L’apoptose, ou mort cellulaire programmée, joue un rôle majeur au cours du développement embryonnaire et dans le maintien de l’homéostasie tissulaire chez l’adulte. La voie mitochondriale de l’apoptose est principalement activée par la protéine oncosuppressive p53. Le FGF1 est un facteur de croissance atypique, majoritairement intracellulaire et nucléaire qui induit la prolifération, la différenciation et la survie cellulaires. Dans les cellules PC12, le FGF1 présente des activités neurotrophique et anti-apoptotique vis-à-vis de l’apoptose dépendante de p53. De plus, il interagit avec la protéine p53. La localisation nucléaire du FGF1 semble nécessaire à ses activités intracellulaires ainsi qu’à son interaction avec p53.Au cours de ma thèse, j’ai étudié les activités neurotrophique et anti-apoptotique de différentes formes mutantes du FGF1. J’ai entrepris l’étude de l’activité intracellulaire de la forme FGF1K132E, forme mutante dont les activités extracellulaires sont inhibées. La mutation du résidu lysine 132 pourrait modifier la phosphorylation du résidu sérine 130 du FGF1, j’ai donc également étudié deux autres formes mutantes : le FGF1S130A, dont la phosphorylation est inhibée et le FGF1S130D dont la phosphorylation est mimée. Les résidus mutés (K132 et S130) sont situés dans le domaine C-terminal du FGF1.Cette étude nous a permis de montrer que la phosphorylation du FGF1 inhibe son activité anti-apoptotique mais ne modifie pas son activité neurotrophique, et que le domaine C-terminal du FGF1 est fortement impliqué dans la régulation de ses activités intracellulaires. Toutes ces formes mutantes sont capables d’être transloquées dans le noyau ce qui suggère que la localisation nucléaire du FGF1 soit nécessaire mais insuffisante pour ses activités intracellulaires. Par ailleurs, p53 peut interagir avec le FGF1WT et certaines formes mutantes, toutefois cette interaction n’est pas strictement corrélée à l’activité anti-apoptotique du FGF1, ce qui suggère l’existence d’autres régulations nucléaires qui restent à caractériser.Mes travaux ont permis pour la première fois de mettre en évidence le rôle de la phosphorylation du FGF1 et de son domaine C-terminal dans la régulation de ses activités intracellulaires. La poursuite de cette étude permettra de mieux caractériser le rôle nucléaire de ce facteur de croissance et de caractériser ses éventuelles interactions avec des protéines nucléaires comme p53 / Apoptosis, a form of programmed cell death, is required for embryonic development and tissue homeostasis. The mitochondrial pathway of apoptosis is mainly induced by p53, an oncosuppressor that acts as a transcription factor. FGF1 is one of the two prototypic members of the FGF family. Contrarily to most FGFs, FGF1 lacks a secretion peptide signal and acts mainly in an intracellular and nuclear manner. Intracellular FGF1 induces cell proliferation, differentiation and survival. In PC12 cells, FGF1 inhibits p53-induced apoptosis and interacts with p53. FGF1 nuclear localization seems to be required for its intracellular activities and its interaction with p53.To better characterize the FGF1 intracellular pathway, we studied neurotrophic and anti-apoptotic activities of several mutant forms of FGF1: the FGF1K132E that could affect FGF1 phosphorylation, and two phosphorylation-site mutant forms, i.e. the FGF1S130A (preventing phosphorylation) and the FGF1S130D (mimicking phosphorylation). All these mutations are localized in the C-terminal domain of FGF1. This study showed that phosphorylation inhibits FGF1 anti-apoptotic activity but not its neurotrophic activity in PC12 cells and that the FGF1 C-terminal domain is strongly involved in the regulation of its intracellular activities. Despite their different activities, all mutant forms are localized both in the cytosol and the nucleus. Therefore, nuclear localization is required but insufficient for FGF1 to display its intracellular activities.Besides, p53 can interact with wild-type and some of the mutant forms of FGF1. This interaction does not strictly correlate with FGF1 anti-apoptotic activity. Thus, the nuclear mechanisms regulating FGF1 intracellular activities remain to be characterized.Our study highlights for the first time the role of the phosphorylation and the C-terminal domain of FGF1 on the regulation of its intracellular activities. This work must continue on to further characterize FGF1 nuclear activities and its interactions with nuclear proteins such as p53

