu fenotip3.- En l'anàlisi de lligament utilitzant els marcadors BamHI, XbaI, Tth 111 I, Rb1.20, i VNTR16 s'ha observat un percentatge d'heterozigots del 46,6%, 60%, 34,5%, 74,2% i 84,6% respectivamentLa utilització conjunta de cinc marcadors polimòrfics ha permès identificar l'al·lel del gen RB1 al que va lligada l'herència del retinoblastoma en les famílies estudiades4.- L'anàlisi dels exons 8 i 18, que contenen codons CGAarg, per digestió amb enzims de restricció, ha permès detectar mutacions en dos pacients (5%), caracteritzades per seqüenciació, i els resultats obtinguts estan d'acord amb el fenotip dels pacients 5.- El cribatge de mutacions mitjançant SSCP ha permès la detecció, en quatre pacients, de tres variants, (3,1%, 2,8%, 5,8% dels pacients estudiats per cada exó), caracteritzades mitjançant seqüenciació6.- La baixa incidència d'anomalies detectades mitjançant SSCP es justifica tant per l'alt percentatge de pacients amb retinoblastoma esporàdic unilateral i unifocal inclòs a l'estudi (35%), com per l'elevada heterogeneitat mutacional del gen RB1, i per la baixa eficiència del mètode.7.- El diagnòstic genètic mitjançant l'anàlisi de mutacions ha permès l'assessorament als familiars de risc, i oferir un diagnòstic prenatalL'anàlisi indirecta ha estat útil per a la detecció de portadors adults no afectes, i per a determinar la condició de no portadors de pacients en edat de risc, fet que els pot excloure de revisions oftalmològiques8.- La variabilitat clínica i l'heterogeneitat genètica de la malaltia, fan necessari utilitzar un protocol d'estudi genètic, tant per pacients amb retinoblastoma bilateral com unilateral, aplicable a la rutina clínica en termes de cost-benefici. / Retinoblastoma (Rb) is the most common intraocular tumour in children, with an incidence of 1 in 16.000-23.000 live births. Of all Rb-patients, 40% have a heritable predisposition; this form is inherited as an autosomal dominant trait, with high, but incomplete penetrance.In order to determine carrier status it's necessary to establish a test suitable for genetic diagnosis.Cytogenetic and fluorescence in situ hybridization analysis, as well as a molecular study of mutations by enzymatic digestion, SSCP and PCR sequencing were carried out. In patients with positive family history, we have employed intragenic polymorphic markers in a linkage analysisOur main results and conclusions are as follow:1.- Cytogenetic and FISH analysis allowed the detection of constitutional mutations in 4,2% and 14,3% of patients respectively2.- Segregation of disease-causing gene was followed by linkage analysis in all families studied3.- Enzimatic digestion analysis of exons 8 and 18 revealed mutations in two patients (5%), confirmed by sequencing, and related to patient's phenotype4.- Mutation screening by SSCP allowed the detection of three alterated patterns (3,1%, 2,8%, 5,8% of patients studied for each exon), all of them characterized by sequencing5.- The low frequency of mutations found in our study using SSCPis explained by the high percentage of unilaterally sporadic affected patients analyzed (35%), as well as by the wide spectrum of mutations affecting Rb gene, and by the low efficiency of SSCP6.- Direct detection of mutations has allowed genetic assessment of parents, and can be applied in prenatal screeningIndirect analysis has allowed unequivocal identification of gene carriers as well as exclusion of repeated ophthalmological examination of those individuals who don't carry the mutant gene. The study has been applied prenatally7.- Because of clinical and genetic heterogeneity, a procedure for genetic testing is required, both for bilaterally and unilaterally affected patients. This procedure needs to be applicable to clinic routine

