Orientador: Alexandre Amstalden Moraes Sampaio / Banca: Atushi Sugohara / Banca: Rymer Ramiz Tullio / Resumo: O ensaio foi conduzido na FCAV/ Unesp, utilizando 16 bovinos machos não castrados da raça Canchim, com peso médio inicial de 315 kg. Os animais foram alojados em baias individuais onde receberam os seguintes tratamentos: SF - concentrado farelado com farelo de soja; SE - concentrado extrusado com farelo de soja; AF - concentrado farelado com farelo de algodão; AE - concentrado extrusado com farelo de algodão. Como volumoso ofereceu-se a silagem de milho numa relação volumoso:concentrado de 50:50 com base na matéria seca. O período experimental foi de 112 dias. Os resultados foram avaliados num delineamento inteiramente casualizado, segundo esquema fatorial 2 x 2 (fontes protéicas x tratamentos físicos). As médias de ganho de peso, ganho em área de olho de lombo e ganho em espessura de gordura de cobertura, para os tratamentos SF, SE, AF e AE foram 1,64; 1,46; 1,35 e 1,35 kg; 20,24; 18,72; 22,88 e 16,21 cm2; 0,67; 0,58; 0,50 e 0,93 mm respectivamente, não apresentando diferença (P>0,05) entre qualquer um dos tratamentos. Na avaliação da conversão alimentar e eficiência protéica a análise estatística detectou diferença apenas entre fontes protéicas (P<0,05) com médias de conversão alimentar de 4,73 e 5,31 kg MS/kg PC e eficiência protéica de 1,78 e 1,59 kg PC/kg PB, respectivamente para os tratamentos com farelo de soja e farelo de algodão. As médias de balanço de nutrientes para MS, FDN e FDA para os tratamentos SF, SE, AF e AE foram 66,2; 66,7; 64,4 e 64,7%; 47,4; 43,3; 45,8 e 38,47% e 51,3; 45,2; 49,0 e 40,0% respectivamente, não apresentando diferença (P>0,05) entre os tratamentos ...(Resumo completo, clicar no acesso eletrônico abaixo) / Abstract: - The present work was carried out in Beef Cattle Setor of FCA V/Unesp, being used 16 males bovines non castrated of the Canchim crossbreed with initial average body weight of 315 kg. The animais were housed in individual stalls where they received the following treatments: GS - grounded concentrate with soybean meal; ES - extruded concentrate with soybean meal; GC - grounded concentrate with cottonseed meal; EC - extruded concentrated with cottonseed meal. The exclusive houghage offered was the com silage in a relationship of 50:50 in the dry matter basis. The experimental period was 112 days, sub-divided in four sub-periods of 28 days, which it was evaluated the variations of the body weight, loin eye area and the backfat. For the data statistical treatment, the arrangement used was the total randomized design, in a factorial scheme 2 x 2 (two protein sources x two physical treatments), being the averages compared by the Tukey test. The averages of daily weight gain, loin eye area and backfat gains, for the treatments GS, ES, GC and EC were 1.64, 1.46, 1.35 and 1.35 kg; 20.24, 18.72, 22.88 and 16.21 cm2; 0.67, 0.58, 0.50 and 0.93 mm respectively, not presenting difference (P>0,05) among the treatments. In the evaluation of the feed conversion the statistical analysis detected differences among protein sources (P<0,05) with averages of 4.73 and 5.31 kg DM/kg BW respectively for the treatments with soybean meal and cottonseed meal. The averages of DMB, NDFB and ADFB for the treatments GS, ES, GC and EC were 66.16, 66.66, 64.43 and 64.72%; 47.36, 43.30, 45.81 and 38.47% and 51.30, 45.24, 49.03 and 39.98% respectively, not presenting difference (P>0,05) among treatments ... (Complete abstract, click eletronic address below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-03-03Bitstream added on 2014-06-13T18:40:15Z : No. of bitstreams: 1 ribeiro_gm_me_jabo.pdf: 848451 bytes, checksum: 7e0a8600342eb2f0539ebbb975c83975 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O ensaio foi conduzido na FCAV/ Unesp, utilizando 16 bovinos machos não castrados da raça Canchim, com peso médio inicial de 315 kg. Os animais foram alojados em baias individuais onde receberam os seguintes tratamentos: SF - concentrado farelado com farelo de soja; SE - concentrado extrusado com farelo de soja; AF - concentrado farelado com farelo de algodão; AE - concentrado extrusado com farelo de algodão. Como volumoso ofereceu-se a silagem de milho numa relação volumoso:concentrado de 50:50 com base na matéria seca. O período experimental foi de 112 