Tübingen, Univ., Diss., 2007.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2008

Universiẗat, Diss., 2008--Giessen.

Zugl.: Dresden, Techn. Universiẗat, Habil.-Schr., 2007.

Würzburg, Univ., Diss., 2004.

Ph.d.

Malaria is one of the most prevalent diseases in Africa and the Plasmodium falciparum species is widely accepted as the most virulent, with a fatality rate of 15 – 20 % of reported cases of infection. While various treatments have been accepted into early stage clinical trials there has been little progress towards a proven vaccine. Pending a long term solution, endemic countries rely heavily on the development of innovative drugs with acute efficacy coupled with rapids mode of action. Until recently the rate of drug action has been measured by light microscopic examination of parasite morphology using blood slides of drug treated parasite cultures at regular time intervals. This technique is tedious and, most importantly, subject to interpretation with regards to distinguishing between viable and comprised parasite cells, thus making it impossible to objectively quantitate the rate of drug action. This study aimed to develop a series of bioassays using the calcein-acetoxymethyl and propidium iodide vitality probes which would allow the rate of drug action on Plasmodium falciparum malaria parasites to be assessed and ranked in relation to each other. A novel bioassay using these fluorescent vitality probes coupled with fluorescence microscopy was developed and optimized and allowed the rate of drug action on malaria parasites to be assessed i) rapidly (in relation to current assay techniques) and ii) in a semi-quantitative manner. Extrapolation to flow cytometry for improved quantification provided favourable rankings of drug killing rates in the pilot study, however, requires further development to increase throughput and approach the ultimate goal of producing a medium-throughput assay for rapidly assessing the rate of action of antimalarial drugs. Attempts to adapt the assay for use in a multiwell plate reader, as well as using ATP measurements as an indication of parasite vitality after drug treatment, was met with erratic results. The viability probes assay as it stands represents an improvement on other assay formats in terms of rapidity and quantification of live/compromised parasites in cultures.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:55:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia do Sul (MEST) / Governo da província de Gyeonggi da Coreia do Sul / Instituto Coreano de Informação Científica e Tecnológica (KISTI) / Crescentes evidências mostram que a organização espacial da transcrição é um fator epigenético importante na regulação gênica em eucariotos. Em células de mamíferos, os genes são transcritos em estruturas nucleares discretas conhecidas como fábricas de transcrição, e genes com funções relacionadas e co-regulados compartilham as mesmas fábricas de transcrição. Plasmodium falciparum apresenta um padrão de expressão gênica bastante complexo durante o ciclo eritrocítico, contrastando paradoxalmente com o baixo número de putativos fatores de transcrição codificados pelo seu genoma. Por outro lado, mecanismos epigenéticos são importantes na regulação gênica neste parasita. Nesta tese, investigamos a organização da transcrição em P. falciparum visando determinar se a organização nuclear está relacionada com a expressão/regulação gênica ao longo do desenvolvimento do parasita. Com este objetivo, marcamos transcritos nascentes com BrUTP em formas eritrocíticas de P. falciparum. Assim como em mamíferos, a transcrição no parasita também está organizada em focos nucleoplásmicos discretos, chamados fábricas de transcrição. Análises automatizadas de imagens em 3D mostram que o número e a intensidade das fábricas de transcrição variam durante o ciclo eritrocítico, estando correlacionados com o número de genes expressos em cada estágio, mas não com o volume nuclear. O baixo número de fábricas indica que os genes ativos compartilham as fábricas enquanto estão sendo transcritos. Surpreendentemente, as fábricas são espacilamente redistribuídas durante o desenvolvimento de anéis para trofozoítas, com a periferia nuclear sendo a zona de transcrição favorita nos