Le cancer ovarien comprend un groupe hétérogène de tumeurs pouvant affecter les cellules épithéliales, stromales ou germinales. Le traitement de ces tumeurs constitue un défi majeur car un taux important de patientes présentent une rechute suite à un traitement chimiothérapeutique. Il est donc important de comprendre les mécanismes de résistance à la chimiothérapie de ces tumeurs.Le facteur de croissance des fibroblastes 1 (FGF1) a été retrouvé surexprimé dans de nombreuses tumeurs dont les tumeurs ovariennes épithéliales de haut grade. Les études antérieures du laboratoire ont montré que le FGF1 exerce une activité anti-apoptotique via la modulation de la stabilité et des activités transcriptionnelles de p53. Le but de mon travail était donc de savoir si la surexpression du FGF1 était suffisante pour favoriser une résistance vis-à-vis de l’apoptose induite par des agents chimiothérapeutiques dans les tumeurs ovariennes et si le FGF1 pourrait réguler les activités de la protéine p53.À cet effet, nous avons utilisé trois lignées ovariennes ; la lignée de la granulosa ovarienne COV434, la lignée épithéliale A2780 et la lignée épithéliale résistante au cisplatine A2780cis qui surexprime le FGF1. L’invalidation du gène FGF1 par la technique CRISPR/Cas9 n’a pas permis de restaurer la sensibilité à la chimiothérapie dans les cellules A2780cis. D’autre part, nous avons montré que la surexpression du FGF1 confère une résistance à l’apoptose dans la lignée COV434, mais pas dans la lignée épithéliale A2780. Les mécanismes moléculaires de cette activité anti-apoptotique sont différents de ceux identifiés dans d’autres lignées. En effet, dans la lignée COV434 la surexpression du FGF1 a peu d’impact sur la stabilité de p53 et ne diminue pas son activité transcriptionnelle. De plus, nous montrons que la translocation mitochondriale de p53 joue un rôle important dans l’induction de l’apoptose par l’étoposide dans la lignée COV434. De plus, nous avons montré que, dans la lignée COV434, l’activité anti-apoptotique du FGF1 est exercée par une atténuation de la localisation mitochondriale de p53. Nos données préliminaires suggèrent la présence du FGF1 à la mitochondrie. En conclusion, l’ensemble de nos expériences permet de proposer un nouveau mode d’action pour le FGF1 qui n’a jamais été décrit auparavant. / Ovarian cancer is an heterogenous group of tumors, able to affect epithelial, stromal or germ cells. The treatment of these tumors is a major challenge as a high rate of relapse is observed in ovarian cancer patients following chemotherapy.Fibrobast growth factor 1 (FGF1) is overexpressed in numerous tumors such as high grade ovarian epithelial tumors. Previous work realized in our laboratory showed that FGF1 has an anti-apoptotic activity which is mediated by the regulation of p53 stability and transcriptional activities. The aim of my work was to understand whether FGF1 overexpression is sufficient to induce resistance to chemotherapy-induced apoptosis in ovarian tumors and if FGF1 could modulate the activities of p53 protein.For this purpose, we used three ovarian cell lines; the COV434 ovarian granulosa cell line, the ovarian epithelial A2780 cell line and its counterpart A2780cis cell line which is resistant to ciplatin and overexpresses FGF1.FGF1 knock out experiments in A2780cis cell line, using the CRISPR/Cas9 system, did not show any restoration of the sensibility of these cells to cisplatin. Moreover, we showed that FGF1 overexpression in COV434 cell line renders these cells resistant to apoptosis while no effect was observed in A2780 cells. The molecular mechanisms underlying this anti-apoptotic activity differed from those identified in other cell lines previously. Indeed, in COV434 cell line, FGF1 overexpression has only a small impact on p53 stability and it does not reduce its transcriptional activity. Furthermore, we show here that p53 mitochondrial translocation plays an important role in the induction of apoptosis by etoposide in COV434 cells. Moreover, we provide evidence that FGF1 anti-apoptotic activity in COV434 cells relies upon the attenuation of p53 mitochondrial localization. Our preliminary results suggest that FGF1 could be found at the mitochondria. In conclusion, our findings let us propose a novel mode of action for FGF1 which has never been described previously.