dias. Os resultados foram avaliados num delineamento inteiramente casualizado, segundo esquema fatorial 2 x 2 (fontes protéicas x tratamentos físicos). As médias de ganho de peso, ganho em área de olho de lombo e ganho em espessura de gordura de cobertura, para os tratamentos SF, SE, AF e AE foram 1,64; 1,46; 1,35 e 1,35 kg; 20,24; 18,72; 22,88 e 16,21 cm2; 0,67; 0,58; 0,50 e 0,93 mm respectivamente, não apresentando diferença (P>0,05) entre qualquer um dos tratamentos. Na avaliação da conversão alimentar e eficiência protéica a análise estatística detectou diferença apenas entre fontes protéicas (P<0,05) com médias de conversão alimentar de 4,73 e 5,31 kg MS/kg PC e eficiência protéica de 1,78 e 1,59 kg PC/kg PB, respectivamente para os tratamentos com farelo de soja e farelo de algodão. As médias de balanço de nutrientes para MS, FDN e FDA para os tratamentos SF, SE, AF e AE foram 66,2; 66,7; 64,4 e 64,7%; 47,4; 43,3; 45,8 e 38,47% e 51,3; 45,2; 49,0 e 40,0% respectivamente, não apresentando diferença (P>0,05) entre os tratamentos... / The present work was carried out in Beef Cattle Setor of FCA V/Unesp, being used 16 males bovines non castrated of the Canchim crossbreed with initial average body weight of 315 kg. The animais were housed in individual stalls where they received the following treatments: GS - grounded concentrate with soybean meal; ES - extruded concentrate with soybean meal; GC - grounded concentrate with cottonseed meal; EC - extruded concentrated with cottonseed meal. The exclusive houghage offered was the com silage in a relationship of 50:50 in the dry matter basis. The experimental period was 112 days, sub-divided in four sub-periods of 28 days, which it was evaluated the variations of the body weight, loin eye area and the backfat. For the data statistical treatment, the arrangement used was the total randomized design, in a factorial scheme 2 x 2 (two protein sources x two physical treatments), being the averages compared by the Tukey test. The averages of daily weight gain, loin eye area and backfat gains, for the treatments GS, ES, GC and EC were 1.64, 1.46, 1.35 and 1.35 kg; 20.24, 18.72, 22.88 and 16.21 cm2; 0.67, 0.58, 0.50 and 0.93 mm respectively, not presenting difference (P>0,05) among the treatments. In the evaluation of the feed conversion the statistical analysis detected differences among protein sources (P<0,05) with averages of 4.73 and 5.31 kg DM/kg BW respectively for the treatments with soybean meal and cottonseed meal. The averages of DMB, NDFB and ADFB for the treatments GS, ES, GC and EC were 66.16, 66.66, 64.43 and 64.72%; 47.36, 43.30, 45.81 and 38.47% and 51.30, 45.24, 49.03 and 39.98% respectively, not presenting difference (P>0,05) among treatments ... (Complete abstract, click eletronic address below)

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal tem sido alvo de diversos estudos moleculares, principalmente através da introdução de plataformas de sequenciamento de nova geração, devido à sua importância e amplo relacionamento com o hospedeiro humano. Entretanto, o armazenamento de amostras fecais antes da extração do DNA é crítico ao caracterizar a composição da microbiota intestinal. Com base nesses dados, o presente estudo buscou compreender os efeitos de diferentes métodos de armazenamento de amostras fecais para caracterizar a microbiota intestinal através do sequenciamento da nova geração, bem como estabelecer um método alternativo de conservação do material genético bacteriano nessas amostras, utilizando guanidina. MÉTODO: Foram coletadas amostras de fezes de 10 voluntários saudáveis. Cada amostra foi dividida em cinco alíquotas, uma alíquota extraída imediatamente após a coleta (fresca) e duas alíquotas submetidas ao congelamento, à temperaturas de -20°C e -80°C e extraídas após 48 horas. As outras duas alíquotas restantes foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4°C e extraídas após 48 horas. Para observar a presença de alterações na microbiota intestinal, durante um período de armazenamento maior das amostras de fezes, três amostras foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4ºC e extraídas após o período de 60 dias. A região hipervariável v4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada por PCR. Os amplicons gerados foram sequenciados utilizando a plataforma Ion PGM Torrent e os dados analisados utilizando o software QIIME. A determinação da significância estatística foi realizada utilizando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos níveis taxonômicos (filo, classe, família, ordem e gênero) entre amostras frescas analisadas e os métodos de armazenamento testados. As análises de coordenadas principais (PCoA) mostraram que as amostras se agruparam de acordo com os indivíduos analisados, tendo as amostras referentes a cada indivíduo agrupado-se com maior proximidade do que com outras amostras do mesmo grupo de armazenamento. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que o congelamento e o uso de guanidina para armazenamento de amostras de fezes, para a caracterização da microbiota intestinal, podem efetivamente preservar o material genético bacteriano nessas amostras ao longo de um período de 48 horas para amostras submetidas ao congelamento e durante 60 dias para amostras armazenadas em guanidina / INTRODUCTION: The gut microbiota has been the target of several molecular studies, mainly through the introduction of next generation sequencing platforms, due to its importance and wide relationship with the human host. However, the storage of fecal samples prior to DNA extraction is critical when characterizing the composition of the intestinal microbiota. Based on these facts, the present study aimed to understand the effects of different methods of storage of fecal samples to characterize the intestinal microbiota by next generation sequence, as well as establishing an alternative conservation method of the bacterial genetic material in these samples using guanidine. METHODS: Stool samples from 10 healthy volunteers were collected. Each collected sample was divided into five aliquots, one aliquot extracted immediately after collection (fresh) and two aliquots subjected to freezing at -20°C and -80°C temperatures and extracted after 48 hours. The others two remaining aliquots were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 48 hours. In order to observe the presence of alterations in the intestinal microbiota, during a longer storage period of the stool samples, three samples were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 60 day period. The v4 hypervariable region of bacterial and archeal 16S rRNA gene were amplified by PCR. The generated amplicons were sequenced using Ion PGM Torrent platform and the data analyzed using the software QIIME. Determination of statistical significance was performed using non-parametric Kruskal-Wallis test. RESULTS: No significant differences were found in any of the taxonomic levels (phylum, class, family, order and genus) between analyzed fresh samples and the others different storage methods. The principal coordinates analysis (PCoA) unweighted showed that the samples clustered based on the host each sample originated from, rather than by storage group. CONCLUSION: Our data suggest that both freezing and the use of guanidine to store stool samples for gut microbiota characterization can effectively preserve the bacterial genetic material in these samples over a 48 hours period for samples subjected to freezing and for up to 60 days for samples stored in guanidine

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-04-18T19:51:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_DeteccaoHelicobacterPylori.pdf: 7320035 bytes, checksum: 4b8765acf104b324b57e96378a50b11e (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-04-19T12:14:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_DeteccaoHelicobacterPylori.pdf: 7320035 bytes, checksum: 4b8765acf104b324b57e96378a50b11e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-19T12:14:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_DeteccaoHelicobacterPylori.pdf: 7320035 bytes, checksum: 4b8765acf104b324b57e96378a50b11e (MD5) Previous issue date: 2007 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A infecção pela Helicobacter pylori é uma das mais comuns em humanos, admite-se que é adquirida na infância e que é uma das principais causas de gastrite e úlcera gástrica na vida adulta. Entre os vários métodos de diagnósticos da infecção pela H. pylori, a reação e cadeia da polimerase (PCR) tem mostrado alta sensibilidade para a detecção desta bactéria em amostras gástricas, orais fecais. Com o objetivo de