Generalment s'ha pensat que la regulació de l'splicing alternatiu està controlada principalment per la interacció entre els factors reguladors de l'splicing i la taxa d'elongació de la ARN polimerasa II (RNAPII). Hi ha un evidencia emergent de la complexitat de la regulació de l'splicing alternatiu, que ara també inclou l'activitat d'ARNs no codificants i l'estat de la cromatina. Diverses experiments han demostrat que modificacions en les histones poden regular la inclusió d'exons alternatius, i que la taxa d'elongació de la RNAPII pot estar influenciada pels diferents estats de la cromatina. Els ARNs petits (sRNAs) són una família d'ARNs no codificants associats amb membres de la família de proteïnes Argonauta i són efectors de la via de silenciació gènica. Alguns sRNAs participen en una via alternativa anomenada via de silenciació gènica transcripcional (TGS). Evidències experimentals ha mostrat que els sRNAs interferents que s'uneixen a introns poden promoure l'aparició de modificacions en les histones que alteren la taxa de elongació de la transcripció provocant canvis en l'splicing alternatiu. Aquesta via és coneguda com via de silenciació gènica transcripcional acoplada a splicing alternatiu (TGS-AS). Tenint aixó en compte, nosaltres vam proposar que la proteïna Argonauta 1 (AGO1), podria induir la formació d'heterocromatina i canviar l'splicing alternatiu alterant l'elongació de la RNAPII. Per tal de realitzar una análisi a escala genómica de la regulació de l'splicing alternatiu, hem utilitzat dades provinents de noves tècniques de seqüenciació a gran escala, com ChIP-Seq i RNA-Seq. Hem trobat que hi ha regulació d'splicing alternatiu depenent d'AGO1. Els nostres resultats suggereixen que ARNs interferents endógens podrien estar relacionats amb aquesta regulació. A més, a la part final de la tesi demostrem que hi ha un codi de cromatina que requereix AGO1 que regula l'splicing alternatiu i que és específic per diferents tipus cel·lulars. Adicionalment hem trobat que altres efectors, com CTCF i HP1 alpha, també sòn importants per explicar els canvis en l'splicing dels pre-ARNs. Conjunatment amb altres treballs, aquesta tesis demostra que la regulació de l'splicing alternatiu implica la funció de molts components nuclears i probablement de molts altres que encara han de ser descoberts. / The regulation of alternative splicing has been generally thought of being primarily controlled by the interaction of splicing factors with the RNA molecule and by the elongation rate of the RNA polymerase II (RNAPII). There is an emerging understanding of the complexity of how alternative splicing is regulated which now involves the activity of non-coding RNAs and the chromatin state. Different experiments have shown that histone modifications can regulate the inclusion of alternative exons and that the elongation rate of the RNAPII could be influenced by different chromatin states. In this sense, small RNAs (sRNAs), which are a family of non-coding RNAs associated with members of the Argonaute family of proteins, that are effectors of the silencing pathway, which can participate in an alternative pathway known as transcriptional gene silencing (TGS). Experimental evidence shows that siRNAs targeting introns can induce chromatin marks that affect the rate of transcriptional elongation, affecting the splicing of pre-mRNAs, which is called transcriptional gene silencing alternative splicing (TGS-AS) \citep{Allo2009}. Thus, we proposed that the Argonaute protein (AGO1) could trigger heterochromatin formation and affect splicing by affecting RNAPII elongation. In order to perform a genome-wide analysis of the regulation of alternative splicing we used new highthroughput sequencing technologies as ChIP-Seq and RNA-Seq. We found that there is AGO1 dependent alternative splicing regulation, and our results suggest that endogenous sRNAs could be involved. Additionally, in the last part of the thesis we show a cell specific alternative splicing chromatin code, which also involves AGO1. Even though AGO1 regulation of alternative splicing was related to some specific cases, we found that other effectors, CTCF and HP1$\alpha$ were also important for the splicing changes decisions. This thesis and other recent reports show the regulation of alternative splicing as an integrated process,

