Aeromonas spp. são bactérias Gram negativas capazes de causar doenças intestinais e extra-intestinais. A virulência de algumas espécies do gênero já foi associada a diversos fatores, como a expressão de flagelos e conseqüente mobilidade bacteriana. Aeromonas caviae apresenta dois distintos sistemas flagelares, um deles responsável pela natação em meio líquido (swimming) onde está envolvido o flagelo polar, e outro associado ao deslizamento em superfícies sólidas ou viscosas (swarming), o qual participam flagelos laterais. A fim de avaliar a contribuição de ambos os flagelos no contexto da formação de biofilme em superfície plástica e aderência à linhagem celular HEp-2, foram estudadas 76 cepas de A. caviae isoladas de diferentes origens. Os resultados obtidos em nosso estudo demonstraram que a detecção do gene flaA (flagelina polar) foi mais freqüente (94%) que a do gene lafA (flagelina lateral) (71%) e, aparentemente, a presença deste último parece estar condicionada à do primeiro. Todas as cepas que apresentaram o genótipo flaA-lafA-, foram incapazes de formar biofilme, bem como 76% das cepas flaA+lafA-. As cepas provenientes de água foram as que exibiram menor percentual de positividade para o gene da flagelina lateral (57%) e aquelas onde se observou maior incapacidade de formação de biofilme (71%). Além disso, 95% das cepas flaA+lafA+ formaram biofilme e todas as cepas que apresentaram, quantitativamente, um biofilme forte, albergavam ambos os genes. A aderência à HEp-2 se mostrou eficiente em todos os casos onde ao menos um dos flagelos estava presente e em dois casos onde ambos estavam ausentes, com prevalência do padrão agregativo. Em contrapartida, não foi notado uma interferência exclusiva dos flagelos laterais nesse processo. Todas as três cepas que não aderiram ao modelo celular utilizado, ou o fizeram muito discretamente, não exibiram nem o gene flaA, tampouco lafA. Em conclusão aos dados observados, apontamos que uma plena atividade de ambos os flagelos, geralmente, é requerida nos processos de aderência às superfícies abióticas e bióticas. Contudo, trabalhos adicionais sobre a contribuição dessas estruturas na patogênese de A. caviae necessitam ser realizados. / Aeromonas spp. are bacteria Gram-negative able to cause intestinal and extraintestinal diseases. The virulence of some species of this genus has already been associated to several aspects, such as the expression of flagellum and following bacterium mobility. Aeromonas caviae presents two distinct flagellar systems, one of which is responsible for mobility in liquid environments (swimming) at where the polar flagellum is involved, and the other is associated to sliding in solid or viscous surfaces (swarming), in which lateral flagella take part. In order to evaluate the contribution of both flagella in the biofilm formation in plastic surfaces and its adherence to cell line HEp-2, 76 strains of isolated A. caviae from distinct sources were analyzed. The results from our studies showed that detection of gene flaA (polar flagellin) was more frequent (94%) than gene lafA (lateral flagellin) (71%), and apparently, the presence of the last one seems to be conditioned to the first one (the gene flaA). All the strains that presented the genotype flaA-lafA- were unable to form biofilm, such as 76% of strains flaA+lafA-. The aquatic strains were those who showed lesser percentage of positivity for the lateral flagellin gene (57%), and higher incapacity of biofilm formation (71%). Moreover, 95% of the flaA+lafA+ strains formed biofilm, and all strains that quantitatively showed a strong biofilm, contained both genes. The adherence to HEp-2 proved to be efficient in all cases where at least one of the two flagella was present at, and in two cases where both were absent, with prevalence of the aggregative pattern. However, an exclusive interference from the lateral flagella was not perceived in this process. All of the three strains that did not adhere to the cell model used, or that adhered in a very discrete way, did not show neither gene flaA nor gene lafA. In conclusion, we suggest that the complete function of both flagella usually is a requirement in the adherence processes to biotic and abiotic surfaces. However, additional studies on the contribution of these structures in the pathogenesis of A. caviae need to be carried out.