padronizar a técnica de PCR para detectar a presença da H. pylori nas fezes e comparar com o método de diagnóstico sorológico, utilizou-se uma amostra de 79 crianças provenientes de um estudo soroepidemiológico realizado em Belém-Pará, no ano de 2003. O DNA total foi extraído das fezes através de um protocolo padronizado neste estudo baseado na associação dos métodos de fervura em resina quelante e digestão por proteinase, seguido por fenol-clorofórmio. Para a amplificação do DNA utilizou-se iniciadores para o gene 16S rRNA para o gênero Helicobacter e para detecção específica da H. pylori utilizou-se iniciadores para trecho do gene ureA. O fragmento foi visualizado em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio. A presença da H. pylori foi verificada em 69,62% (55/79) dos pacientes. A análise comparativa entre o ensaio sorológico e a PCR ureA, revelou que a técnica molecular apresenta um melhor desempenho no diagnóstico de H. pylori em fezes (p = 0,0246). A aplicação da técnica da PCR em amostras fecais de crianças, por ser um procedimento não invasivo e altamente eficiente pode ser utilizada para detecção da infecção pela H. pylori tanto na rotina laboratorial como em pesquisas de interesse epidemiológico. / The infection for the Helicobacter pylori is one of the most common in humans, it is admitted that is acquired in the childhood and that it is one of the main gastritis causes and peptic ulcer in the adult life. Among the several diagnosis methods for the H. pylori infection, the Polimerase Chain Reaction (PCR) has been showing high sensibility for the detection of this pathogen in gastric, oral and faecal samples. With the objective of standardizing the PCR technique to detect the presence of H. pylori of in stool samples and to compare this method with sorologic diagnosis, we studied a samples of 79 children coming of a seroprevalence study realized in the city Belém-Pará in 2003. The genomic DNA was extracted of the feces through a protocol standardized in this research based on the association of quelator agents and proteinase digestion, followed by a phenol-chloroform procedure. For the DNA amplification it was used primers for the gene 16SrRNA specific for Helicobacter genus and for specific detection of the H. pylori it was used primers for desigend for ureA gene. The visualization of the fragments was performed agarose 2% gels stained with ethidium bromide. The presence of the H. pylori was verified in 69,62% (55/79) of the patients. The comparative analysis between the serologic research and the ureA PCR revealed that the molecular technique presents a better acting in the diagnosis of H. pylori in feces (p = 0,0246). The application of the technique of PCR in children's fecal samples, for being a non invasive highly efficient procedure, can be used for detection of the infection by H. pylori in the laboratorial routine as well as in researches of epidemiologic interest.

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal tem sido alvo de diversos estudos moleculares, principalmente através da introdução de plataformas de sequenciamento de nova geração, devido à sua importância e amplo relacionamento com o hospedeiro humano. Entretanto, o armazenamento de amostras fecais antes da extração do DNA é crítico ao caracterizar a composição da microbiota intestinal. Com base nesses dados, o presente estudo buscou compreender os efeitos de diferentes métodos de armazenamento de amostras fecais para caracterizar a microbiota intestinal através do sequenciamento da nova geração, bem como estabelecer um método alternativo de conservação do material genético bacteriano nessas amostras, utilizando guanidina. MÉTODO: Foram coletadas amostras de fezes de 10 voluntários saudáveis. Cada amostra foi dividida em cinco alíquotas, uma alíquota extraída imediatamente após a coleta (fresca) e duas alíquotas submetidas ao congelamento, à temperaturas de -20°C e -80°C e extraídas após 48 horas. As outras duas alíquotas restantes foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4°C e extraídas após 48 horas. Para observar a presença de alterações na microbiota intestinal, durante um período de armazenamento maior das amostras de fezes, três amostras foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4ºC e extraídas após o período de 60 dias. A região hipervariável