La família B7 de proteïnes és àmpliament reconeguda per jugar un paper important en els processos inflamatoris mitjançant l'alteració de la capacitat de resposta de les cèl•lules T. La unió d’aquestes proteïnes als seus receptors situats a la superfície de cèl•lules T pot promoure (per exemple, B7-1, B7-2, ICOS- L) o inhibir (per exemple, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7x) l'activació, la proliferació, la maduració i la producció de citoquines en cèl•lules T . A més, s’ha identificat l’expressió de diversos membres d’aquesta família de proteïnes tant en diferents tipus de tumors com en el microambient tumoral. Degut a les capacitats immunosupressores de diversos membres de la família B7, es creu que l'expressió aberrant d'aquestes molècules a interferit negativament amb la resposta immune de l' hoste, el que porta a la progressió de la malaltia. En efecte, l'expressió de proteïnes de la família B7 en molts tumors hematològics malignes s'associa sovint amb un mal pronòstic i un comportament agressiu dels tumors. Actualment, diversos membres de la família B7, com CTLA-1 i PD-1 són usats per el tractament del càncer i, més recentment , el primer agent que focalitza la via de B7, el anti-CTLA-4 MAB (ipilimumab) ha estat aprovat per l'Administració d'Aliments i Medicaments (FDA) per al tractament del melanoma metastàsic. A més, els estudis en curs dirigits a membres recentment descrits de la família B7: B7-H3, B7x, B7-H6 són prometedors , però una major clarificació del seu paper patogènic en malalties hematològiques ajudarà a identificar el seu paper més actiu com a adjuvants immunes al tractament convencional. Tot i els grans grans progressos en aquest camp , es coneix poc de les proteïnes homòlogues butyrophilin-like (BTNL). La família butyrophilin (BTN) comparteix homologia estructural amb membres de la família B7 i similars a les proteïnes B7. Gairebé tots els BTNS / BTNLs estudiats fins al moment han demostrat ser capaços d'esmorteir la resposta immune mitjançant la co-estimulació negativa en l’activació del les cèl•lules T, fent-les candidates importants en la immunitat antitumoral. Per tant, en aquest estudi, caracteritzem un clúster que conté tres gens BTNL, situats al cromosoma humà 5q35.3, a nivell genòmic, transcripcional i funcional per obtenir una visió més clara en la funció de les proteïnes BTNL. En el primer capítol, presentem la identificació d’una deleció d’una variant en nombre de còpia (CNV en anglès) de 56 kb donant com a producte un nou gen quimèric (BTNL8*3). Aquesta deleció és responsable de la sobre-expressió del tercer gen del clúster, BTNL9. Posteriorment, es desenvolupà un assaig de genotipació i es va dur a terme un anàlisi poblacional d’aquesta variant en mostres de diferents poblacions pertanyents al HapMap i el panell de diversitat humana (HGDP-CEPH). Aquest assaig de genotipació ens va permetre identificar clares diferències en l’estratificació de l’aŀlel BTNL8_BTNL3-del entre grups continentals majors. A més, presentem tagging SNPs en diverses poblacions, facilitant una genotipació futura de la variant de deleció BTNL8-BTNL3. Finalment mostrem la influència de la deleció CNV en els nivells d’expressió de diferents gens involucrats en càncer i en la resposta immune, suggerint la involucració d’aquesta CNV en rutes biològiques específiques. En el segon capítol d’aquesta tesi s’investiguen les conseqüències funcionals de la CNV trobant una sobre-expressió de BTNL9 en leucèmia limfoblàstica aguda (ALL en anglès) després del subministrament de glucocorticoides (GC). S’havia mostrat ja prèviament que uns nivells elevats de BTNL9 correlacionen amb un elevat risc en pacients de ALL amb reorganització de MLL-AF4. Per comprovar si aquesta observació és deguda a la implicació de BTNL9 en apoptosi induïda per GC, es varen analitzar diferents línies ceŀlulars pre-B ALL trobant-se una clara correlació entre els nivells d’expressió de BTNL9 i resistència a GC en ALL amb reorganització de MLL i nivells més baixos en MLL en ALL germinal. Aquests resultats suggereixen un paper completament nou i inesperat de la proteïna BTNL que podrien resultar en el desenvolupament de inhibidors específics de BTNL9 per millorar la prognosi de ALL amb reorganització de MLL. En resum, en aquesta tesi proporcionem un anàlisi del clúster de gens humà BTNL. Identifiquem un nou gen de fusió BTNL8*3 amb implicacions potencials en rutes genètiques involucrades en la regulació i proliferació immune i mostrem una clara funció de BTNL9 en la resistència a GC el la leucèmia amb reorganització de MLL. Aquestes observacions proporcionen un nou coneixement sobre la família de gens BTNL i podria proporcionar la base per noves teràpies basades en BTNL9 en ALL amb reorganització de MLL. / In this thesis, we undertook a broad genomic, evolutionary, transcriptomic and functional analysis of a cluster containing three BTNL genes, namely BTNL8, BTNL3 