anéis, enquanto nos trofozoítas as fábricas estão igualmente distribuídas por todo o nucleoplasma. Também observamos que a transcrição por RNA polimerase I ocorre principalmente nas áreas centrais dos núcleos em trofozoítas, sugerindo que os componentes nucleolares podem ser dispersos devido à entrada na fase S. Assim como nos eucariotos superiores, as fábricas de transcrição em P. falciparum também se localizam em áreas nucleares com baixa densidade de cromatina. Análises de imunofluorescência combinando incorporação de BrUTP com marcadores nucleares mostram que as fábricas de transcrição formam um compartimento exclusivo, diferente do compartimento de silenciamento definido por PfSir2A ou do compartimento de cromatina ativa definido por H4ac ou H3K79me3. Para estudar a organização espacial da cromatina e entender como os genes co-regulados interagem com as fábricas de transcrição, decidimos realizar ensaios de hibridização fluorescente in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH). Durante a realização de ensaios de FISH seguindo protocolos publicados, observamos uma grande variação na morfologia nuclear dos parasitas, o que nos moveu a otimizar esta técnica. Utilizando análises automatizadas de imagens, mostramos que os parasitas desidratados por secagem ao ar e fixados por curtos períodos de tempo à temperatura ambiente apresentam uma variação intra-populacional maior em relação à forma e ao volume nucleares após o ensaio de FISH, assim como valores de volume quase duas vezes maiores, do que núcleos de parasitas fixados em suspensão por longos períodos de tempo e em baixas temperaturas. Também observamos que a fixação em suspensão leva a uma melhor conservação da estrutura nuclear, e índices de colocalização mais altos para duas sondas de repetições adjacentes das extremidades cromossômicas, Rep20 e telômeros. Em resumo, nossos resultados mostram que o tipo de protocolo de fixação utilizado antes da realização do desenvolvimento de FISH é um fator crucial para a conservação apropriada da arquitetura nuclear. / Growing evidence points that transcription spatial organization is an important epigenetic factor for eukaryotes gene regulation. In mammalian cells, genes are transcribed in discrete nuclear structures known as transcription factories, and developmentally co-regulated, functionally related genes have been shown to share factories. Plasmodium falciparum shows a remarkably complex pattern of gene expression during the erythrocytic cycle, paradoxically contrasting with the low number of putative transcription factors encoded by its genome. However, epigenetic mechanisms are important for gene regulation in this parasite. In this thesis, we investigated transcription organization of P. falciparum in order to determine if nuclear architecture is related with developmentally regulated gene expression. To this aim, we have labeled nascent transcrips with BrUTP in P. falciparum erythrocytic forms. Transcription in organized in discrete nuceloplasmic foci, the transcription factories. Automated 3D analysis of confocal images shows the number and intensity of transcription factories change during the erythrocytic cycle, correlating with the number of genes expressed at each stage but not with the nuclear volume. The low number of factories indicates that active genes share factories while being transcribed. Unexpectedly, factories spatially redistribute from ring to trophozoites, being the nuclear periphery the preferential transcription zone in rings while in trophozoites factories are equally distributed throughout the nucleoplasm. We also observed that RNApolymerase I transcription occurs mostly at central nuclear areas in trophozoites, suggesting that nucleolar components may be dispersed upon S phase transition. Like in higher eukaryotes, in P. falciparum transcription factories occur on nuclear areas with low chromatin density. Immunofluorescence analysis of P. falciparum nuclear markers combined with BrUTP incorporation show that transcription factories are a novel and exclusive nuclear compartment, different from the silent compartment defined by PfSir2A or the active chromatin compartment defined by H4ac and H3K79me3. In order to study the spatial organization of chromatin, and