Aeromonas spp. são bactérias Gram negativas capazes de causar doenças intestinais e extra-intestinais. A virulência de algumas espécies do gênero já foi associada a diversos fatores, como a expressão de flagelos e conseqüente mobilidade bacteriana. Aeromonas caviae apresenta dois distintos sistemas flagelares, um deles responsável pela natação em meio líquido (swimming) onde está envolvido o flagelo polar, e outro associado ao deslizamento em superfícies sólidas ou viscosas (swarming), o qual participam flagelos laterais. A fim de avaliar a contribuição de ambos os flagelos no contexto da formação de biofilme em superfície plástica e aderência à linhagem celular HEp-2, foram estudadas 76 cepas de A. caviae isoladas de diferentes origens. Os resultados obtidos em nosso estudo demonstraram que a detecção do gene flaA (flagelina polar) foi mais freqüente (94%) que a do gene lafA (flagelina lateral) (71%) e, aparentemente, a presença deste último parece estar condicionada à do primeiro. Todas as cepas que apresentaram o genótipo flaA-lafA-, foram incapazes de formar biofilme, bem como 76% das cepas flaA+lafA-. As cepas provenientes de água foram as que exibiram menor percentual de positividade para o gene da flagelina lateral (57%) e aquelas onde se observou maior incapacidade de formação de biofilme (71%). Além disso, 95% das cepas flaA+lafA+ formaram biofilme e todas as cepas que apresentaram, quantitativamente, um biofilme forte, albergavam ambos os genes. A aderência à HEp-2 se mostrou eficiente em todos os casos onde ao menos um dos flagelos estava presente e em dois casos onde ambos estavam ausentes, com prevalência do padrão agregativo. Em contrapartida, não foi notado uma interferência exclusiva dos flagelos laterais nesse processo. Todas as três cepas que não aderiram ao modelo celular utilizado, ou o fizeram muito discretamente, não exibiram nem o gene flaA, tampouco lafA. Em conclusão aos dados observados, apontamos que uma plena atividade de ambos os flagelos, geralmente, é requerida nos processos de aderência às superfícies abióticas e bióticas. Contudo, trabalhos adicionais sobre a contribuição dessas estruturas na patogênese de A. caviae necessitam ser realizados. / Aeromonas spp. are bacteria Gram-negative able to cause intestinal and extraintestinal diseases. The virulence of some species of this genus has already been associated to several aspects, such as the expression of flagellum and following bacterium mobility. Aeromonas caviae presents two distinct flagellar systems, one of which is responsible for mobility in liquid environments (swimming) at where the polar flagellum is involved, and the other is associated to sliding in solid or viscous surfaces (swarming), in which lateral flagella take part. In order to evaluate the contribution of both flagella in the biofilm formation in plastic surfaces and its adherence to cell line HEp-2, 76 strains of isolated A. caviae from distinct sources were analyzed. The results from our studies showed that detection of gene flaA (polar flagellin) was more frequent (94%) than gene lafA (lateral flagellin) (71%), and apparently, the presence of the last one seems to be conditioned to the first one (the gene flaA). All the strains that presented the genotype flaA-lafA- were unable to form biofilm, such as 76% of strains flaA+lafA-. The aquatic strains were those who showed lesser percentage of positivity for the lateral flagellin gene (57%), and higher incapacity of biofilm formation (71%). Moreover, 95% of the flaA+lafA+ strains formed biofilm, and all strains that quantitatively showed a strong biofilm, contained both genes. The adherence to HEp-2 proved to be efficient in all cases where at least one of the two flagella was present at, and in two cases where both were absent, with prevalence of the aggregative pattern. However, an exclusive interference from the lateral flagella was not perceived in this process. All of the three strains that did not adhere to the cell model used, or that adhered in a very discrete way, did not show neither gene flaA nor gene lafA. In conclusion, we suggest that the complete function of both flagella usually is a requirement in the adherence processes to biotic and abiotic surfaces. However, additional studies on the contribution of these structures in the pathogenesis of A. caviae need to be carried out.