and BTNL9, located on human chromosome 5q35.3. In the first chapter we report the identification of a 56 kb deletion copy number variant (CNV), which results in the formation of a novel chimeric gene, BTNL8*3, and leads to an upregulation in the expression-level of the third gene in the cluster, BTNL9. Next, we developed a genotyping assay and undertook a population analysis of this variant in several Hap Map and human diversity panel (HGDP-CEPH) populations. With this genotyping assay we could identify clear differences in the stratification of the BTNL8_BTNL3-del allele amongst major continental ethnic groups. In addition we report tagging SNPs in several population, facilitating the genotyping process of the BTNL8-BTNL3 deletion variant in the future. Moreover, we show an influence of the deletion CNV in the expression-level of several genes involved in cancer and immune response, suggesting an involvement of this CNV in specific biological pathways. In the second chapter we look for functional consequences of this CNV and found an upregulation of BTNL9 in acute lymphoblastic leukemia (ALL) after glucocorticoid (GC) treatment. Previously, it was shown that high-level BTNL9 correlates with high-risk in MLL-AF4 rearranged acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. To check whether this might be due to in involvement of BTNL9 in GC-induced apoptosis, we analyzed several pre-B ALL cell-lines and found a clear correlation between BTNL9 expression-level and resistance to GC in MLL rearranged ALL and at a lower level in MLL germ-line ALL. These results suggest a completely new and unexpected role for a BTNL protein and may led to the development of specific BTNL9 inhibitors to improve outcome of MLL rearranged ALL. Overall, we provide a comprehensive analysis of a BTNL gene cluster. We identified a new BTNL8*3 fusion-gene with potential implication in genetic pathways involved in immune regulation and proliferation, and show a clear function for BTNL9 in GC-resistance in MLL rearranged leukemia. This knowledge sheds more light on the BTNL family and may provide the basis for novel approaches using BTNL9 in MLL rearranged ALL therapy.

Patterns of human genetic diversity suggest that all modern humans originated from a small population in Africa that expanded rapidly 50,000 years ago to occupy the whole world. While moving into new environments, genetic drift and natural selection affected populations differently, creating genetic structure. By understanding the genetic structure of human populations, we can reconstruct human history and understand the genetic basis of diseases. The work presented here contributes to the ongoing effort to catalogue human genetic diversity by exploring populations that have been underrepresented in genetic studies. We use variations on the genomes of populations from Central Asia, the Near East, and North Africa to reconstruct the history of these populations. We find that climate change and geography appear to be major factors shaping genetic diversity. In addition, we identify recent cultural developments and historical events that have influenced admixture and gene flow between populations, leading to the genetic diversity observed in humans today. / Els patrons de diversitat genètica humana suggereixen que els humans van sorgir d’un petit grup a l’Àfrica que es va expandir ràpidament fa uns 50,000 anys per tot el planeta. En migrar cap a nous hàbitats, la deriva genètica i la selecció natural van afectar de manera diferencial les poblacions, generant una estructura genètica. Mitjançant la comprensió de l’estructura genètica de les poblacions podem reconstruir la història humana i entendre la base genètica de les malalties. Aquest treball contribueix a l’esforç continu de catalogar la diversitat genètica humana explorant poblacions poc representades en altres estudis genètics. Hem utilitzat variacions al llarg del genoma de poblacions d’Àsia Central, Orient Mitjà i el Nord d’Àfrica per tal de reconstruir la seva història. Hem observat que canvis climàtics i geogràfics semblen ser els factors principals que han modelat la diversitat genètica. A més, hem identificat esdeveniments culturals i històrics recents que afavorit les barreges i el flux genètic entre poblacions, generant la diversitat genètica observada avui en dia.