how co-regulated, functionally related genes interact with transcription factories, we decided to perform fluorescence in situ hybridization (FISH). While performing FISH with published protocols, we observed great variation in the parasite nuclear morphology, prompting us to optimize this technique. Using automated image analysis, we show that parasites dehydrated by air-drying and fixed for short periods at room temperature present after FISH higher intra-population variation of nuclear shape and volume, as well as almost two-times higher relative volume values, than parasite nuclei fixed in suspension for long periods at low temperatures. We also observe that longer fixation in suspension leads to improved conservation of the nuclear structure, with chromosome end clusters preferentially locating at the nuclear periphery, and higher colocalization indexes for two adjacent chromosome end probes, Rep20 and telomere. Overall, our results show that the type of fixation protocol applied prior to FISH is crucial for the conservation of nuclear architecture. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T00:45:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Daiana Perce.pdf: 3555490 bytes, checksum: 2638dddd9374d377120b0e33dfb8169b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T00:45:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Daiana Perce.pdf: 3555490 bytes, checksum: 2638dddd9374d377120b0e33dfb8169b (MD5) Previous issue date: 2011-04-19 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O Antígeno de Ligação ao Eritrócito de 175kDa (EBA-175) é o ligante preferencial do P. falciparum no processo de penetração em eritrócitos sendo considerado, portanto, um importante antígeno candidato à vacina, O EBA-175 apresenta duas regiões bem caracterizadas: a região II - conservada, imunogênica e com 2 segmentos ricos em cisteína (F1 e F2) que estão envolvidos na ligação do parasito à glicoforina-A da superfície dos eritrócitos e, a região III – apresentando fragmentos C (cepa CAMP) e F (cepa FCR3), que são mutuamente exclusivos, que definem as famílias alélicas do EBA-175. Estudos realizados em áreas hiperendêmicas de malária na África mostraram uma forte associação entre a forma clínica da doença e o dimorfismo da região III do EBA-175. As diferenças observadas entre áreas endêmicas em relação aos parasitos circulantes são fatores importantes em termos de estratégias de desenvolvimento de uma vacina visto que sua eficácia pode variar em diferentes cenários epidemiológicos. Neste estudo avaliou-se a diversidade genética das regiões II e III do EBA-175 apresentada pelos isolados naturais de P. falciparum provenientes de Porto Velho (RO), área de transmissão instável como são as áreas brasileiras, associando-a as variáveis de morbidade e exposição à malaria. Os isolados, obtidos ao longo de 13 anos, foram divididos em grupos de acordo com o ano da coleta: PV94/1994 (n= 101), PV02/2002 (n= 57) e PV07/2007 (n=30). Após a extração do DNA o polimorfismo genético foi analisado por PCR e seqüenciamento. Observamos na região II apenas um tipo de fragmento, com 926 pb. Na região III, observamos o clássico dimorfismo com uma freqüência maior do fragmento-C (84.3%). A infecção mista foi observada em 1,6% dos isolados. O fragmento-C foi amplificado em maior freqüência nos isolados das três coletas realizadas. Não observamos diferenças nas frequências dos fragmentos C e F entre os 3 grupos estudados. A análise do seqüenciamento da região II revelou 5 alterações nucleotídicas em 3 dos 15 isolados. Essas alterações levaram a 2 trocas de aminoácidos. A análise do seqüenciamento da região III evidenciou: no fragmento-C, 8 trocas de nucleotídeos em 3 das 45 amostras. Essas alterações levaram a 7 mudanças de aminoácidos; no fragmento-F, 2 alterações nucleotídicas foram reveladas em 2 das 11 amostras. Estas alterações levaram a 4 trocas de aminoácidos. Esses dados sugerem que não há diferenças significantes nas porções gênicas que codificam as regiões II e III do EBA-175 entre os isolados de P. falciparum circulantes em Porto Velho. Além disso, observamos que a frequência do dimorfismo alélico do EBA-175 é temporalmente estável e ausência de associação entre o polimorfismo encontrado e as variáveis de