Orientador: Domingos da Silva Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:33:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_Claudiade_D.pdf: 2791356 bytes, checksum: 7830cb1ece9ec9ac3c34c2794b264c93 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Escherichia coli é um membro comensal da microbiota de animais, porém podem causar doenças desde diarréias até sepses. A caracterização dos seus antígenos de superfície O (somático) e H (flagelar) auxilia na determinação de linhagens patogênicas dentro da espécie. Contudo, algumas bactérias não expressam flagelo in vitro, demonstrado que a amplificação do gene fliC, a análise dos fragmentos de polimorfismo (PCR-RFLP) e sequenciamento podem ser utilizadas para identificação dos antígenos H, em substituição à sorologia convencional. Até meados de 1980, pensava-se que, diferentemente da Salmonella, E. coli possui um único gene para expressão de flagelina (fliC), mas algumas amostras podem conter genes para expressão de flagelina flkA, fllA, flmA, flnA e fljA (repressor de fliC). Em nosso trabalho, analisamos 31 amostras de E. coli isolados de animais e alimentos que apresentavam o fenótipo HNT em ensaios de sorologia. Utilizamos PCR-RFLP e sequenciamento para descrever novos genes para flagelina, da qual foram obtidos antissoros. Identificamos por PCR e sequenciamento os genes responsáveis pela variação de fase fljA, flkA e flmA, realizamos experimentos de motilidade para determinar a variação de fase flagelar e detectar a expressão dos genes através de RT-PCR. Dezessete amostras tiveram seus antígenos H caracterizados, sendo nove caracterizadas por PCR-RFLP: H2 (duas amostras) H16 (duas amostras), H34 (três amostras), H33 (uma amostra) e H38 (uma amostra). Na análise de sequenciamento identificamos duas amostras portadoras do gene fliCh25, duas amostras fliCh7 e uma amostra apresentando fliCh32. Três novos genes para flagelina foram descritos: fliCh2', fliC4c, fliC40c. Identificamos o gene fljA em duas amostras HNT (3C e 4C) e na amostra padrão H35. O gene das amostras HNT apresentaram homologia ao fljA de Salmonella enterica, cuja variação de fase é bem estabelecida. As amostras padrão H11, H35, H40 e H47, bem como as amostras HNT 3C e 4C foram positivas para o gene flmA. As amostras padrão H3 e H53 são portadoras do gene flkA, contudo apenas a amostra H53 apresentou fljA. A amostra H54 é portadora de fljA e flmA. Nenhuma amostra H padrão mostrou variação de fase, diferentemente da literatura, sugerindo a perda da capacidade de variar a fase flagelar. A amostra 4C mostrou variação de fase positiva quando induzida em meios de cultura contendo antissoros anti-H48, anti-H54 e anti-H4C. Do mesmo modo, a detecção dos RNAm em diferentes condições de cultura confirmou a variação de fase. Como resultado um esquema de identificação para detecção de grupos de antígenos H e identificação de fliC foi testado. A técnica de fliC-RFLP provou ser eficiente e rápida, auxiliando a sorologia clássica para detecção de antígenos H de E. coli. Um modelo geral de variação de fase da amostra 4C é expresso por fliCoff + flmAon ? fliCon + flmAoff. Além disso, nós verificamos que a amostra 4C apresenta um gene novo para expressão de flagelina. Este trabalho é pioneiro em relação à variação de fase flagelar, demonstrando uma nova associação entre os antígenos H48 e H54 / Abstract: Escherichia coli are a species of microflora, and characterization of the cell surface lipopolysaccharide O antigen and the flagellar H antigen allow the grouping of pathogenic clones within this species. Moreover, some bacteria in vitro do not obtain to express its flagella, demonstrated that PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and sequencing analysis has been used for the identification of these antigens, in substitution of traditional serology. Moreover, until middle of years 80, are believed, differently of the Salmonella, E. coli possesss an only gene for flagelin expression (fliC), but some s/strains can contain genes for flagellin expression flkA, fllA, flmA, flnA and fljA (repressor of fliC). In this work, we analyzed 31 strains of E. coli isolated from animals and foods that presented HNT phenotype in serology assays. We use PCR-RFLP and sequencing to describe new genes for flagellin, of which antiserum were obtained. We identify for PCR and sequencing the genes for phase variation fljA, flkA and flmA, we carry through motility experiments to determine the flagellar phase variation and to detect the expression of the genes (RNAm) through RT-PCR. Seventeen strains had had its H antigen characterized and nine of then were characterized for PCR-RFLP: H2 (two strains) H16 (two strains), H34 (three strains), H33 (one