Los perros de raza Shar Pei tienen dos características fenotípicas propias de la raza que son las arrugas de la piel (ahora conocido como Hialuronosis Cutánea Hereditaria-HCH) y un desorden genético llamado Fiebre Familiar del Shar Pei (FSF) que se cree que es causada por un exceso de Ácido Hialurónico (HA). El origen genético se describe como una mutación reguladora (Variación Número de Copias- CNV) localizada upstream del gen que sintetiza HA (HAS2) en el cromosoma 13. Se construyó un modelo murino transgénico con mayor número de copias del HAS2 para emular y confirmar el fenotipo descrito en Shar Peis. Obtuvimos de manera exitosa 5 ratones transgénicos fundadores los cuales sirvieron para formar la colonia. Un total de 80 ratones de la F2 fueron incluidos en el estudio; 40 transgénicos (TG) (20 adultos y 20 jóvenes) y 40 tipo salvaje utilizados como control (20 adultos y 20 jóvenes). El análisis del fenotipo in vivo incluyó la inspección visual de posibles alteraciones en la piel (laxitud, pliegues, arrugas) y temperatura corporal (sistema basado implantación de microchip). Se determinó el número de copias (CN) utilizando el método de cuantificación relativa (2-ΔΔCt) con una RT-qPCR. El análisis post mortem incluyó hemograma completo, análisis de expresión de HAS2 en piel [utilizando el HAS2 murino endógeno como referencia y el HAS2constructo (transgen) como diana], histología de órganos parenquimatosos y piel además de la determinación de concentración de HA en suero sanguíneo. Después que se determinó el CN, los ratones TG fueron divididos en tres grupos: i) bajo CN: <20 copias, ii) medio CN: 21-69 copias y iii) alto CN: >70 copias. Aunque de manera exitosa conseguimos crear un ratón transgénico que expresaba HAS2, sobre producía HA y que en algunos aspectos semejaba el fenotipo de los Shar Peis, no pudimos emular la piel arrugada característica del Shar Pei ni tuvimos ratones con episodios febriles. Con todos estos resultados, es difícil sustentar el hecho de que el fenotipo de las arrugas de la piel del Shar Pei y el desorden febril sean consecuencia única de un aumento en la síntesis de HA. Los resultados obtenidos de los ratones transgénicos generados en esta tesis corroboran que quedan muchas preguntas respecto a las bases genéticas de HCH y FSF por contestar y que diferentes enfoques para averiguar el porqué de estas enfermedades son necesarios. Es por esta razón que analizamos otras vías de degradación de HA como la función del HAS2as, un gen que regula la expresión de HAS2, además de los Toll Like Receptors 2 y 4, sin encontrar cambios significativos. También reanalizamos datos de chip de Illumina, CanineSNP20 BeadChip (22.362 SNPs) para buscar regiones de homocigosis involucradas en el fenotipo del Shar Peis. Encontramos dos regiones de homocigosis en los CFA6 6 (40, 691, 228-51, 293, 708 CanFam2.0) y CFA 13 (23, 222, 643-27, 079, 420 CanFam2.0). Nuestros resultados indican un haplotipo específico característico de los Perros Shar Peis en el CFA6 el cual incluye dos genes (TNFR1 y MEFV) relacionados con la Fiebre Familiar Mediterránea en humanos y un CNV. Creemos que es importante considerar otras regiones en el genoma como la región del CFA6, la cual alberga muchos genes candidatos, para continuar indagando sobre las bases genéticas de estas enfermedades además de finalmente intentar confirmar si la HCH y la FSF están relacionados al compartir el mismo fondo genético o si son dos entidades distintas. / Shar Pei dogs have a breed defined wrinkled skin phenotype (now known as Hereditary Cutaneous Hyaluronosis-HCH) and a genetic disorder called Familial Shar Pei fever (FSF) which is thought to be caused by an excess in Hyaluronic Acid (HA). The genetic origin is described as a regulatory mutation (Copy number variation) located upstream of the HA synthesizing gene (HAS2) in chromosome 13. A transgenic mouse model with increased copies of HAS2 was constructed to emulate and confirm the phenotype described in Shar Peis. We successfully obtained 5 transgenic founder mice from which the colony was formed. A total of 80 F2 mice were included in the study: 40 