Fitocistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas em plantas que atuam principalmente na inibição de papaínas. Entretanto, há uma demonstração in vitro de uma fitocistatina carboxi-estendida com capacidade de inibir também uma protease do tipo legumaína. Em arroz existem 12 genes de fitocistatinas, mas apenas um deles (OcXII), possui a extensão C-terminal. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho é compreender a diversidade e os mecanismos de interação entre as fitocistatinas e suas proteases cisteínicas alvo em arroz, com ênfase nas implicações funcionais da OcXII. Neste trabalho, nós demonstramos que, em arroz, os 12 genes de fitocistatinas têm um perfil de expressão gênica diferenciado na germinação e em respostas ambientais, sendo OcI, OcIII e OcXII os genes mais expressos. O peptídeo recombinante, correspondente à extremidade C-terminal da OcXII possui capacidade inibitória de legumaínas e não afeta a atividade das papaínas. Através do silenciamento transcricional da OcXII, via RNAi, foram obtidas plantas com atividades proteolíticas aumentadas tanto de papaínas quanto legumaínas, em adição a um fenótipo de crescimento inicial acelerado. O fenótipo oposto é observado em plântulas crescendo em condições alcalinas. Plantas expressando o promotor OcXII fusionado ao gene repórter gus demonstraram um perfil de ativação de OcXII durante a germinação, principalmente na região do escutelo das sementes. Esta ativação de OcXII permanece alta quando as sementes são mantidas com níveis elevados de ABA e sob estresse alcalino. Como alvos específicos de OcXII, as legumaínas estão relacionadas com a biossíntese de componentes vacuolares e degradação de proteínas de armazenamento. Em arroz, nós encontramos cinco diferentes loci para as legumaínas. Análises filogenéticas e estudos de expressão gênica demonstraram uma maior associação de OsaLeg2 e OsaLeg3 com tecidos de semente, e OsaLeg1, 4 e 5 com tecidos vegetativos. Também foram observadas formas de splicing alternativo, com potencial de originar diferentes isoformas ativas de legumaínas. Em geral, nossos dados demonstram o envolvimento bifuncional da OcXII nos processos de germinação e defesa interagindo e inibindo a atividade de proteases cisteínicas específicas, onde a região N-term de OcXII inibe papaínas, enquanto a C-term inibe legumaínas. / Phytocystatins are competitive inhibitors of cysteine proteases in plants, principally inhibiting papain-like proteases activity. However, there is one in vitro demonstration that a carboxy-extended phytocystatin can inhibit legumain-like proteases either. In rice there are 12 phytocystatins genes, but only one (OcXII) has the C-terminal extension. Thus, the aim of this study is to understand the diversity and interaction mechanisms among phytocystatins and its cysteine protease targets in rice, focusing on OcXII functional implications. In this work we demonstrated that in rice, the 12 phytocystatins genes have a different gene expression profile during the germination and environmental responses, while OcI OcIII and OcXII were the most expressed genes. A recombinant peptide corresponding to the different C-terminus of OcXII was produced and its inhibitory capacity was confirmed against legumains without affecting the activity of papains. OcXII transcriptional silencing, via RNAi, resulted in plants with increased proteolytic activity for both papain and legumains, in addition to an accelerated initial growth phenotype. The opposite phenotype is observed in seedlings growing under alkaline conditions. Plants expressing the OcXII promoter fused to gus reporter gene demonstrated an OcXII activation profile during germination, especially in the seed scutellum region. This OcXII activation remains high when the seeds are kept at high ABA levels or under alkaline conditions. As specific OcXII targets, legumains are related to the biosynthesis of vacuolar storage components and protein degradation. In rice, we found 5 different loci for legumains. Phylogenetic analyses and gene expression studies demonstrated a greater association of OsaLeg3 and OsaLeg2 with seed tissues, while OsaLeg1, 4 and 5 were more abundant in vegetative tissues. Also alternatively spliced forms were observed, with the potential to produce different isoforms of active legumains. Overall, our data demonstrate the involvement of the bifunctional OcXII in germination processes and defense, interacting and inhibiting the activity of specific cysteine proteases, where its N-term region inhibits papain, while the C-term inhibits legumains.

Fitocistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas em plantas que atuam principalmente na inibição de papaínas. Entretanto, há uma demonstração in vitro de uma fitocistatina carboxi-estendida com capacidade de inibir também uma protease do tipo legumaína. Em arroz existem 12 genes de fitocistatinas, mas apenas um deles (OcXII), possui a extensão C-terminal. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho é compreender a diversidade e os mecanismos de interação entre as fitocistatinas e suas proteases cisteínicas alvo em arroz, com ênfase nas implicações funcionais da OcXII. Neste trabalho, nós demonstramos que, em arroz, os 12 genes de fitocistatinas têm um perfil de expressão gênica diferenciado na germinação e em respostas ambientais, sendo OcI, OcIII e OcXII os genes mais expressos. O peptídeo recombinante, correspondente à extremidade C-terminal da OcXII possui capacidade inibitória de legumaínas e não afeta a atividade das papaínas. Através do silenciamento transcricional da OcXII, via RNAi, foram obtidas plantas com atividades proteolíticas aumentadas tanto de papaínas quanto legumaínas, em adição a um fenótipo de crescimento inicial acelerado. O fenótipo oposto é observado em plântulas crescendo em condições alcalinas. Plantas expressando o promotor OcXII fusionado ao gene repórter gus demonstraram um perfil de ativação de OcXII durante a germinação, principalmente na região do escutelo das sementes. Esta ativação de OcXII permanece alta quando as sementes são mantidas com níveis elevados de ABA e sob estresse alcalino. Como alvos específicos de OcXII, as legumaínas estão relacionadas com a biossíntese de componentes vacuolares e degradação de proteínas de armazenamento. Em arroz, nós encontramos cinco diferentes loci para as legumaínas. Análises filogenéticas e estudos de expressão gênica demonstraram uma maior associação de OsaLeg2 e OsaLeg3 com tecidos de semente, e OsaLeg1, 4 e 5 com tecidos vegetativos. Também foram observadas formas de splicing alternativo, com potencial de originar diferentes isoformas ativas de legumaínas. Em geral, nossos dados demonstram o envolvimento bifuncional da OcXII nos processos de germinação e defesa interagindo e inibindo a atividade de proteases cisteínicas específicas, onde a região N-term de OcXII inibe papaínas, enquanto a C-term inibe legumaínas. / Phytocystatins are competitive inhibitors of cysteine proteases in plants, principally inhibiting papain-like proteases activity. However, there is one in vitro demonstration that a carboxy-extended phytocystatin can inhibit legumain-like proteases either. In rice there are 12 phytocystatins genes, but only one (OcXII) has the C-terminal extension. Thus, the aim of this study is to understand the diversity and interaction mechanisms among phytocystatins and its cysteine protease targets in rice, focusing on OcXII functional implications. In this work we demonstrated that in rice, the 12 phytocystatins genes have a different gene expression profile during the germination and environmental responses, while OcI OcIII and OcXII were the most expressed genes. A recombinant peptide corresponding to the different C-terminus of OcXII was produced and its inhibitory capacity was confirmed against legumains without affecting the activity of papains. OcXII transcriptional silencing, via RNAi, resulted in plants with increased proteolytic activity for both papain and legumains, in addition to an accelerated initial growth phenotype. The opposite phenotype is observed in seedlings growing under alkaline conditions. Plants expressing the OcXII promoter fused to gus reporter gene demonstrated an OcXII activation profile during germination, especially in the seed scutellum region. This OcXII activation remains high when the seeds are kept at high ABA levels or under alkaline conditions. As specific OcXII targets, legumains are related to the biosynthesis of vacuolar storage components and protein degradation. In rice, we found 5 different loci for legumains. Phylogenetic analyses and gene expression studies demonstrated a greater association of OsaLeg3 and OsaLeg2 with seed tissues, while OsaLeg1, 4 and 5 were more abundant in vegetative tissues. Also alternatively spliced forms were observed, with the potential to produce different isoforms of active legumains. Overall, our data demonstrate the involvement of the bifunctional OcXII in germination processes and defense, interacting and inhibiting the activity of specific cysteine proteases, where its N-term region inhibits papain, while the C-term inhibits legumains.

Fitocistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas em plantas que atuam principalmente na inibição de papaínas. Entretanto, há uma demonstração in vitro de uma fitocistatina carboxi-estendida com capacidade de inibir também uma protease do tipo legumaína. Em arroz existem 12 genes de fitocistatinas, mas apenas um deles (OcXII), possui a extensão C-terminal. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho é compreender a diversidade e os mecanismos de interação entre as fitocistatinas e suas proteases cisteínicas alvo em arroz, com ênfase nas implicações funcionais da OcXII. Neste trabalho, nós demonstramos que, em arroz, os 12 genes de fitocistatinas têm um perfil de expressão gênica diferenciado na germinação e em respostas ambientais, sendo OcI, OcIII e OcXII os genes mais expressos. O peptídeo recombinante, correspondente à extremidade C-terminal da OcXII possui capacidade inibitória de legumaínas e não afeta a atividade das papaínas. Através do silenciamento transcricional da OcXII, via RNAi, foram obtidas plantas com atividades proteolíticas aumentadas tanto de papaínas quanto legumaínas, em adição a um fenótipo de crescimento inicial acelerado. O fenótipo oposto é observado em plântulas crescendo em condições alcalinas. Plantas expressando o promotor OcXII fusionado ao gene repórter gus demonstraram um perfil de ativação de OcXII durante a germinação, principalmente na região do escutelo das sementes. Esta ativação de OcXII permanece alta quando as sementes são mantidas com níveis elevados de ABA e sob estresse alcalino. Como alvos específicos de OcXII, as legumaínas estão relacionadas com a biossíntese de componentes vacuolares e degradação de proteínas de armazenamento. Em arroz, nós encontramos cinco diferentes loci para as legumaínas. Análises filogenéticas e estudos de expressão gênica demonstraram uma maior associação de OsaLeg2 e OsaLeg3 com tecidos de semente, e OsaLeg1, 4 e 5 com tecidos vegetativos. Também foram observadas formas de splicing alternativo, com potencial de originar diferentes isoformas ativas de legumaínas. Em geral, nossos dados demonstram o envolvimento bifuncional da OcXII nos processos de germinação e defesa interagindo e inibindo a atividade de proteases cisteínicas específicas, onde a região N-term de OcXII inibe papaínas, enquanto a C-term inibe legumaínas. / Phytocystatins are competitive inhibitors of cysteine proteases in plants, principally inhibiting papain-like proteases activity. However, there is one in vitro demonstration that a carboxy-extended phytocystatin can inhibit legumain-like proteases either. In rice there are 12 phytocystatins genes, but only one (OcXII) has the C-terminal extension. Thus, the aim of this study is to understand the diversity and interaction mechanisms among phytocystatins and its cysteine protease targets in rice, focusing on OcXII functional implications. In this work we demonstrated that in rice, the 12 phytocystatins genes have a different gene expression profile during the germination and environmental responses, while OcI OcIII and OcXII were the most expressed genes. A recombinant peptide corresponding to the different C-terminus of OcXII was produced and its inhibitory capacity was confirmed against legumains without affecting the activity of papains. OcXII transcriptional silencing, via RNAi, resulted in plants with increased proteolytic activity for both papain and legumains, in addition to an accelerated initial growth phenotype. The opposite phenotype is observed in seedlings growing under alkaline conditions. Plants expressing the OcXII promoter fused to gus reporter gene demonstrated an OcXII activation profile during germination, especially in the seed scutellum region. This OcXII activation remains high when the seeds are kept at high ABA levels or under alkaline conditions. As specific OcXII targets, legumains are related to the biosynthesis of vacuolar storage components and protein degradation. In rice, we found 5 different loci for legumains. Phylogenetic analyses and gene expression studies demonstrated a greater association of OsaLeg3 and OsaLeg2 with seed tissues, while OsaLeg1, 4 and 5 were more abundant in vegetative tissues. Also alternatively spliced forms were observed, with the potential to produce different isoforms of active legumains. Overall, our data demonstrate the involvement of the bifunctional OcXII in germination processes and defense, interacting and inhibiting the activity of specific cysteine proteases, where its N-term region inhibits papain, while the C-term inhibits legumains.