Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) wurden als essentielle Enzyme für die Regulation des Zellzyklus mit kritischem Beitrag zur gestörten Zellproliferation während der Kanzerogenese identifiziert. Als Konsequenz davon erwiesen sich die Cdk4/6 als attraktive Zielproteine für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte zur pharmakologischen Tumorbehandlung. Verbindungen aus der Substanzklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine zeigten vielversprechende inhibitorische Wirkungen auf die Aktivität der Cdk4/6 bei gleichzeitiger herausragender Selektivität gegenüber anderen Cdk. Anschließende Untersuchungen in vitro und in vivo verdeutlichten das Potential einiger Pyrido[2,3 d]pyrimidine zur Inhibierung des Tumorzellwachstums. Die Weiterentwicklung und Nutzung selektiver Cdk4/6-Inhibitoren zur funktionellen Charakterisierung der Cdk4/6 in Tumoren in vivo mit Hilfe der nicht-invasiven Bildgebungstechnik Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein neuer vielversprechender Forschungsansatz und von großem Interesse für die Evaluierung neuer Strategien zur Diagnose und Therapie maligner Erkrankungen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung neuer potentieller Cdk4/6-Inhibitoren aus der Verbindungsklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine und deren Bewertung hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirksamkeit zur gezielten Cdk4/6-Inhibierung in ausgewählten Tumorzelllinien sowie ihres Potentials zur funktionellen Bildgebung der Cdk4/6 in Tumoren mittels PET am Tiermodell. Die biochemische Charakterisierung der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB, CKIC, CKID und CKIE hinsichtlich ihrer zellulären und molekularen Wirkung erfolgte in den kontinuierlich proliferierenden humanen Tumorzelllinien HT-29, FaDu und THP 1 und in differenzierten THP-1-Makrophagen. Die Zweckmäßigkeit der untersuchten Zelllinien zur Charakterisierung potentieller Cdk4/6-Inhibitoren wurde anhand von Studien zur mRNA-Expression und Proteinbiosynthese der Kinasen Cdk4/6 nachgewiesen. Des Weiteren wurde das Vorkommen der Cdk4/6 in den humanen Xenograft-Tumoren HT-29 und FaDu, sowie in ausgewählten Organen und Geweben von nu/nu-NMRI-Mäusen charakterisiert. In vitro wurden für alle untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine signifikante, konzentrations- und zeitabhängige inhibitorische Effekte auf die Tumorzellproliferation beobachtet. Durchflusszytometrische Zellzyklusanalysen 24 Stunden nach Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen zeigten eine konzentrationsabhängige Zunahme des Anteils der HT-29-, FaDu- und THP-1-Zellen in der G1-Phase bis auf 90%. Für die nicht-proliferierenden THP 1-Makrophagen wurden bei Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen geringe Veränderungen ihrer Zellzahl und Zellzyklusphasen-verteilung detektiert. Die zellulären Studien identifizierten deutliche qualitative und quantitative Unterschiede der untersuchten Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Nanomolare Konzentrationen von CKIA, CKIB bzw. CKIE erzielten bereits 24 Stunden nach Inkubation deutliche Effekte, während für CKIC und CKID die 10- bis 100-fache Konzentration eingesetzt werden musste, um eine ähnliche Wirkung zu erhalten. Die molekularen Ursachen der Wachstumshemmung und des Zellzyklusarrests wurden durch Untersuchungen zur Pyrido[2,3 d]pyrimidin-abhängigen Beeinflussung des Cdk4/6-Cyclin D-Retinoblastom-E2F-Signalwegs geklärt. In allen Zelllinien wurde eine deutliche Inhibierung der Cdk4/6-spezifischen Phosphorylierung der Aminosäure Serin-780 des Retinoblastom-Proteins (pRb) beobachtet. Als Konsequenz dieser Inhibierung wurde für CKIA, CKIB und CKIE die signifikante konzentrationsabhängige Unterbrechung der Genexpression von E2F-1 und PCNA nachgewiesen. Die Radiomarkierung der Cdk4/6-Inhibitoren CKIA und CKIB mit 124I bzw. von CKIE mit 18F ermöglichte erstmals die Charakterisierung von in vivo-Interaktionen und des Metabolismus im Blut zirkulierender Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Die radiopharmako-logischen Eigenschaften von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE wurden in Untersuchungen zur zellulären Radiotracer-Aufnahme, der metabolischen Stabilität und der Bioverteilung bei Ratten sowie abschließend in Kleintier-PET-Untersuchungen bei FaDu-Tumor-tragenden nu/nu-NMRI-Mäusen analysiert. In vitro-Experimente mit [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE verdeutlichten eine hohe Stabilität und schnelle Aufnahme der Radiotracer in humane Tumorzellen bei 37°C. Allerdings deutet die Zelltyp-unabhängige Anreicherung auf eine geringe Abhängigkeit der Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Akkumulation vom Cdk4/6-Status der Zellen hin. Die signifikant geringeren Aufnahmewerte aller untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine bei 4°C und die Blockierung der Aufnahme von [18F]CKIE mit nichtradioaktivem CKIE unterstützen die Vermutung spezifischer Transportmechanismen für die Aufnahme der Pyrido[2,3 d]pyrimidine. Untersuchungen von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE in vivo identifizierten eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende Eliminierung aus dem Blut und die primäre Aufnahme in die Leber als grundlegende Stoffwechseleigenschaft aller drei Radiotracer. Aus den PET-Untersuchungen mit [124I]CKIA und [124I]CKIB bei FaDu-Tumor-tragenden Mäusen wurden nur marginale Anreicherungen der radioaktiven Substanzen im Bereich des Tumors festgestellt. Für [18F]CKIE wurde eine Akkumulation im proliferierenden Randbereich des Tumors beobachtet. Die schnelle Metabolisierung von [18F]CKIE im Blut sowie das konstante, geringe Verhältnis der Aktivität im Tumor zur Aktivität im Skelettmuskel wiesen allerdings auf eine unspezifische Anreicherung hin. Schlussfolgernd aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurde die Effektivität der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB und CKIE hinsichtlich der Inhibierung der Cdk4/6-vermittelten Zellzyklusprogression gezeigt. Die antiproliferative Aktivität der Substanzen unterstützt eine weiterführende Evaluierung dieser Cdk4/6-Inhibitoren zur pharmakologischen Tumortherapie. Auf der Basis der erhaltenen radiopharmakologischen Ergebnisse werden die kurze biologische Halbwertszeit und unspezifische Tumoranreicherung von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE als limitierende Faktoren für die Eignung dieser Verbindungen als Radiotracer zur nicht-invasiven Bildgebung der Cdk4/6 im Zielgewebe mittels PET angesehen. Es bleibt zu klären, ob eine längere Verweildauer und höhere Stabilität radiomarkierter Pyrido[2,3-d]pyrimidine im Blut die Chance der Cdk4/6-spezifischen Gewebeanreicherung erhöhen oder Transport-mechanistische Effekte allein ausschlaggebend für die Anreicherung in Zellen und Geweben sind. Die Untersuchung optimierter Cdk4/6-selektiver Inhibitoren für die Charakterisierung und Therapie von Tumoren bleibt weiterhin ein interessanter Aspekt in der Tumorforschung.