Transgenic (TG) (20 adult and 20 young) and 40 wild type (WT) used as controls (20 adult and 20 young). Phenotype in vivo analysis included visual inspection of possible skin alterations (laxity, folds, wrinkles) and body temperature (microchip implant system). Copy number (CN) determination was performed using the comparative cycle threshold (CT) relative quantification method (2-ΔΔCt) with RT-qPCR. Post mortem analysis included complete blood count, skin HAS2 expression [using the endogenous HAS2 gene as a reference gene and HAS2 construction (transgene) as target], histology of parenchymal organs and skin and the determination of serum HA concentration. After CN determination, TG mice were divided into three groups: i) low CN: <20 copies, ii) medium CN; 21-69 copies and iii) High CN: >70 copies. Even though we successfully created a transgenic mouse which expressed HAS2, over produced HA and that in some aspects resembled the phenotype of Shar Pei dogs, we couldn’t emulate the Shar Peis characteristic wrinkled skin, nor did we have mice with febrile episodes. With all these results, it is difficult to sustain that the wrinkled skin phenotype and febrile disorder of the Shar Pei are only consequence of an increased synthesis of HA. Results of the transgenic mice generated in this thesis corroborate that many questions regarding the genetic basis of HCH and FSF remained to be answered and different approaches to insight on these diseases had to be used. Therefore we analyzed other HA degradation pathways such as HAS2as, gene which regulates HAS2 expression as well as HA degradation product routes (Toll Like Receptors 2 and 4) without any significant findings. We also reanalyzed data from the Illumina CanineSNP20 BeadChip (22.362 SNPs) to look for other regions involved in Shar Peis phenotypes. We have found two homozygosity regions in Shar Peis CFA 6 (40,691,228-51,293,708; CanFam2.0) and CF 13 (23,222,643-27,079,420; CanFam2.0). Our results denote a specific haplotype characteristic to Shar Pei dogs in CFA6 which includes 2 genes (TNFR1 and MEFV) related to Familiar Mediterranean Fever in humans and a CNV. We believe that it is important to consider other genomic regions such as that in CFA 6 which harbors many candidate genes to further inquire into the genetic background of these diseases as well as to finally confirm if HCH and FSF are related sharing a common genetic background or if they are two separate entities.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / Chromatin compaction is regulated by different factors, among them histone posttranslational modifications. There are different histone modifications, and among them, acetylation and methylation of lysine residues. Acetylation levels are regulated by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs), enzymes that catalyze addition and removal, respectively, of acetyl groups from histone lysine residues. Among the four classes of HDACs, the class III which correspond to the members of the Sir2 family or Sirtuins are quite unique. They participate in the response to a wide variety of stress stimuli through their requirement of NAD+ as a cofactor in their enzymatic activity. Mammals harbor seven Sirtuins (SirT1-SirT7). Among them, SirT6 is a nuclear protein involved in both genomic stability and metabolic homeostasis. Interestingly, SirT6 regulates the majority of these processes through an effect on chromatin, based on deacetylation of a histone mark, H3K9ac. However, the mechanism involved has not been fully characterized. In this work, we aim to study the consequences of SirT6 function in chromatin organization. We show that SirT6 overexpression induces gene silencing, which fits with the role of SirT6 as a repressor, shown by previous reports. Our studies show that SirT6 interacts with proteins or multi-protein complexes also involved in gene silencing, such as components of NuRD complex, or the HMTs EZH2, Suv39h1. However, we have focused the project in understanding the functional relationship between SirT6 and a H3K9-specific methyltransferases that we have identified as Suv39h1 and G9a. Suv39h1 