strain) and H38 (one strain). Through sequencing analysis we identify to two carrying strains of the gene fliCh25, two strains fliCh7 and one strain presenting fliCh32. Three new genes for flagellin had been described: fliCh2', fliC4c, fliC40c. Using PCR and sequencing, we identify fljA gene in two strains HNT (3C and 4C) and in the H35 control strain. The HNT genes showed homology to fljA of Salmonella enterica, whose variation of phase well is established. The control strains H11, H35, H40 and H47, as well as HNT 3C and 4C strains were positive for flmA gene. The control strains H3 and H53 are carrying of flkA gene, however only the H53 strain presented fljA. The H54 control strain is carrying of fljA and flmA. No H control strain showed phase variation, differently of literature, suggesting the loss of the capacity to flagellar phase variation. The 4C strain showed positive phase variation when cultured with antiserum anti-H48, anti-H54 and anti-H4C. In a similar way, the detention of RNAm in different conditions of culture confirmed the phase variation. As a result, an identification scheme was tested to deduce H antigen groups and new genes of fliC. The fliCRFLP technique proved to be faster than classic serotyping for the deduction of the E. coli H antigen, characterizing the antigens with few days and indicating new putative genes. Thus, a general model for flagellar phase variation in 4C strain can be expressed as fliCoff + flmAon ? fliCon + flmAoff. In addition, we found that strains 3C and 4C express unidentified flagellin antigens. This is the first report of flagellar phase variation in wild E. coli strains. We have also provided evidence that strain 4C, identified here for the first time, expresses three flagellar antigens, H48, H54 and a previously unidentified flagellin / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Domingos da Silva Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:47:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiba_MoniqueRibeiro_D.pdf: 3934673 bytes, checksum: 211302f7129afd8376ba9096064a21c4 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Escherichia coli tem sido isolada, com certa freqüência, apresentando antígenos flagelares (H) que não são reconhecidos por nenhum dos anti-soros disponibilizado pelo mais importante centro de referência de E. coli, The International Escherichia and Klebsiella Centre (WHO) do Statens Serum Institut, Copenhague, Dinamarca. Atualmente são reconhecidos 53 antígenos "H" e, nos últimos 29 anos, nenhuma modificação ocorreu na lista dos antígenos flagelares associados à Escherichia coli. Isto posto, os objetivos deste trabalho foram identificar os antígenos flagelares das cepas de E. coli que expressam H não tipável (HNT) e que apresentam fatores de virulência associados à diferentes enteropatias. Esta identificação foi realizada inicialmente, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) do gene fliC, responsável pela proteína flagelina, das 53 amostras padrões para os antígenos H e das 20 amostras HNT (H não-tipável). Em seguida, os amplicons foram digeridos por enzimas de restrição e daquelas amostras que apresentaram perfis de restrições distintos daqueles observados para as amostras padrões de antígeno H, foram produzidos soros em coelhos. Foram realizados testes de titulação frente aos 53 antígenos padrões, frente ao antígeno homólogo e frente aos antígenos das amostras HNT. As seqüência gênicas das amostras HNT, obtidas na reação de sequenciamento, foram comparadas aos diferentes genes de fliC armazenados no banco de dados do "National Center for Biotecnology Information" (NCBI) através do sistema BLAST, e o programa ClustalW foi utilizado para alinhamento das seqüências. Os resultados demonstraram que estas amostras apresentaram similaridade com antígenos padrões, entretanto, elas não possuem a mesma seqüência nucleotídica e também não reagiram fenotipicamente com o anti-soro esperado. Os dados obtidos permitem concluir que no conjunto de amostras estudado, treze amostras apresentaram antígeno flagelar diferente daqueles já descritos na literatura, quando utilizado as técnicas de PCR e/ou sorologia. / Abstract: Escherichia coli has been isolated frequently, showing flagellar antigens that are not recognized by any of the antisera, provided by the most important reference center of E. coli, The International Escherichia and Klebsiella Centre (WHO) of the Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark. Are currently recognized 53 H antigens and in the last 29 years, no change occurred in the list of flagellar antigens associated with Escherichia coli. The objectives of this study were to identify the flagellar antigens of E. coli that do not express