La tomographie par émission de positons (TEP) est une modalité d’imagerie nucléaire puissante, permettant des mesures fonctionnelles non-invasive dans les cellules, les animaux et les humains avec une haute sensibilité et résolution. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires de 30 à 120 nm qui peuvent transférer leur contenu cytoplasmique entre cellules, mais comprendre leurs cheminements in vivo reste un défi. Les hydrogels thermosensibles à base de chitosane ont été développés et sont sous optimisation pour diverses applications telles que l'embolisation des vaisseaux sanguins, l'administration de médicaments, l’'administration de lymphocytes et la réparation du cartilage et des disques intervertébraux. Il y a un besoin urgent de suivi in vivo à court terme pour évaluer la rétention des hydrogels et des exosomes. Le Hexadécyl-4- [18F]-fluorobenzoate ([18F]HFB) est un radiotraceur lipophile à longue chaîne qui est retenu dans les membranes cellulaires et les biomatériaux. Le but de ce travail était d'automatiser la radiosynthèse de [18F]HFB pour marquer des exosomes et des hydrogels. La radiosynthèse et la purification de [18F]HFB ont été réalisées en utilisant le synthétiseur de chimie commercial IBA Synthera®. [18F]HFB a été préparé via substitution du précurseur d’ammonium quaternaire par [18F]F-. Après une première purification via une cartouche C18, [18F]HFB a été élué avec de l'acétonitrile et purifié par HPLC. [18F]HFB a ensuite été reformulé dans une solution de DMSO (10%) après élimination du solvant HPLC sous azote, filtré et dilué dans une solution saline stérile. [18F]HFB a été obtenu en rendement radiochimique allant de 15 à 45% (corrigé pour désintégration), en haute pureté radiochimique et chimique, et dans un temps de synthèse total de 60 minutes. Les exosomes n'ont pas été marqués avec succès. Cependant, les hydrogels de chitosane ont démontré un marquage élevé, avec une stabilité du complexe >90%, même après 8 heures d’incubation en solution saline. La TEP avec [18F]HFB d'exosomes et de biomatériaux présente une approche novatrice pour déterminer leur distribution in vivo. / Positron emission tomography (PET) is a powerful nuclear imaging modality allowing for non-invasive functional measures in cells, animals and humans with high sensitivity. Exosomes are 30-120 nm extracellular vesicles that can transfer their cytoplasmic contents between cells, however, understanding where exosomes traffic in the body remains a challenge. Chitosan-based thermosensitive hydrogels have been developed and are currently under optimization for various applications such as blood vessel embolization, drug delivery, lymphocyte delivery systems, and cartilage and intervertebral disc repair. There is an urgent need for in vivo, short term follow-up of such procedures to assess the retention of hydrogels and exosomes at the site of injection. Hexadecyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]HFB) is a long chain lipophilic radiotracer that has been reported to be retained within cell membranes or biomaterials. The aim of this work was to automate the radiosynthesis of [18F]HFB for labeling exosomes and chitosan-based hydrogels. The radiosynthesis and purification of [18F]HFB was done using the commercial IBA Synthera® chemistry synthesiser with the R&D IFP-cassette and HPLC module. As previously reported, [18F]HFB was prepared by [18F]F- substitution of the trimethyl ammonium triflate precursor in DMSO. After removal of unreacted [18F]F- and DMSO via a C18 light cartridge, [18F]HFB was eluted with acetonitrile and purified by semi-prep C18 HPLC. [18F]HFB was then reformulated in DMSO (10%) solution after removal of the HPLC solvent from the radioactive product peak under nitrogen, filtered, and diluted in sterile saline. [18F]HFB was obtained in radiochemical yield (isolated after HPLC and evaporation) ranging from 15 – 45% (decay-corrected), high radiochemical and chemical purities, and within a total synthesis time of 60 mins. Exosomes were not successfully labeled. However, high labeling efficiency was observed with the chitosan hydrogels displaying a stability >90%, even after 8 hours incubation in saline. PET imaging with [18F]HFB of exosomes and biomaterials presents a novel approach to determining their in vivo distribution.

Aujourd’hui les médecins disposent de nombreuses techniques d’imagerie médicale afin d’établir des diagnostics précis et précoces. Cependant, chacune de ces techniques possède ses propres avantages et inconvénients. C’est pourquoi, l’utilisation de méthodes bi- ou multi-modales paraît intéressante. Parmi celles-ci, la combinaison TEP/IRM permet d’apporter des informations complémentaires. Il est alors nécessaire d’injecter aux patients un traceur adapté à chacune de ces modalités. Ce travail de thèse a donc consisté à synthétiser des plateformes moléculaires « universelles » utilisables pour l’imagerie IRM et TEP selon deux stratégies. La première a consisté en la synthèse d’une molécule composée d’un macrocycle de type DO3A permettant à la fois la chélation d’un atome de gadolinium pour l’IRM mais aussi d’un atome de gallium 68 pour la TEP. L’idée étant, afin d’avoir une sonde bimodale, de réaliser un mélange des deux composés. La seconde stratégie a été de synthétiser une unique molécule pouvant être marquée à la fois par du gadolinium pour l’IRM et par un atome de fluor 18 pour la TEP. Afin de pouvoir cibler un phénomène physiopathologique donné, l’idée de ces plateformes est de pouvoir introduire de manière simple et versatile une biomolécule. La chimie « click » semble être une méthode particulièrement attractive pour pouvoir réaliser cet objectif. Cependant, cette réaction, habituellement catalysée au cuivre est difficilement applicable sur ce genre de plateforme du fait de l’affinité du cuivre pour le macrocycle DO3A. Ce problème a donc été contourné par utilisation de la réaction de chimie « click » catalysée par des complexes de ruthénium afin d’avoir accès aux deux plateformes macrocycliques. / Today physicians can use a wide variety of medical imaging techniques to establish early and accurate diagnosis. Nevertheless, each modality has its own advantages and drawbacks. This is why bi- or multimodality approach seems interesting. Among them, PET/MRI combination seems very promising because it can bring complementary informations. It is therefore necessary to inject to patients tracers specific to each imaging modality. This work described the synthesis of molecular platforms for MRI and PET imaging, according to 2 different strategies. The first one consisted in the synthesis of a DO3A macrocycle allowing the chelation of both gadolinium for MRI and gallium 68 for PET. The aim here is to have a bimodal probe, with a mixture of each compound. The second strategy was the preparation of a single molecule that can be simultaneously labeled by both gadolinium for MRI and fluorine 18 for PET. The final goal is to introduce onto these platforms a biomolecule in a versatile and easy way, to be able to target a specific pathophysiological process. ‘‘Click’’ chemistry seems to be an attractive methodology to achieve this goal. However, this reaction, usually catalyzed with copper is not suitable to DO3A macrocyles due to the copper affinity with those azamacrocycles. This issue has been circumvent by the use of ruthenium catalyzed ‘‘click’’ chemistry. We were then able to access to both macrocycles platforms.