morbidade e exposição à malária. / P. falciparum Erythrocyte Binding Antigen 175 (EBA-175) plays a central role in erythrocytes invasion being considered, therefore, a target for malaria vaccine development.This antigen present to well characterized regions: the region II - conserved and immunogenic, that contains two cysteine-rich segments (F1 and F2), which are involved in binding to glycophorin-A on the surface of erythrocytes and, the region III – that contains mutually exclusive C (strain CAMP) and F (strain FCR3) fragments, which defines the two allelic families of EBA-175. Several studies performed in high endemicity malaria area in Africa have shown the influence of this dimorphism on clinical disease and outcome. The differences observed between different endemic areas in relation to exposed individuals and the circulating parasites are important factors in terms of vaccine strategies since the efficacy of a potential vaccine may vary in different epidemiological scenarios. The goal of this study was to evaluate the genetic diversity of regions II and III of EBA-175 in P. falciparum isolates from Porto Velho (RO), a region of malaria unstable transmission, and the influence of this diversity on malaria morbidity and exposure variables. The blood samples were collected in three time points between 1994, 2002 and 2007 (PV94 group, n=101; PV02 group, n=57; PV07 group, n=30, respectively). The genetic polymorphism was analyzed by PCR and sequencing. We observed in the region II only one type of fragment with 926 bp. In the region III we observed the classic dimorphism with a higher frequency of the C-fragment (84.3%). The mixed infection was observed in 1.6% of isolates. There were no differences in the frequency of fragments C and F among the 3 groups. Sequencing of region II revealed 5 nucleotide changes in 3 of 15 isolates, leading to 2 amino acids replacements. Sequencing of region III revealed that: in the C-fragment there were 8 nucleotide changes in 3 of 45 samples, leading to 7 amino acids replacements; in the fragment-F there were 2 nucleotide changes , in 2 of 11 samples, leading to 2 amino acids replacements. Our results showed: reduced genetic diversity in P. falciparum EBA-175 isolates circulating in Porto Velho; predominance of C-fragment and temporal stability of allelic dimorphism of the EBA-175. Moreover, no association was observed between the EBA-175 dimorphism and malaria morbidity and exposure variables.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T15:55:54Z No. of bitstreams: 1 Isaclaudia Gomes de Azevedo.pdf: 1665691 bytes, checksum: ee1af0ea03f6788f85de4a97da24c983 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T15:55:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isaclaudia Gomes de Azevedo.pdf: 1665691 bytes, checksum: ee1af0ea03f6788f85de4a97da24c983 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A malária é uma doença parasitária causada pelo protozoário do gênero Plasmodium e é um grande problema de saúde pública. Por volta de 40% da população mundial está em área de risco de malária. A malária cerebral é a principal complicação, mas o edema pulmonar e a injúria pulmonar (ARDS) podem ser desencadeadas pela infecção com P. falciparum, P. vivax e P. knowlesi, e ocorrem frequentemente durante ou após o início do tratamento antimalárico. Os mecanismos moleculares e celulares de indução de injúria pulmonar, como da malária cerebral permanecem indefinidos. Previamente, nós encontramos que a deleção genética da integrina CD11d/CD18, que é expressa em leucócitos mieloides, desencadeia uma maior sobrevida no animais infectados com Plasmodium berghei Anka (PbA), que é uma modelo de malária grave. Tal resultado sugere que a molécula CD11d/CD18 tenha um papel determinante na imunopatogênese da malária. Perguntamos se CD11d/CD18 determina eventos fisiopatológicos na ARDS desencadeadas por infecção PbA. Realizamos análises da expressão da subunidade CD11d e de parâmetros inflamatórios, como da permeabilidade da barreira vascular por exclusão do corante azul de Evans, e citocinas por ELISA. Proteínas e leucócitos foram mensurados no lavado broncoalveolar (LAB). A migração celular foi medida pela contagem de células ao microscópio e por citometria de fluxo. Também