The cell cycle is negatively regulated by members of the pocket protein family, which consists of the tumor suppressor pRB and two closely related paralogs, p107 and p130. In their hypophosphorylated state, they are associated with E2F transcription factors which result in the repression of transcription of E2F-dependent genes that are required for cell cycle progression. The phosphorylation state of pocket proteins during the cell cycle is determined at least in part by an equilibrium between inducible CDKs and the serine/threonine protein phosphatase PP2A. Protein Phosphatase 2A (PP2A), is a serine/threonine phosphatase that functions as as a collection of trimeric holoenzymes. The trimeric PP2A holoenzyme is composed of the "A" scaffolding subunit, the "C" catalytic subunit, and a "B" regulatory subunit. The B subunit is the major determinant in substrate specificity and subcellular localization. Two holoenzymes consisting of the core PP2A dimer and either the B55α or PR70 regulatory subunits have been implicated in the activation of p107/p130 and pRB, respectively. While the phosphorylation state of p107 is very sensitive to forced changes of B55α levels in human cell lines, regulation of p107 in response to physiological modulation of PP2A/B55α has not been previously elucidated. In this thesis, I show that FGF1, which induces maturation and cell cycle exit in chondrocytes, triggers rapid accumulation of p107/PP2A/B55α complexes coinciding with p107 dephosphorylation without an increase in B55α protein expression in RCS cells. Reciprocal solution-based mass-spectrometry analysis identified the PP2A/B55α complex as a major component of a subset of p107 complexes, which also contain E2F/DPs, DREAM subunits and cyclin/CDK complexes. p107 is one of the major partners of B55α, which also associates with pRB in RCS cells. FGF1 induces dephosphorylation of p107, its translocation to the nucleus, remodeling of p107 complexes, and enhances its interaction with E2F4 and other p107 partners. Consistent with an essential role of B55α in the rapid activation of p107 in chondrocytes, limited ectopic expression of B55α results in marked dephosphorylation of p107, while B55α knockdown results in hyperphosphorylation. More importantly, limited knockdown of B55α dramatically delays FGF1 induced dephosphorylation of p107. Moreover, dephosphorylation of p107 in response to FGF1 treatment results in selective recruitment of p107 to regulated genes including CMYC. Our results suggest a model where FGF1 mediates rapid dephosphorylation and activation of p107 independently of the CDK activities that maintain p130 and pRB hyperphosphorylated for several hours post p107 dephosphorylation in maturing chondrocytes. Additionally, we provide preliminary evidence that PPP2R2A may act as a haploinsufficient tumor suppressor in prostate cancer cell lines. PPP2R2A is hemizygously deleted in various prostate cancer cell lines and tumor samples. We identified three cell lines that express less B55α the gene product of PPP2R2A, than cell lines that are reported to have both alleles intact. Furthermore, ectopic expression of B55α in PC3 cells results in a phenotype reminiscent of senescence, ultimately leading to cell death. These cells are unable to form colonies in soft agar and have increased DNA content and euploidy. Combined with their larger cell and nuclear size, this suggests that ectopic expression of B55α in PC3 cells results in endoreplication. Altogether these suggest that reduced B55α expression in these cells confers a growth advantage in PCa cell lines, which is extinguished when B55α is reintroduced, supporting the notion that hemizygous deletion of PPP2R2A in prostate tumors may help promote tumorigenesis. / Molecular Biology and Genetics

Le FGF1 est un facteur de croissancenon sécrété, localisé dans le cytosol et le noyau.Il induit la prolifération, la différenciation et lasurvie cellulaires. Il est également impliqué dansla progression tumorale et peut conférer unechimiorésistance aux tumeurs qui lesurexpriment.Notre équipe s’intéresse depuis plusieursannées aux activités intracrines du FGF1 en tantque régulateur de la différenciation et de lasurvie cellulaires. L’équipe a ainsi montré que leFGF1 intracellulaire a une activité antiapoptotiquedans plusieurs modèles cellulaires :cellules REtsAF (fibroblastes de rat), PC12(phéochromocytome de rat), SH-SY5Y(neuroblastome humain) suite à l’induction del’apoptose dépendante de p53 via un stressgénotoxique. Dans les cellules PC12, un modèled’étude de la différenciation neuronale, le FGF1possède également une activité neurotrophique.À l’aide de différentes formes mutantes duFGF1, nous avons cherché à mieux caractériserles mécanismes régulant son activité antiapoptotiquedans les cellules PC12 et SH-SY5Y,ainsi que son activité neurotrophique dans lescellules PC12. Nous avons pu montrer que ledomaine C-terminal du FGF1 ainsi que sesmodifications post-traductionnelles sontimportants pour la régulation de ses activitésintracellulaires ; et que la phosphorylation duFGF1 inhibe son activité anti-apoptotique dansles cellules PC12 et SH-SY5Y mais ne régule passon activité de différenciation dans les cellulesPC12.Nos résultats montrent donc pour lapremière fois le rôle de la phosphorylation dansla régulation des activités du FGF1 et ce dansdeux modèles cellulaires de rat et humain. / .FGF1 is a non-secreted cytosolic andnuclear growth factor, inducing cell proliferation,differentiation and survival. FGF1 is also involvedin tumor progression and can inducechemoresistance in FGF1 overexpressing tumors.Our team has focused for several years onthe FGF1 intracrine neurotrophic and survivalactivities. The team has shown that intracellularFGF1 is an anti-apoptotic factor in several celllines : REtsAF (rat fibroblasts), PC12 (derivedfrom a rat pheochromocytoma) and SH-SY5Ycells (derived from a human neuroblastoma)following the induction of p53-dependentapoptosis via a genotoxic stress. In PC12 cells, amodel of neuronal differentiation, FGF1 is also aneurotrophic factor.We aimed to better characterize themechanisms regulating the anti-apoptoticactivity of FGF1 by expressing various mutantforms of FGF1 in PC12 and SH-SY5Y cell lines. Wehave shown that FGF1 C-terminal domain and itspost-translational modifications are importantfor the regulation of its intracellular activities ;and that FGF1 phosphorylation inhibits its antiapoptoticactivities in both PC12 and SH-SY5Ycell lines, but does not affect its differentiationactivity in PC12 cells.Thus, our results showed for the first time thecrucial role of FGF1 phosphorylation in theregulation of its intracrine anti-apoptotic activityin both rat and human cellular models.