The collagen telopeptides play an important role for lysyl oxidase-mediated crosslinking, a process which is deregulated during tumour progression. The DEKS motif which is located within the N-terminal telopeptide of the α1 chain of type I collagen has been suggested to adopt a βI-turn conformation upon docking to its triple-helical receptor domain, which seems to be critical for lysyl oxidase-catalysed deamination and subsequent crosslinking by Schiff-base formation. Herein, the design and synthesis of cyclic peptides which constrain the DEKS sequence in a β-turn conformation will be described. Lysine-side chain attachment to 2-chlorotrityl chloride-modified polystyrene resin followed by microwave-assisted solid-phase peptide synthesis and on-resin cyclisation allowed for an efficient access to head-to-tail cyclised DEKS-derived cyclic penta- and hexapeptides. An Nε-(4-fluorobenzoyl)lysine residue was included in the cyclopeptides to allow their potential radiolabelling with fluorine-18 for PET imaging of lysyl oxidase. Conformational analysis by ¹H NMR and chiroptical (electronic and vibrational CD) spectroscopy together with MD simulations demonstrated that the concomitant incorporation of a D-proline and an additional lysine for potential radiolabel attachment accounts for a reliable induction of the desired βI-turn structure in the DEKS motif in both DMSO and water as solvents. The stabilised conformation of the cyclohexapeptide is further reflected by its resistance to trypsin-mediated degradation. In addition, the deaminated analogue containing allysine in place of lysine has been synthesised via the corresponding ε-hydroxynorleucine containing cyclohexapeptide. Both ε-hydroxynorleucine and allysine containing cyclic hexapeptides have been subjected to conformational analysis in the same manner as the lysine-based parent structure. Thus, both a conformationally restricted lysyl oxidase substrate and product have been synthetically accessed, which will enable their potential use for molecular imaging of these important enzymes.

Krebserkrankungen stellen in Deutschland die zweithäufigste Todesursache dar und die Anzahl der Neuerkrankungen nimmt stetig zu. Frühzeitige Diagnosen und Therapiemöglichkeiten sind daher dringend erforderlich. Cyklinabhängige Proteinkinasen (Cdk) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellzyklus. Viele Tumore zeigen eine deregulierte Cdk4‑Aktivität und/oder ‑Expression. Insgesamt zeigen ca. 80% aller Tumore eine Fehlregulation der für den Zellzyklus zentralen Cdk4/CykD1/INK4/pRb/E2F Signalkaskade. Somit besitzen Cdks ein enormes therapeutisches Potential im Kampf gegen Krebs. Die spezifische Inhibierung der Cdks verhindert die Zellproliferation und damit das Tumorwachstum. In den letzten Jahren wurden verschiedenste Strukturklassen vorgestellt, die als Cdk4-Inhibitor wirken. Im Rahmen der Promotion sollen die Möglichkeiten einer funktionellen Tumordiagnose mittels cyklinabhängiger Kinasen untersucht werden. Die Entwicklung von radioaktiv markierten Inhibitoren der Cdk4/6 als Radiotracer und ihre radiopharmakologische Charakterisierung stellt dabei einen neuen Ansatz dar. Um die Rolle der Cdk4/6 im Zellzyklus von gesunden und deregulierten (z.B. Tumor-) Zellen aufzuklären, sollten mit Iod-124 und Fluor-18 markierte Inhibitoren eingesetzt werden, die hochselektiv diese Cdks blockieren. Zunächst wurden verschiedene Inhibitoren der Cdk4/6 und deren Vorstufen für die Radiomarkierung dargestellt. Die bereits aus den Vorarbeiten von VanderWel et al., 2005 und Toogood et al., 2001 bekannten Syntheserouten mussten dazu optimiert werden und für neue Verbindungen, wie die fluorethylierten Substanzen, wurden neue Reaktionswege gefunden. Die dargestellten Referenzverbindungen CKIA-E wurden anschließend mittels Durchflusszytometrie an den Zelllinien HT-29 und FaDu auf ihre inhibitorischen Wirkung untersucht. Die Untersuchungen der Verbindungen CKIA/B/E zeigte, dass ein Zellzyklusarrest unter Einwirkung der Inhibitoren erreichbar ist. Die weiteren Untersuchungen zur Radiomarkierbarkeit sowie die radiopharmakologische Evaluation sollten daher an den Verbindungen CKIA, CKIB und CKIE stattfinden. Die Darstellung der Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB erfolgte in zwei Schritten über die elektrophile Substitution durch regioselektive Destannylierung mit anschließender Entschützung der Seitenkette. Die Darstellung der fluorethylierten Verbindung erfolgte ebenfalls über eine Zweischrittsynthese beginnend mit der Synthese der prosthetischen Gruppe [18F]BFE aus der Tosylmarkierungsvorstufe. Die zur Markierung des sekundären Amins zur Auswahl stehenden prosthetischen Gruppen [18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [18F]Bromfluorethan ([18F]BFE) wurden auf ihre Eignung untersucht, ebenso wie die Auswahl einer geeigneten Markierungsvorstufe für die Darstellung der prosthetischen Gruppe. Die optimierten Syntheserouten ermöglichten die Isolierung von ausreichenden Mengen an Produktaktivität für die radiopharmakologischen Untersuchungen. Es fanden, neben der Bestimmung der spezifischen Aktivität und der Lipophilie der Verbindungen, Zellaufnahmeuntersuchungen und Bestimmungen zur Stabilität der Verbindungen in vitro, ex vivo und in vivo statt. Die radioiodierten Verbindungen konnten des Weiteren zur Untersuchungen der Bioverteilung in normalen männlichen Wistar-Ratten eingesetzt werden. Für alle drei Verbindungen konnte eine sehr hohe in vitro-Stabilität festgestellt werden. Die Zellaufnahmeuntersuchungen zeigten vor allem für die Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB eine beträchtliche Zellaufnahme von über 1000% ID/mg Protein nach 2 h. Die Zellaufnahme der Verbindung CKIE ist geringer, sollte allerdings für eine in vivo-Anwendung ausreichend sein. Die Untersuchung der in vivo‑Stabilität der Verbindungen [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE im Blut von Wistar Ratten ergab allerdings, dass alle Verbindungen schnell metabolisiert werden. Die Untersuchung der Bioverteilung der radioiodierten Verbindungen belegen eine in vivo Radiodeiodierung sowie eine hohe hepatobliliäre Auscheidungsrate. Im Hinblick auf eine Anwendung als Radiotracer konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Erkenntnisse gewonnen werden. Die dargestellten Inhibitoren sind in der Lage am Zellmodell den Zellzyklusarrest in der G1-Phase zu induzieren. Eine Radiomarkierung der ausgewählten Strukturen liefert das Produkt mit reproduzierbarer Ausbeute in hoher radiochemischer Reinheit und ausreichender spezifischer Aktivität, allerdings ist eine Herstellung der fluorethylierten Verbindung unter GMP-Bedingungen nur schwer realisierbar. Die radiomarkierten Verbindungen zeigen eine hohe in vitro-Stabilität und werden energieabhängig in die Zelle aufgenommen. Anhand der Stabilitätsuntersuchungen in vivo wurde gezeigt, dass alle drei Verbindungen in vivo instabil sind und sehr schnell hepatobiliär eliminiert.

Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) wurden als essentielle Enzyme für die Regulation des Zellzyklus mit kritischem Beitrag zur gestörten Zellproliferation während der Kanzerogenese identifiziert. Als Konsequenz davon erwiesen sich die Cdk4/6 als attraktive Zielproteine für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte zur pharmakologischen Tumorbehandlung. Verbindungen aus der Substanzklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine zeigten vielversprechende inhibitorische Wirkungen auf die Aktivität der Cdk4/6 bei gleichzeitiger herausragender Selektivität gegenüber anderen Cdk. Anschließende Untersuchungen in vitro und in vivo verdeutlichten das Potential einiger Pyrido[2,3 d]pyrimidine zur Inhibierung des Tumorzellwachstums. Die Weiterentwicklung und Nutzung selektiver Cdk4/6-Inhibitoren zur funktionellen Charakterisierung der Cdk4/6 in Tumoren in vivo mit Hilfe der nicht-invasiven Bildgebungstechnik Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein neuer vielversprechender Forschungsansatz und von großem Interesse für die Evaluierung neuer Strategien zur Diagnose und Therapie maligner Erkrankungen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung neuer potentieller Cdk4/6-Inhibitoren aus der Verbindungsklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine und deren Bewertung hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirksamkeit zur gezielten Cdk4/6-Inhibierung in ausgewählten Tumorzelllinien sowie ihres Potentials zur funktionellen Bildgebung der Cdk4/6 in Tumoren mittels PET am Tiermodell. Die biochemische Charakterisierung der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB, CKIC, CKID und CKIE hinsichtlich ihrer zellulären und molekularen Wirkung erfolgte in den kontinuierlich proliferierenden humanen Tumorzelllinien HT-29, FaDu und THP 1 und in differenzierten THP-1-Makrophagen. Die Zweckmäßigkeit der untersuchten Zelllinien zur Charakterisierung potentieller Cdk4/6-Inhibitoren wurde anhand von Studien zur mRNA-Expression und Proteinbiosynthese der Kinasen Cdk4/6 nachgewiesen. Des Weiteren wurde das Vorkommen der Cdk4/6 in den humanen Xenograft-Tumoren HT-29 und FaDu, sowie in ausgewählten Organen und Geweben von nu/nu-NMRI-Mäusen charakterisiert. In vitro wurden für alle untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine signifikante, konzentrations- und zeitabhängige inhibitorische Effekte auf die Tumorzellproliferation beobachtet. Durchflusszytometrische Zellzyklusanalysen 24 Stunden nach Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen zeigten eine konzentrationsabhängige Zunahme des Anteils der HT-29-, FaDu- und THP-1-Zellen in der G1-Phase bis auf 90%. Für die nicht-proliferierenden THP 1-Makrophagen wurden bei Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen geringe Veränderungen ihrer Zellzahl und Zellzyklusphasen-verteilung detektiert. Die zellulären Studien identifizierten deutliche qualitative und quantitative Unterschiede der untersuchten Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Nanomolare Konzentrationen von CKIA, CKIB bzw. CKIE erzielten bereits 24 Stunden nach Inkubation deutliche Effekte, während für CKIC und CKID die 10- bis 100-fache Konzentration eingesetzt werden musste, um eine ähnliche Wirkung zu erhalten. Die molekularen Ursachen der Wachstumshemmung und des Zellzyklusarrests wurden durch Untersuchungen zur Pyrido[2,3 d]pyrimidin-abhängigen Beeinflussung des Cdk4/6-Cyclin D-Retinoblastom-E2F-Signalwegs geklärt. In allen Zelllinien wurde eine deutliche Inhibierung der Cdk4/6-spezifischen Phosphorylierung der Aminosäure Serin-780 des Retinoblastom-Proteins (pRb) beobachtet. Als Konsequenz dieser Inhibierung wurde für CKIA, CKIB und CKIE die signifikante konzentrationsabhängige Unterbrechung der Genexpression von E2F-1 und PCNA nachgewiesen. Die Radiomarkierung der Cdk4/6-Inhibitoren CKIA und CKIB mit 124I bzw. von CKIE mit 18F ermöglichte erstmals die Charakterisierung von in vivo-Interaktionen und des Metabolismus im Blut zirkulierender Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Die radiopharmako-logischen Eigenschaften von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE wurden in Untersuchungen zur zellulären Radiotracer-Aufnahme, der metabolischen Stabilität und der Bioverteilung bei Ratten sowie abschließend in Kleintier-PET-Untersuchungen bei FaDu-Tumor-tragenden nu/nu-NMRI-Mäusen analysiert. In vitro-Experimente mit [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE verdeutlichten eine hohe Stabilität und schnelle Aufnahme der Radiotracer in humane Tumorzellen bei 37°C. Allerdings deutet die Zelltyp-unabhängige Anreicherung auf eine geringe Abhängigkeit der Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Akkumulation vom Cdk4/6-Status der Zellen hin. Die signifikant geringeren Aufnahmewerte aller untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine bei 4°C und die Blockierung der Aufnahme von [18F]CKIE mit nichtradioaktivem CKIE unterstützen die Vermutung spezifischer Transportmechanismen für die Aufnahme der Pyrido[2,3 d]pyrimidine. Untersuchungen von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE in vivo identifizierten eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende Eliminierung aus dem Blut und die primäre Aufnahme in die Leber als grundlegende Stoffwechseleigenschaft aller drei Radiotracer. Aus den PET-Untersuchungen mit [124I]CKIA und [124I]CKIB bei FaDu-Tumor-tragenden Mäusen wurden nur marginale Anreicherungen der radioaktiven Substanzen im Bereich des Tumors festgestellt. Für [18F]CKIE wurde eine Akkumulation im proliferierenden Randbereich des Tumors beobachtet. Die schnelle Metabolisierung von [18F]CKIE im Blut sowie das konstante, geringe Verhältnis der Aktivität im Tumor zur Aktivität im Skelettmuskel wiesen allerdings auf eine unspezifische Anreicherung hin. Schlussfolgernd aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurde die Effektivität der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB und CKIE hinsichtlich der Inhibierung der Cdk4/6-vermittelten Zellzyklusprogression gezeigt. Die antiproliferative Aktivität der Substanzen unterstützt eine weiterführende Evaluierung dieser Cdk4/6-Inhibitoren zur pharmakologischen Tumortherapie. Auf der Basis der erhaltenen radiopharmakologischen Ergebnisse werden die kurze biologische Halbwertszeit und unspezifische Tumoranreicherung von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE als limitierende Faktoren für die Eignung dieser Verbindungen als Radiotracer zur nicht-invasiven Bildgebung der Cdk4/6 im Zielgewebe mittels PET angesehen. Es bleibt zu klären, ob eine längere Verweildauer und höhere Stabilität radiomarkierter Pyrido[2,3-d]pyrimidine im Blut die Chance der Cdk4/6-spezifischen Gewebeanreicherung erhöhen oder Transport-mechanistische Effekte allein ausschlaggebend für die Anreicherung in Zellen und Geweben sind. Die Untersuchung optimierter Cdk4/6-selektiver Inhibitoren für die Charakterisierung und Therapie von Tumoren bleibt weiterhin ein interessanter Aspekt in der Tumorforschung.:1 EINLEITUNG UND LITERATURÜBERSICHT 1 1.1 Der Zellzyklus 1 1.2 Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) 4 1.2.1 Entdeckung und Struktur der Cdk4/6 4 1.2.2 Funktion und Regulation der Cdk4/6 im Zellzyklus 5 1.2.3 Cdk4/6 und Embryogenese 8 1.2.4 Cdk4/6 und Homöostase 9 1.2.5 Cdk4/6 und Kanzerogenese 10 1.3 Die Cdk4/6 als Zielproteine für die Tumortherapie 11 1.4 Die Tumordiagnostik mittels Positronen-Emissions-Tomographie 16 1.5 Zielstellung 19 2 MATERIAL UND METHODEN 20 2.1 Materialien 20 2.1.1 Geräte 20 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 21 2.1.3 Chemikalien, Medien und Enzyme 21 2.1.4 Antikörper und Immunchemikalien 25 2.1.5 Primer 25 2.1.6 Puffer und Lösungen 26 2.1.7 Biologisches Material 28 2.2 Zellbiologische Methoden 29 2.2.1 Rekultivierung und Kryokonservierung von Zellen 29 2.2.2 Kultivierung der Zelllinien 29 2.2.3 Arretierung von Zellen in der Zellzyklusphase G1 30 2.2.4 Bestimmung der Zellzahl 30 2.2.5 Untersuchung der Zellvitalität 30 2.2.6 Untersuchung des Wachstumsverhaltens 31 2.2.7 Durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse 31 2.2.8 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen 32 2.3 Proteinbiochemische Methoden 32 2.3.1 Proteinextraktion 32 2.3.2 Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE 33 2.3.3 Elektrotransfer der Proteine auf eine Membran 33 2.3.4 Immunchemischer Antigennachweis 34 2.4 Molekularbiologische Methoden 35 2.4.1 RNA Präparation 35 2.4.2 DNase-Behandlung der isolierten RNA 35 2.4.3 Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) 35 2.4.4 Quantitative Echtzeit-RT-PCR 36 2.5 Histologische Methoden 38 2.5.1 Fixierung und Paraffineinbettung von Geweben 38 2.5.2 Immunfärbung der Paraffinschnitte 38 2.5.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung der Paraffinschnitte 39 2.6 Radiopharmakologische Methoden 39 2.6.1 Radiomarkierung der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 39 2.6.2 Stabilitätsuntersuchungen 42 2.6.3 Zelluläre Radiotracer-Aufnahme 43 2.6.4 Bioverteilung 44 2.6.5 Positronen-Emissions-Tomographie 44 2.6.6 Autoradiographie 45 2.7 Statistische Methoden 45 3 ERGEBNISSE 47 3.1 Untersuchungen zum Vorkommen der Cdk4/6 in Zellen und Geweben 47 3.1.1 Vorkommen der Cdk4/6 in Zellen 47 3.1.2 Vorkommen der Cdk4/6 in Tumoren 52 3.1.3 Vorkommen der Cdk4/6 in Organen der Maus 54 3.2 Zelluläre und molekulare Effekte der Pyrido[2,3-d]pyrimidin-Derivate 57 3.2.1 Vitalität und Zellproliferation 57 3.2.2 Zellzyklusphasenverteilung 62 3.2.3 pRb-Phosphorylierung 67 3.2.4 mRNA-Expression 70 3.3 Radiopharmakologische Charakterisierung ausgewählter 124I- bzw. 18F- markierter Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate 72 3.3.1 Radiomarkierung der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 72 3.3.2 Stabilitätsuntersuchungen in vitro 72 3.3.3 Zelluläre Radiotracer-Aufnahme 72 3.3.4 Bioverteilung und in vivo-Stabilität in Ratten 78 3.3.5 PET-Untersuchungen und Autoradiographie 81 4 DISKUSSION 87 4.1 Nachweis und Lokalisierung der Cdk4/6 in Zellen und Geweben 87 4.2 Zelluläre und molekulare Wirksamkeit der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 89 4.2.1 Hemmung der Zellproliferation 90 4.2.2 Hemmung der G1-Phasen-Progression 91 4.2.3 Hemmung des Cdk4/6-Cyclin D-pRb-E2F-Signalwegs 93 4.3 124I- und 18F-markierte Pyrido[2,3-d]pyrimidine als Radiotracer für die funktionelle Bildgebung der Cdk4/6 96 4.3.1 In vitro-Untersuchungen mit den radiomarkierten Pyrido[2,3-d]pyrimidinen 97 4.3.2 In vivo-Untersuchungen mit den radiomarkierten Pyrido[2,3-d]pyrimidinen 100 4.4 Schlussfolgerung und Ausblick 104 5 ZUSAMMENFASSUNG 106 6 LITERATURVERZEICHNIS 109 7 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE 118 8 DANKSAGUNG 120 9 VERSICHERUNG UND ERKLÄRUNG 121

Bien que l’utilité de la TEP au [18F]FDG soit confirmée pour le diagnostic et le suivi thérapeutique chez les patients atteints de lymphome, la spécificité de la captation du [18F]FDG a été mise en doute en raison de sa dépendance au métabolisme du glucose, qui peut augmenter dans des conditions bégnines comme les processus inflammatoire ou infectieux. Compte tenu de ces limites, un nucléoside a été développé en tant que nouvel outil pour l'imagerie TEP ([18F]fludarabine). Une radiosynthèse entièrement automatisée a été mise en place et des études précliniques ont été menées sur des modèles murins de xénogreffes (lignées cellulaires folliculaires: RL7 et DOHH-2, myélome multiple (MM) : RPMI8226, lymphome du système nerveux central (LSNC) : MC116), parallèlement au [18F]FDG. Le profil de distribution de la radioactivité de la [18F]fludarabine dans des organes sélectionnés a confirmé le ciblage spécifique de la tumeur. Dans un modèle de lymphome folliculaire, nous avons évalué sa fiabilité pendant le traitement par rituximab et démontré - pas d’interférence entre le traitement et sa captation - une plus forte corrélation entre la fixation de ce radiopharmaceutique et les valeurs quantitatives extraites de l'histologie, comparée au [18F]FDG-TEP. En conséquence, cet outil TEP peut être considéré comme une approche prometteuse pour détecter la maladie résiduelle persistante pendant ou après un traitement par chimiothérapie. En outre, l’évaluation de la [18F]fludarabine lors d’un processus inflammatoire induit par la térébenthine a montré une accumulation significativement plus faible dans le tissu inflammé par comparaison à celle observée avec le [18F]FDG. Dans le MM, le rôle de la [18F]FDG-TEP reste limité en raison de son manque de sensibilité pour détecter une atteinte diffuse de la moelle osseuse et de petites lésions crâniennes dues à la fixation physiologique du [18F]FDG dans le cerveau. Nos données suggèrent que la TEP à la [18F]fludarabine pourrait représenter une modalité alternative et peut-être plus spécifique pour l'imagerie de MM. Dans notre dernière étude, sur les tumeurs cérébrales de xénogreffes, ce nouvel outil TEP a révélé des réponses significativement divergentes entre le LSNC et le glioblastome (GBM), tandis que le [18F]FDG a montré un chevauchement de fixation entre ces deux modèles. Une première étude chez l'homme a été entreprise pour un diagnostic initial, où 10 patients non traités ont été recrutés avec une leucémie lymphoïde chronique à cellules B (LLC) ou un lymphome B diffus à grandes cellules (LBDGC). Les scanners partiels successifs ont été acquis pendant 250 mn après l’injection i.v d’une activité de 4MBq/kg. Les résultats avec les modalités conventionnelles (TDM et/ou [18F]FDG-TEP) ont également été considérés. L'étude a également été conçue pour estimer la dosimétrie pour les principaux organes. Chez les patients atteints d’un LBDGC, une augmentation de la captation a été observée dans les sites considérés anormaux par TDM et [18F]FDG ; chez deux patients, des résultats contradictoires ont été observés avec ces deux radiopharmaceutiques. Chez les patients LLC, la fixation de la [18F]fludarabine a coïncidé avec les sites susceptibles d'être impliqués et a montré une captation significative dans la moelle osseuse hématopoïétique. Aucune fixation n'a été observée, quel que soit le groupe de maladies, dans le muscle cardiaque et le cerveau. De plus, la dose efficace moyenne a été révélée inférieure à la