foi avaliada a expressão do ligante de CD11d, VCAM-1 e a função respiratória dos animais. A Análise da expressão do mRNA da subunidade CD11d sugere um acúmulo de leucócitos e/ou que a expressão da subunidade CD11d é aumentada em macrófagos pulmonares e/ou em outras células mieloides pulmonares após a infecção. Nós também observamos um acumulo de leucócitos, hemácias e fluido nos pulmões de CD11d+/+ mice. A inflamação e a hemorragia foram menos intensas nos pulmões dos animais CD11d-/-. Em paralelo, a integridade da barreira vascular foi prejudicada nos animais CD11d+/+, enquanto os animais CD11d-/- tinham menor extravazamento de azul de Evans no tecido pulmonar e níveis mais baixos de proteína no LAB em comparação com CD11d+/+, apesar de o número total de leucócitos no LBA ter sido semelhante. Observamos níveis mais baixos de citocinas inflamatórias que estavam associadas com a malária experimental e clínica, em amostras de animais CD11d-/- quando comparados com os animais CD11d+/+. A maior parte dos leucócitos dos camundongos CD11d-/- ficavam retidos na medula óssea e também havia menos células CD14+ no sangue periférico, quando comparado com os camundongos CD11d+/+. Os nossos resultados demonstram que a ausência da subunidade CD11d não interfere na expressão de VCAM-I e acarreta uma melhor função respiratória após a infecção. Podemos observar que a integrina CD11d/CD18 influência nos principais eventos fisiopatológicos na ARDS desencadeada pela malária experimental, incluindo ruptura da barreira vascular pulmonar, inflamação e hemorragia. / Malaria is a parasitic disease caused by protozoa of the genus Plasmodium and is a major public health problem. 40% or more of the global population is at risk for malaria. Cerebral malaria is the most feared complication, but pulmonary edema and lung injury (ARDS) are also triggered by the infection with Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, and Plasmodium knowlesi, and often occur during or after the begin of anti-malarial therapy. The molecular and cellular mechanisms of pulmonary injury, like those of CM, remain incompletely defined. Previously, we found that genetic deletion of integrin CD11d/CD18, which is expressed on myeloid leukocytes, improves survival in mice infected with P. berghei Anka (PbA), a model of severe malarial infection. Thus, CD11d/CD18 may be a critical determinant in injurious innate immune responses to malarial parasites. We asked if CD11d/CD18 is involved in pathophysiologic events in ARDS triggered by PbA infection. We measured CD11d subunit expression, vascular barrier function by Evans blue dye (EBD) exclusion, and cytokines by ELISA. Protein and leukocytes were measured in bronchoalveolar lavage (BAL) samples. Cell migration was measured by microscope counting and flow cytometry. We also analyzed the expression of the ligand to CD11d, VCAM-1, and respiratory function of animals. Analysis of CD11d mRNA suggested that CD11d subunit expressing leukocytes accumulate and/or that CD11d subunit expression is increased in lung macrophages or other pulmonary myeloid cells early after infection. We showed a dramatic accumulation of leukocytes, red blood cells, and fluid in the lungs of CD11d+/+ mice. Inflammation and hemorrhage were reduced in the lungs of CD11d-/- animals. In parallel, vascular barrier integrity was impaired in CD11d+/+ animals; once CD11d-/- animals had less accumulation of EBD in extravascular lung tissue and lower levels of BAL protein compared to CD11d+/+, although the total number of BAL leukocytes was similar. Compared to CD11d+/+, there were lower levels of inflammatory cytokines that are associated with experimental and clinical malaria in samples from CD11d-/- mice. Most of the leukocytes in CD11d-/- mice are retained in the bone marrow and also there is less CD14+ in the peripheral blood when compared to CD11d+/+ mice. Our findings demonstrate that the absence of CD11d integrin does not interfere in VCAM-I expression and correlates with a better respiratory function in infected CD11d-/- when compared to CD11d+/+ mice. We observed that CD11d/CD18 influences key pathophysiologic events in ARDS in experimental malaria, including pulmonary vascular barrier disruption, inflammation, and hemorrhage.