trimethylates H3K9 and is essential in the establishment and maintenance of pericentromeric and telomeric constitutive heterochromatin. Interestingly, Suv39h1 was previously found to interact with SirT1 in the context of constitutive and facultative heterochromatin formation. Our work shows that the functional relationship between Suv39h1 and SirT6 is quite different from the already described between SirT1 and Suv39h1. SirT6 mediates a non canonical monoubiquitination in Suv39h1 in three conserved cysteines of the pre-SET domain. We have also identified SKP2 as the E3 ubiquitin ligase responsible of this monoubiquitination. SKP2 has a well-known role in promoting poliubiquitination and degradation of protein involved in G1/S checkpoint such as p21 and p27 and its levels are regulated during cell cycle progression. Our data show that SKP2 levels are also regulated by SirT6 through deacetylation, which in turn induce a double phosphorylation that prevents its degradation. Suv39h1 monoubiquitination is induced by double thymidine block and nocodazole treatments that arrest cells in G1/S phase and early mitosis, respectively. Furthermore, Suv39h1 monoubiquitination is induced by NF-kB pathway activation such as TNFa treatment, the overexpression of the NF-kB transcription factor RelA, or of the activator IKKa. Moreover, the promoter of the NF-kB global repressor, IkBa, is regulated by the interplay between Suv39h1, SKP2 and SirT6. Thus, upon activation of the pathway by TNFa treatment, SirT6 induces the Suv39h1 monoubiquitination through SKP2 activation and monoubiquitinated Suv39h1 is removed from the promoter allowing the transcription activation of IkBa by RelA. This novel model provides not only new insights in the regulation of NFkB pathway but also unveils new roles for SirT6, SKP2 and Suv39h1. / La compactación de la cromatina es regulada por diferentes factores entre los cuales destacan las modificaciones post-traduccionales de las histonas. Hay diferentes modificaciones de histonas entre ellas las desacetilationes y las metilaciones. Los niveles de acetilación están regulados por las histonas acetiltransferasas (HATs) y las histonas deacetilasas (HDACs), proteínas que añaden o quitan grupos acetil a las lisinas de las histonas, respectivamente. Los miembros de la familia Sir2 o de las sirtuínas constituyen la clase III de las HDACs y participan en respuesta a muchas formas de estrés. Entre ellas, está SirT6 que desacetila H3K9 acetilado para promover silenciamiento. En este proyecto mostramos que la sobreexpresión de SirT6 produce silenciamiento génico tal y como se había descrito previamente. Además, SirT6 interacciona con proteínas involucradas en silenciamiento génico como es el complejo NuRD y EZH2 y la metiltransferases de H3K9, G9a y Suv39h1. Suv39h1 trimetila H3K9 necesario para la estructura de la heterocromatina. Está caracterizada la interacción entre Suv39h1 y SirT1 en el contexto de formación de la formación de heterocromatina. La relación entre Suv39h1 y SirT6 es bastante diferente a la de Suv39h1 y SirT1. SirT6 media una monoubiquitinación no canónica en tres cisteínas conservadas del dominio pre-SET de Suv39h1. Entre las E3 ubiquitina ligasas que interaccionan con Suv39h1 y SirT6 como CHIP y CHFR, encontramos que la responsable de la monoubiquitinación de Suv39h1 es SKP2. Mostramos que los niveles de SKP2 están regulados también por SirT6 la cual desacetila SKP2 e induce su fosforilación evitando así su degradación. La monoubiquitinación de Suv39h1 es inducida con tratamiento de doble bloqueo y timidina, que paran las células en G1/S y mitosis temprana, respectivamente. Además, la activación de la vía de NFkB induce la monoubiquitinación de Suv39h1. La expresión del regulador negativo de la vía de NFkB, IkBa, está regulada por la interacción entre Suv39h1, SirT6 y SKP2 y bajo tratamiento con TNFa. SirT6 induce la monoubiquitinación de Suv39h1 a través de SKP2 y Suv39h1 monoubiquitinizado es desplazado del promotor permitiendo la activación de la transcripción de IkBa por RelA. Este modelo proporciona nuevas perspectivas de la regulación de la vía NFkB.