dose efficace rapportée pour le [18F]FDG. En conclusion, ces résultats précliniques et cliniques ont révélé une grande spécificité de ce radiopharmaceutique pour les tissus lymphoprolifératifs. De plus, cela pourrait être un outil robuste pour quantifier plus précisément la maladie, même avec des processus inflammatoires, évitant ainsi les résultats faussement positifs, et une approche innovante pour l'imagerie des maladies lymphoprolifératives caractérisées par une faible activité mitotique. / Although PET using [18F]FDG has proved to be useful for diagnosis and therapy monitoring in patients with lymphoma, the specificity of [18F]FDG uptake has been critically questioned because of its dependence on glucose metabolism, which may indiscriminately increase in benign conditions such as inflammatory or infectious processes. Considering these drawbacks, an adenine nucleoside analogue was developed as a novel PET imaging probe ([18F]fludarabine). An efficient and fully automated radiosynthesis has been implemented and, subsequently preclinical studies in xenograft murine models (follicular cell lines: RL7 and DOHH-2, multiple myeloma (MM): RPMI8226, central nervous system (CNS) lymphoma: MC116) were conducted with this novel 18F-radiopharmaceutical in parallel with [18F]FDG. The pattern of the radioactivity distribution in selected organs confirmed the tumor-specific targeting. In a follicular lymphoma model, we evaluated its robustness during rituximab therapy and demonstrated - the treatment did not interfere with its uptake - a stronger correlation between quantitative values extracted from this 18F-radiopharmaceutical and histology when compared to [18F]FDG-PET. Accordingly, this PET tool may be considered as a promising approach for detecting the persistence of residual disease during or after rituximab-like treatment. Furthermore, its behaviour in turpentine-induced inflammatory process showed significantly weaker uptake in inflammation when compared to [18F]FDG. In MM, the role of [18F]FDG-PET remains limited because of its lack of sensitivity for detecting diffuse bone marrow involvement, small skull lesions due to the physiological [18F]FDG uptake in brain. Our data suggested that [18F]fludarabine-PET might represent an alternative and perhaps more specific modality for MM imaging. In our latest study, on xenograft brain tumors, this novel PET probe revealed significantly divergent responses between CNS lymphoma and glioblastoma (GBM), while [18F]FDG demonstrated overlap between the groups. A first in man study, was undertaken, for an initial diagnosis, where 10 untreated patients were enrolled with either B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) or diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Successive partial body scans were acquired for 250 min after i.v. injection with an activity of 4 MBq/kg. The results with conventional modalities (CT and/or [18F]FDG-PET) have also been investigated. The study was also designed to estimate its radiation dose for major organs. In DLBCL patients, increased uptake was observed in sites considered abnormal by CT and [18F]FDG; in two patients discrepancies were observed in comparison with [18F]FDG. In CLL patients, the uptake coincided with sites expected to be involved and displayed a significant uptake in hematopoietic bone marrow. No uptake was observed, whatever the disease group, in the cardiac muscle and brain. Moreover, its mean effective dose was below the effective dose reported for [18F]FDG. In conclusion, these preclinical and clinical findings revealed a great specificity of this 18F-radiopharmaeutical for lymphoma tissues. Furthermore, it might well be a robust tool for correctly quantifying the disease, even with inflammatory processes, thus avoiding the false-positive results, and an innovative approach for imaging lymphoid neoplasms with low mitotic activity.

In dieser Arbeit wird über die Entwicklung von neuartigen PET-Tracern für die In-vivo-Bildgebung von Cystein-Cathepsinen, Lysyloxidasen und Transglutaminase 2 als tumorassoziierte Matrix-modifizierende Enzyme berichtet. Dies beinhaltet im Einzelnen die Identifikation von Leitverbindungen, die Synthese und biochemische Charakterisierung von Analoga, die Etablierung von Methoden für deren Radiomarkierung sowie radiopharmakologische Untersuchungen auf molekularer, zellulärer und organismischer Ebene. In Kapitel 1 dieser Habilitationsschrift wird zunächst auf die Bedeutung der extrazellulären Matrix für die Tumorprogression eingegangen, wobei auch der Entwicklungsstatus Matrix-gerichteter Bildgebungssonden gestreift wird. Da die Hemmung der genannten Enzyme über die bildgebende funktionelle Diagnostik von Tumoren hinaus großes Potential im Hinblick auf die Pharmakotherapie neoplastischer Erkrankungen aufweist, wurde am Schluss von Kapitel 1 ebenso die generelle Bedeutung der PET- und SPECT-Bildgebung für den Prozess der Arzneistoffentwicklung dargelegt, da eine weitere Motivation dieser Arbeit in der Entwicklung von Sonden zur bildgebungsgestützten Therapie lag. Im Kapitel 2 wird eine Übersicht über strukturelle und funktionelle Aspekte der aufgeführten Matrix-modifizierenden Enzyme unter besonderer Berücksichtigung ihrer jeweiligen Funktion im Tumorgeschehen gegeben. Daran anschließend wird in den Kapiteln 3 und 4 der Stand zur Entwicklung von Inhibitoren bzw. Bildgebungssonden für diese Enzyme im Überblick dargestellt. Die Ergebnisse der Arbeit werden im Kapitel 5 präsentiert, wobei die sich Gliederung dieses Kapitels an den publizierten Arbeiten orientiert, die in diese kumulative Habilitationsschrift Eingang gefunden haben. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um eine Kurzdarstellung der veröffentlichten Originalartikel, die durch weiterführende Aspekte ergänzt wurden, um den Bezug zwischen den einzelnen Arbeiten herzustellen. Kapitel 6 gibt eine kurze Gesamtzusammenfassung der Arbeit, an das Literaturverzeichnis in Kapitel 7 schließt sich mit Kapitel 8 die kumulative Zusammenstellung der zum Thema der Arbeit vom Autor veröffentlichten Zeitschriftenartikel an.:Vorbemerkungen und Zielstellung 1 1. Einführung 3 1.1. Bedeutung der extrazellulären Matrix für die Tumorprogression 3 1.2. Radiomarkierte Sonden zur Bildgebung der tumorassoziierten extrazellulären Matrix 14 1.3. Bedeutung der radiotracerbasierten Bildgebung in der Wirkstoffentwicklung 19 2. Strukturelle und biochemische Aspekte von Matrix-modifizierenden Enzymen: Cystein-Cathepsine, Lysyloxidasen und Transglutaminase 2 24 2.1. Cystein-Cathepsine 24 2.2. Funktionen von Cystein-Cathepsinen in der Tumorprogression 27 2.3. Lysyloxidasen 32 2.4. Funktionen von Lysyloxidasen in der Tumorprogression 36 2.5. Transglutaminase 2 42 2.6. Funktionen der Transglutaminase 2 in der Tumorprogression 46 3. Stand der Entwicklung von Inhibitoren der betrachteten Matrix-modifizierenden Enzyme 50 3.1. Inhibitoren von Cystein-Cathepsinen 50 3.2. Inhibitoren von Lysyloxidasen 61 3.3. Inhibitoren der Transglutaminase 2 64 4. Stand der Entwicklung von Bildgebungssonden für die betrachteten Matrix-modifizierenden Enzyme 70 4.1. Sonden für Cystein-Cathepsine 