non-typeable H antigens and presenting the virulence factors associated with different diseases. This identification was performed initially by gene amplification of the fliC, (flagellin protein) by the polymerase chain reaction (PCR) in all 53 standards E. coli strains for the H antigens and 20 non-typeable H-antigens E. coli strains, being then, the amplicons were digested by restriction enzymes. Anti-sera were produced in rabbits, those strains that showed different restriction profiles of these patterns observed for the nontypeable H antigens E. coli strains. Agglutination testes were carried out against the 53 antigens standards, against the homologous antigen and H antigens of the non-typeable strains. DNA sequences were compared to different fliC genes stored in the database of the National Center for Biotecnology Information (NCBI) through the BLAST, and ClustalW program was used to align the sequences. The results showed that although these strains have homology with a standard H-antigen, they do not have the same nucleotide sequence and did not phenotypically reacted with the antiserum expected. The data obtained showed that thirteen strains had a different H antigen those already described in the literature when used the techniques of PCR-RFLP and/or serology. / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-19T13:39:08Z No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-19T13:39:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal Fluminense. Centro de Estudos Gerais. Instituto de Biologia. Niteroi, RJ, Brasil / A família Trypanosomatidae inclui parasitas de uma grande variedade de vertebrados, invertebrados (principalmente insetos), plantas e algumas espécies de protozoários, sendo, depois do nematóides, os de maior distribuição de hospedeiros na natureza. No presente trabalho, um novo isolado foi obtido por coprocultivo de trato intestinal de Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae), capturado no município de Itaguaí/RJ. O isolado original e três clones (obtidos por citometria de fluxo) foram depositados na "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmanioses." Um clone foi caracterizado por diversas abordagens em comparação com espécies de referência de diferentes gêneros. Foi analisado o crescimento em meio de cultivo em intervalos de 24 h, entre 48-144 h, a diferenciação celular e a morfometria dos principais estágios evolutivos encontrados. A análise de isoenzimas foi realizada utilizando-se os seguintes sistemas: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH e ACON. RAPD-PCR foi realizado utilizando-se 6 iniciadores, conjuntamente com outros tripanosomatídeos. Os dados destas análises foram processados numericamente e submetidos à análise computacional utilizando-se o coeficiente de associação Jaccard e o algoritmo de agrupamento UPGMA. Realizou-se seqüenciamento do amplicon do gene de SSU rRNA e o fragmento analisado foi alinhado com vinte e uma seqüencias depositadas no GenBank, gerando uma árvore filogenética resultante do pareamento. O conjunto de resultados deste trabalho sugere que a amostra obtida constitui nova espécie, pertencendo a um novo gênero, nomeada Vickermania itaguaiensis. / The Trypanosomatidae family includes parasites of a wide variety of vertebrates, invertebrates (mainly insects), plants and some species of protozoa, and after the nematodes, the highest distribution of hosts in nature. In this study, an isolate was obtained by coproculture from Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae) intestinal tract, captured in the city of Itaguaí/RJ. The original isolate and clones (obtained by flow cytometry) were deposited in the "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmaniose". One clone was characterized by several approaches in comparison with the reference species of different genus. Growth was analyzed in culture medium at 24 h intervals between 48-144 h, cell differentiation and morphometric parameters of the main evolutionary stages matches. The isoenzyme analysis was performed using the following systems: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH and ACON. RAPD-PCR was performed using 6 primers, together with other trypanosomatids. The analysis of these data were numerically processed and submitted to computer analysis using the Jaccard association coefficient and UPGMA clustering algorithm. We carried out sequencing of the amplicon from SSU rRNA gene and the fragment analyzed was aligned with twenty-one sequences deposited in GenBank, generating a phylogenetic tree resulting from the pairing. The result set of this work suggests that the sample obtained represents a new species belonging to a new genus, named Vickermania itaguaiensis.