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6416.pdf: 7607633 bytes, checksum: e01f0f58b2ee5032346c3d9eae67f4ac (MD5) Previous issue date: 2014-09-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cystatins are reversible inhibitors of cysteine peptidases. The cystatins found in plants are called phytocystatins, and represent an independent subfamily of the cystatins superfamily. Some studies have reported significant pleiotropic effects for recombinant cystatins expressed in transgenic plants, notably including tolerance phenotypes against attack of herbivorous arthropods and pathogens, and against abiotic and biotic stresses. Besides, the recombinant sugarcane cystatin, CaneCPI-4, showed potential to inhibit development of melanoma cells. Thus, the study and knowledge about phytocystatins, become interesting from agricultural and medicinal point of view. The sugarcane genome project (SUCEST) allowed the identification of about 25 putative cystatins in this plant, which were gathered in 4 groups, by phylogenetic analysis. In this study, we propose a new classification for the putative cystatins found in the SUCEST database. Furthermore, we describe the heterologous expression, purification and characterization of two novel sugarcane cystatins, CaneCPI-5 and CaneCPI-6, which showed different inhibitory activities against human cathepsin B. While protein CaneCPI-6 was not able to inhibit this enzyme efficiently (Ki = 1,83 μM), the protein CaneCPI-5 showed a good inhibitory capacity against the same enzyme (Ki = 6,87 nM). The CaneCPI-5 cystatin was also analyzed against recombinant cathepsin L from the beetle Sphenophorus levis (rSl-CathL), and showed a good inhibitory capacity against this enzyme (Ki = 0,059 nM). Finally, both of proteins, CaneCPI-5 and CaneCPI-6, proved to be thermostable when kept at 100°C for 30 minutes. / Cistatinas são inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases. As cistatinas encontradas em plantas são denominadas fitocistatinas, e constituem uma subfamília independente da superfamília das cistatinas. Alguns estudos têm relatado importantes efeitos pleiotrópicos para cistatinas recombinantes expressas em plantas transgênicas, incluindo principalmente, fenótipos com tolerância ao ataque de artrópodes herbívoros e patógenos, e contra estresses bióticos e abióticos. Ademais, a cistatina recombinante de cana-de-açúcar, CaneCPI-4, apresentou potencial para inibir o desenvolvimento de células de melanoma. Dessa maneira, o estudo e conhecimento sobre as fitocistatinas, tornam-se interessantes do ponto de vista agrícola e na saúde. O projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST) possibilitou a identificação de 25 possíveis cistatinas nesta planta, que foram reunidas em 4 grupos, por meio de análises filogenéticas. Nesse trabalho propomos uma reanálise das prováveis cistatinas encontradas no banco de dados do SUCEST. Além disso, descrevemos a expressão heteróloga, purificação e caracterização de duas novas cistatinas de cana-de-açúcar, CaneCPI-5 e CaneCPI-6, as quais apresentaram diferenças na ação inibitória contra a catepsina B humana. Enquanto a proteína CaneCPI-6 não foi capaz de inibir esta enzima de forma eficiente (Ki = 1,83 μM), a proteína CaneCPI-5 apresentou um bom poder inibitório contra a mesma enzima (Ki = 6,87 nM). A cistatina CaneCPI-5 foi analisada também contra a catepsina L recombinante do inseto Sphenophorus levis (rSl-CathL), e apresentou alto poder inibitório contra essa enzima (Ki = 0,059 nM). Por fim, ambas as proteínas, CaneCPI-5 e CaneCPI-6, mostraram-se termoestáveis quando mantidas à 100°C durante 30 minutos.