70 4.2. Sonden für Lysyloxidasen 74 4.3. Sonden für die Transglutaminase 2 76 5. Eigene Arbeiten zur Entwicklung von Radiotracern einschließlich der Identifikation, Synthese und Evaluierung geeigneter Liganden zur Bildgebung der vorgestellten Targetklassen 80 5.1. Entwicklung zu Cystein-Cathepsine 80 5.1.1. Auswahl der Leitverbindungen 80 5.1.2. Synthese und radiopharmakologische Charakterisierung eines 18F-markierten Azadipeptidnitrils 81 5.1.3. Synthese und radiopharmakologische Charakterisierung eines 11C-markierten Azadipeptidnitrils 87 5.1.4. Cyanohydrazide als potentielle chemoselektive Markierungsbausteine 91 5.1.5. Zusammenfassung und Ausblick 94 5.2. Lysyloxidasen 95 5.2.1. Auswahl der Leitverbindungen 95 5.2.2. Entwicklung einer Methode zur regioselektiven Markierung von Peptiden mit Fluor-18 97 5.2.3. Synthese und Konformationsanalyse eines N-Telopeptid-abgeleiteten Cyclopeptids 103 5.2.4. Radiopharmakologische Charakterisierung von N-Telopeptid-abgeleiteten Peptiden im Melanom-Xenograft-Mausmodell 109 5.2.5. Radiopharmakologische Charakterisierung eines N-Telopeptid-abgeleiteten Peptides in murinen Mammakarzinommodellen 114 5.2.6. Zusammenfassung und Ausblick 118 5.3. Transglutaminase 2 121 5.3.1. Auswahl der Leitverbindungen 121 5.3.2. Entwicklung von Assaymethoden und Synthese der dafür benötigten Substratverbindungen 123 5.3.3. Synthese und in-vitro-pharmakologische Charakterisierung von Nε-Acryloyllysinpiperaziden als irreversible Inhibitoren 137 5.3.4. 18F-Markierung und radiopharmakologische Charakterisierung eines Nε-Acryloyllysinpiperazids als aktivitätsbasierte Sonde 152 5.3.5. Zusammenfassung und Ausblick 167 6. Zusammenfassung und Schlussfolgerungen / Summary and Conclusions 171 7. Literaturverzeichnis 177 8. Kumulative Zusammenstellung der publizierten Arbeiten 243 8.1. Veröffentlichte Arbeiten zur Entwicklung Cystein-Cathepsin-gerichteter Radiotracer und Cyanohydraziden als potentielle Markierungsbausteine 243 8.1.1. Übersichtsartikel: “Cysteine cathepsins: their role in tumor progression and recent trends in the development of imaging probes” 243 8.1.2. Originalartikel: “Synthesis and Radiopharmacological Characterisation of a Fluorine-18-Labelled Azadipeptide Nitrile as a Potential PET Tracer for in vivo Imaging of Cysteine Cathepsins” 280 8.1.3. Originalartikel: “Synthesis and Radiopharmacological Characterisation of an 11C‐labelled azadipeptide nitrile as potential PET tracer for imaging of cysteine cathepsins” 304 8.1.4. Originalartikel: “Synthesis and X-ray Crystal Structure of N’-Cyano-N,N’-dimethyl-4-nitrobenzohydrazide” 319 8.2. Veröffentlichte Arbeiten zur Entwicklung Lysyloxidase-gerichteter Radiotracer und zur selektiven 18F-Markierung Lysin-enthaltender Peptide 328 8.2.1. Originalartikel: “Site-selective radiolabeling of peptides by 18F-fluorobenzoylation with [18F]SFB in solution and on solid phase: a comparative study” 328 8.2.2. Originalartikel: “Synthesis, 18F-labelling and radiopharmacological characterisation of the C-terminal 30mer of Clostridium perfringens enterotoxin as a potential claudin-targeting peptide” 350 8.2.3. Originalartikel: “Cyclopeptides containing the DEKS motif as conformationally restricted collagen telopeptide analogues: synthesis and conformational analysis” 388 8.2.4. Originalartikel: “ Evaluation of Fluorine-18-Labeled α1(I)-N-Telopeptide Analogs as Substrate-Based Radiotracers for PET Imaging of Melanoma-Associated Lysyl Oxidase” 428 8.2.5. Originalartikel: “Targeting lysyl oxidase for molecular imaging in breast cancer” 453 8.3. Veröffentlichte Arbeiten zur Entwicklung von TGase 2-gerichteten Radiotracern sowie von Substratverbindungen und Assaymethoden für dieses Enzym 470 8.3.1. Übersichtsartikel: “Tissue transglutaminase: An emerging target for therapy and imaging” 470 8.3.2. Originalartikel: ”Synthesis and Kinetic Characterisation of Water‐Soluble Fluorogenic Acyl Donors for Transglutaminase 2“ 487 8.3.3. Originalartikel: “Solution-phase synthesis of the fluorogenic TGase 2 acyl donor Z-Glu(HMC)-Gly-OH and its use for inhibitor and amine substrate characterisation” 543 8.3.4. Originalartikel: “A fluorescence anisotropy-based assay for determining the activity of tissue transglutaminase” 562 8.3.5. Originalartikel: “Nε-Acryloyllysine Piperazides as Irreversible Inhibitors of Transglutaminase 2: Synthesis, Structure–Activity Relationships, and Pharmacokinetic Profiling” 589 / This work reports on the development of novel PET tracers for in vivo imaging of cysteine cathepsins, lysyl oxidases and transglutaminase 2 as tumour-associated matrix-modifying enzymes. Specifically, this includes the identification of lead compounds, the synthesis and biochemical characterisation of analogues, the establishment of methods for their radiolabelling, and radiopharmacological studies at the molecular, cellular and organismal levels. Chapter 1 of this habilitation thesis first discusses the importance of the extracellular matrix for tumour progression: In addition, the development status of matrix-directed imaging probes is reviewed. Since the inhibition of the aforementioned enzymes has great potential beyond the imaging functional diagnosis of tumours with regard to the pharmacotherapy of neoplastic diseases, the general importance of PET and SPECT imaging for the drug development process was also outlined at the end of chapter 1, since a further motivation of this thesis was provided by the potential use of probes for imaging-assisted therapy. In chapter 2, an overview of structural and functional aspects of the listed matrix-modifying enzymes is given with particular reference to their respective function in tumour processes. This is followed by an overview of the status of the development of inhibitors and imaging probes for these enzymes in chapters 3 and 4. The results of the work are presented in chapter 5, whereby the structure of this chapter is oriented towards the published work that has found its way into this cumulative habilitation thesis. This chapter is essentially a brief presentation of the original published articles, supplemented by further aspects to establish the relationship between the individual papers. Chapter 6 provides a brief overall summary of the thesis, and the bibliography in Chapter 7 is followed by Chapter 8, which provides a cumulative compilation of the journal articles published by the author on the topic of the thesis.:Vorbemerkungen und Zielstellung 1 1. Einführung 3 1.1. Bedeutung der extrazellulären Matrix für die Tumorprogression 3 1.2. Radiomarkierte Sonden zur Bildgebung der tumorassoziierten extrazellulären Matrix 14 1.3. Bedeutung der radiotracerbasierten Bildgebung in der Wirkstoffentwicklung 19 2. Strukturelle und biochemische Aspekte von Matrix-modifizierenden Enzymen: Cystein-Cathepsine, Lysyloxidasen und Transglutaminase 2 24 2.1. Cystein-Cathepsine 24 2.2. Funktionen von Cystein-Cathepsinen in der Tumorprogression 27 2.3. Lysyloxidasen 32 2.4. Funktionen von Lysyloxidasen in der Tumorprogression 36 2.5. Transglutaminase 2 42 2.6. Funktionen der Transglutaminase 2 in der Tumorprogression 46 3. Stand der Entwicklung von Inhibitoren