v4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada por PCR. Os amplicons gerados foram sequenciados utilizando a plataforma Ion PGM Torrent e os dados analisados utilizando o software QIIME. A determinação da significância estatística foi realizada utilizando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos níveis taxonômicos (filo, classe, família, ordem e gênero) entre amostras frescas analisadas e os métodos de armazenamento testados. As análises de coordenadas principais (PCoA) mostraram que as amostras se agruparam de acordo com os indivíduos analisados, tendo as amostras referentes a cada indivíduo agrupado-se com maior proximidade do que com outras amostras do mesmo grupo de armazenamento. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que o congelamento e o uso de guanidina para armazenamento de amostras de fezes, para a caracterização da microbiota intestinal, podem efetivamente preservar o material genético bacteriano nessas amostras ao longo de um período de 48 horas para amostras submetidas ao congelamento e durante 60 dias para amostras armazenadas em guanidina / INTRODUCTION: The gut microbiota has been the target of several molecular studies, mainly through the introduction of next generation sequencing platforms, due to its importance and wide relationship with the human host. However, the storage of fecal samples prior to DNA extraction is critical when characterizing the composition of the intestinal microbiota. Based on these facts, the present study aimed to understand the effects of different methods of storage of fecal samples to characterize the intestinal microbiota by next generation sequence, as well as establishing an alternative conservation method of the bacterial genetic material in these samples using guanidine. METHODS: Stool samples from 10 healthy volunteers were collected. Each collected sample was divided into five aliquots, one aliquot extracted immediately after collection (fresh) and two aliquots subjected to freezing at -20°C and -80°C temperatures and extracted after 48 hours. The others two remaining aliquots were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 48 hours. In order to observe the presence of alterations in the intestinal microbiota, during a longer storage period of the stool samples, three samples were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 60 day period. The v4 hypervariable region of bacterial and archeal 16S rRNA gene were amplified by PCR. The generated amplicons were sequenced using Ion PGM Torrent platform and the data analyzed using the software QIIME. Determination of statistical significance was performed using non-parametric Kruskal-Wallis test. RESULTS: No significant differences were found in any of the taxonomic levels (phylum, class, family, order and genus) between analyzed fresh samples and the others different storage methods. The principal coordinates analysis (PCoA) unweighted showed that the samples clustered based on the host each sample originated from, rather than by storage group. CONCLUSION: Our data suggest that both freezing and the use of guanidine to store stool samples for gut microbiota characterization can effectively preserve the bacterial genetic material in these samples over a 48 hours period for samples subjected to freezing and for up to 60 days for samples stored in guanidine

Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de Salmonella. Os propósitos do estudo foram avaliar a viabilidade de emprego do QIAamp® DNA Stool Mini Kit para extração e purificação de DNA de Salmonella; validar ensaios baseados em PCR-tempo real (PCR-RT) para quantificar o DNA de Salmonella empregando ttr ou tuf e desenvolver um ensaio para quantificar Salmonella baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT). Para avaliação do QIAamp® DNA Stool Mini Kit empregaram-se fezes coletadas diretamente do reto de animais infectados ou não, sendo estas últimas artificialmente contaminadas e submetidas à extração segundo protocolo do fabricante. As amostras de DNA isoladas foram quantificadas empregando um ensaio Salmonella-específico PCR-RT utilizando como alvo o lócus ttr. O mesmo ensaio foi utilizado para células de Salmonella provenientes de meio de cultura. O ensaio PCR-RT baseado no alvo tuf foi validado empregando-se primeiramente cepas de diferentes sorotipos de Salmonella e de outras Enterobacteriaceae. A seguir sua eficiência foi avaliada para alimentos-modelo (ave e suíno) artificialmente contaminadas com elevada (&#8776; 6 log UFC/mL) e baixa (&#8776; 2 log UFC/mL) população de Salmonella Typhimurium DT 104. A validação do método quantitativo de Salmonella por RT-PCR-RT foi realizada primeiramente com células em meio de cultura e posteriormente nos mesmos alimentos-modelo utilizados para PCR-RT. Em ambos os métodos, alíquotas dos alimentos-modelo foram mantidas a 20 ºC e a 8 ºC, sendo examinadas em diferentes tempos pós-inoculação. Como controle empregou-se a enumeração de microrganismos mesófilos totais e de Salmonella por técnicas convencionais. A taxa de recuperação de Salmonella em fezes suínas artificialmente inoculadas, após tratamento com QIAamp® DNA Stool Kit, variou entre 25% a 50%, dependendo da quantidade inicial de células. Empregando o DNA extraído e submetendo-o à PCR-RT para o ttr obteve-se limite de detecção de 2,8 log UFC eq/g de fezes; método que foi menos sensível que o convencional. A quantificação de Salmonella por PCR-RT empregando tuf apresentou limite de detecção menor que 1 log UFC eq. Os resultados obtidos com este método, empregando-se células em meio de cultura ou alimentos-modelo, foram, de maneira geral, ligeiramente inferiores aos do método convencional. A eficiência de amplificação para PCR-RT e tuf foi de 94%. O método RT-PCR-RT apresentou limite de detecção semelhante ao obtido com o ttr (2 log UFC eq) e sua eficiência de amplificação foi de 100%. Observou-se que tuf é expresso na fase logarítmica de multiplicação bacteriana, o que o torna um bom indicador da viabilidade de Salmonella. / In order to get fast and trustworthy results that allow monitoring the microbiological food safety either by industries or governmental agencies, diverse alternative methods have been developed for Salmonella detection and quantification. The purposes of this study were to evaluate the viability of the use of QIAamp® DNA Stool Mini Kit for Salmonella DNA extraction and purification; to validate assays based on real time-PCR (PCR-RT) to quantify Salmonella DNA by using ttr or tuf, and to develop an assay to quantify Salmonella based on reverse transcriptase- PCR-real time (RT-PCR-RT). For QIAamp® DNA Stool Mini Kit evaluation feces taken directly from the rectum of infected or health animals were used, with the former being artificially contaminated. Samples were submitted to DNA extraction, according to manufacturers protocol. The isolated DNA were quantified using a Salmonella-specific PCR-RT targeting the ttr locus. The same assay was used for Salmonella cells originated from culture medium. The PCR-RT assay with tuf as target was first validated employing different Salmonella serovars and other Enterobacteriaceae strains. After, its efficiency was evaluated on food-models (chicken and swine) spiked with high (&#8776; 6 log CFU/mL) and low (&#8776; 2 log CFU/mL) Salmonella Typhimurium DT 104 populations. The validation of the quantitative RT-PCR-RT method was first conducted with cells grown in culture medium, and then in the same food-model used for PCR-RT. For both methods aliquots of foodmodels were maintained at 20 ºC and 8 ºC being evaluated at different incubation times. Enumeration of total mesophilic microorganisms and Salmonella based on conventional methods were used as controls. The DNA recovery rate in swine feces artificially inoculated, after QIAamp® DNA Stool Mini Kit treatment, was between 25% to 50% depending the initial amount of cells. Using the extracted DNA and submitting it to PCR-RT for ttr a detection level of 2,8 CFU eq/g of feces was obtained. This method showed lower sensitivity than the conventional. Salmonella quantification by PCR-RT employing tuf showed a detection level lower than 1 log CFU eq. The results obtained with this method and cells suspended in culture medium or in food-model systems were, in general slightly lower that those obtained with the conventional method. The efficiency of amplification for PCR-RT tuf was 94%. Detection limit of RT-PCR-RT was similar to that of ttr (2 log CFU eq) and efficiency of amplification was 100%. tuf was expressed in logarithmic phase of bacteria growth curve showing that it is a good viability indicator for Salmonella.

Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de Salmonella. Os propósitos do estudo foram avaliar a viabilidade de emprego do QIAamp® DNA Stool Mini Kit para extração e purificação de DNA de Salmonella; validar ensaios baseados em PCR-tempo real (PCR-RT) para quantificar o DNA de Salmonella empregando ttr ou tuf e desenvolver um ensaio para quantificar Salmonella baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT). Para avaliação do QIAamp® DNA Stool Mini Kit empregaram-se fezes coletadas diretamente do reto de animais infectados ou não, sendo estas últimas artificialmente contaminadas e submetidas à extração segundo protocolo do fabricante. As amostras de DNA isoladas foram quantificadas empregando um ensaio Salmonella-específico PCR-RT utilizando como alvo o lócus ttr. O mesmo ensaio foi utilizado para células de Salmonella provenientes de meio de cultura. O ensaio PCR-RT baseado no alvo tuf foi validado empregando-se primeiramente cepas de diferentes sorotipos de Salmonella e de outras Enterobacteriaceae. A seguir sua eficiência foi avaliada para alimentos-modelo (ave e suíno) artificialmente contaminadas com elevada (&#8776; 6 log UFC/mL) e baixa (&#8776; 2 log UFC/mL) população de Salmonella Typhimurium DT 104. A validação do método quantitativo de Salmonella por RT-PCR-RT foi realizada primeiramente com células em meio de cultura e posteriormente nos mesmos alimentos-modelo utilizados para PCR-RT. Em ambos os métodos, alíquotas dos alimentos-modelo foram mantidas a 20 ºC e a 8 ºC, sendo examinadas em diferentes tempos pós-inoculação. Como controle empregou-se a enumeração de microrganismos mesófilos totais e de Salmonella por técnicas convencionais. A taxa de recuperação de Salmonella em fezes suínas artificialmente inoculadas, após tratamento com QIAamp® DNA Stool Kit, variou entre 25% a 50%, dependendo da quantidade inicial de células. Empregando o DNA extraído e submetendo-o à PCR-RT para o ttr obteve-se limite de detecção de 2,8 log UFC eq/g de fezes; método que foi menos sensível que o convencional. A quantificação de Salmonella por PCR-RT empregando tuf apresentou limite de detecção menor que 1 log UFC eq. Os resultados obtidos com este método, empregando-se células em meio de cultura ou alimentos-modelo, foram, de maneira geral, ligeiramente inferiores aos do método convencional. A eficiência de amplificação para PCR-RT e tuf foi de 94%. O método RT-PCR-RT apresentou limite de detecção semelhante ao obtido com o ttr (2 log UFC eq) e sua eficiência de amplificação foi de 100%. Observou-se que tuf é expresso na fase logarítmica de multiplicação bacteriana, o que o torna um bom indicador da viabilidade de Salmonella. / In order to get fast and trustworthy results that allow monitoring the microbiological food safety either by industries or governmental agencies, diverse alternative methods have been developed for Salmonella detection and quantification. The purposes of this study were to evaluate the viability of the use of QIAamp® DNA Stool Mini Kit for Salmonella DNA extraction and purification; to validate assays based on real time-PCR (PCR-RT) to quantify Salmonella DNA by using ttr or tuf, and to develop an assay to quantify Salmonella based on reverse transcriptase- PCR-real time (RT-PCR-RT). For QIAamp® DNA Stool Mini Kit evaluation feces taken directly from the rectum of infected or health animals were used, with the former being artificially contaminated. Samples were submitted to DNA extraction, according to manufacturers protocol. The isolated DNA were quantified using a Salmonella-specific PCR-RT targeting the ttr locus. The same assay was used for Salmonella cells originated from culture medium. The PCR-RT assay with tuf as target was first validated employing different Salmonella serovars and other Enterobacteriaceae strains. After, its efficiency was evaluated on food-models (chicken and swine) spiked with high (&#8776; 6 log CFU/mL) and low (&#8776; 2 log CFU/mL) Salmonella Typhimurium DT 104 populations. The validation of the quantitative RT-PCR-RT method was first conducted with cells grown in culture medium, and then in the same food-model used for PCR-RT. For both methods aliquots of foodmodels were maintained at 20 ºC and 8 ºC being evaluated at different incubation times. Enumeration of total mesophilic microorganisms and Salmonella based on conventional methods were used as controls. The DNA recovery rate in swine feces artificially inoculated, after QIAamp® DNA Stool Mini Kit treatment, was between 25% to 50% depending the initial amount of cells. Using the extracted DNA and submitting it to PCR-RT for ttr a detection level of 2,8 CFU eq/g of feces was obtained. This method showed lower sensitivity than the conventional. Salmonella quantification by PCR-RT employing tuf showed a detection level lower than 1 log CFU eq. The results obtained with this method and cells suspended in culture medium or in food-model systems were, in general slightly lower that those obtained with the conventional method. The efficiency of amplification for PCR-RT tuf was 94%. Detection limit of RT-PCR-RT was similar to that of ttr (2 log CFU eq) and efficiency of amplification was 100%. tuf was expressed in logarithmic phase of bacteria growth curve showing that it is a good viability indicator for Salmonella.