der betrachteten Matrix-modifizierenden Enzyme 50 3.1. Inhibitoren von Cystein-Cathepsinen 50 3.2. Inhibitoren von Lysyloxidasen 61 3.3. Inhibitoren der Transglutaminase 2 64 4. Stand der Entwicklung von Bildgebungssonden für die betrachteten Matrix-modifizierenden Enzyme 70 4.1. Sonden für Cystein-Cathepsine 70 4.2. Sonden für Lysyloxidasen 74 4.3. Sonden für die Transglutaminase 2 76 5. Eigene Arbeiten zur Entwicklung von Radiotracern einschließlich der Identifikation, Synthese und Evaluierung geeigneter Liganden zur Bildgebung der vorgestellten Targetklassen 80 5.1. Entwicklung zu Cystein-Cathepsine 80 5.1.1. Auswahl der Leitverbindungen 80 5.1.2. Synthese und radiopharmakologische Charakterisierung eines 18F-markierten Azadipeptidnitrils 81 5.1.3. Synthese und radiopharmakologische Charakterisierung eines 11C-markierten Azadipeptidnitrils 87 5.1.4. Cyanohydrazide als potentielle chemoselektive Markierungsbausteine 91 5.1.5. Zusammenfassung und Ausblick 94 5.2. Lysyloxidasen 95 5.2.1. Auswahl der Leitverbindungen 95 5.2.2. Entwicklung einer Methode zur regioselektiven Markierung von Peptiden mit Fluor-18 97 5.2.3. Synthese und Konformationsanalyse eines N-Telopeptid-abgeleiteten Cyclopeptids 103 5.2.4. Radiopharmakologische Charakterisierung von N-Telopeptid-abgeleiteten Peptiden im Melanom-Xenograft-Mausmodell 109 5.2.5. Radiopharmakologische Charakterisierung eines N-Telopeptid-abgeleiteten Peptides in murinen Mammakarzinommodellen 114 5.2.6. Zusammenfassung und Ausblick 118 5.3. Transglutaminase 2 121 5.3.1. Auswahl der Leitverbindungen 121 5.3.2. Entwicklung von Assaymethoden und Synthese der dafür benötigten Substratverbindungen 123 5.3.3. Synthese und in-vitro-pharmakologische Charakterisierung von Nε-Acryloyllysinpiperaziden als irreversible Inhibitoren 137 5.3.4. 18F-Markierung und radiopharmakologische Charakterisierung eines Nε-Acryloyllysinpiperazids als aktivitätsbasierte Sonde 152 5.3.5. Zusammenfassung und Ausblick 167 6. Zusammenfassung und Schlussfolgerungen / Summary and Conclusions 171 7. Literaturverzeichnis 177 8. Kumulative Zusammenstellung der publizierten Arbeiten 243 8.1. Veröffentlichte Arbeiten zur Entwicklung Cystein-Cathepsin-gerichteter Radiotracer und Cyanohydraziden als potentielle Markierungsbausteine 243 8.1.1. Übersichtsartikel: “Cysteine cathepsins: their role in tumor progression and recent trends in the development of imaging probes” 243 8.1.2. Originalartikel: “Synthesis and Radiopharmacological Characterisation of a Fluorine-18-Labelled Azadipeptide Nitrile as a Potential PET Tracer for in vivo Imaging of Cysteine Cathepsins” 280 8.1.3. Originalartikel: “Synthesis and Radiopharmacological Characterisation of an 11C‐labelled azadipeptide nitrile as potential PET tracer for imaging of cysteine cathepsins” 304 8.1.4. Originalartikel: “Synthesis and X-ray Crystal Structure of N’-Cyano-N,N’-dimethyl-4-nitrobenzohydrazide” 319 8.2. Veröffentlichte Arbeiten zur Entwicklung Lysyloxidase-gerichteter Radiotracer und zur selektiven 18F-Markierung Lysin-enthaltender Peptide 328 8.2.1. Originalartikel: “Site-selective radiolabeling of peptides by 18F-fluorobenzoylation with [18F]SFB in solution and on solid phase: a comparative study” 328 8.2.2. Originalartikel: “Synthesis, 18F-labelling and radiopharmacological characterisation of the C-terminal 30mer of Clostridium perfringens enterotoxin as a potential claudin-targeting peptide” 350 8.2.3. Originalartikel: “Cyclopeptides containing the DEKS motif as conformationally restricted collagen telopeptide analogues: synthesis and conformational analysis” 388 8.2.4. Originalartikel: “ Evaluation of Fluorine-18-Labeled α1(I)-N-Telopeptide Analogs as Substrate-Based Radiotracers for PET Imaging of Melanoma-Associated Lysyl Oxidase” 428 8.2.5. Originalartikel: “Targeting lysyl oxidase for molecular imaging in breast cancer” 453 8.3. Veröffentlichte Arbeiten zur Entwicklung von TGase 2-gerichteten Radiotracern sowie von Substratverbindungen und Assaymethoden für dieses Enzym 470 8.3.1. Übersichtsartikel: “Tissue transglutaminase: An emerging target for therapy and imaging” 470 8.3.2. Originalartikel: ”Synthesis and Kinetic Characterisation of Water‐Soluble Fluorogenic Acyl Donors for Transglutaminase 2“ 487 8.3.3. Originalartikel: “Solution-phase synthesis of the fluorogenic TGase 2 acyl donor Z-Glu(HMC)-Gly-OH and its use for inhibitor and amine substrate characterisation” 543 8.3.4. Originalartikel: “A fluorescence anisotropy-based assay for determining the activity of tissue transglutaminase” 562 8.3.5. Originalartikel: “Nε-Acryloyllysine Piperazides as Irreversible Inhibitors of Transglutaminase 2: Synthesis, Structure–Activity Relationships, and Pharmacokinetic Profiling” 589

RESUME: Le travail de recherche rapporté dans cette thèse concerne lamélioration de traceurs marqués au fluor-18 utilisés en routine clinique : la 2-[18F]fluoro-L-tyrosine et le 2-désoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose. Les résultats relatifs à lacide aminé, de valeur confirmative pour les connaissances publiées antérieurement dans la littérature, consistent en une validation chez le rat qui entérine le potentiel de ce traceur pour létude de la vitesse de synthèse des protéines cérébrales in vivo. Les perspectives futures pour ce traceur sont dès lors lextension de son utilité dans le domaine de loncologie et son utilisation pour létude de phénomènes physiologiques neurologiques. Durant ce travail, des techniques décrites dans la littérature, mais non pratiquées au CRC ont fait lobjet dune implémentation et sont maintenant accessibles (modèle du rat vigile, méthodes de synthèse de polymères à empreinte moléculaire). La partie principale du travail concerne la récupération du [18F]fluorure et son utilisation pour le marquage nucléophile sans étape dévaporation. La synthèse du 2-désoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose a servi de réaction témoin pour tester lapplicabilité des méthodes développées dans ce cadre. Deux stratégies différentes, lune utilisant des supports ioniques et des solvants protiques, lautre utilisant des supports non ioniques et des solvants non protiques, ont permis datteindre les buts fixés avec des rendements dincorporation du [18F]fluorure de même ordre de grandeur que ceux obtenus en radiochimie usuelle du fluor-18. La méthode utilisant les supports non ioniques a par ailleurs démontré sa grande généralité vis-à-vis de précurseurs divers, aliphatiques et aromatiques, dans des conditions de marquage diverses, notamment à température modérée. Les perspectives de ces méthodes nouvelles pour la fabrication des traceurs TEP tirent parti de la possibilité de les implanter dans un automate miniaturisé (milli- ou micro-réacteur), à visée synthétique ou analytique. Lefficacité et la simplicité des méthodes de récupération sans évaporation mises au point dans ce travail les destinent à être utilisées aussi bien en développement des traceurs quen synthèse de routine. Elles sont applicables aussi bien à léchelle des automates courants quà celle des futures applications microfluidiques. Par ailleurs, nous sommes persuadés de lintérêt des polymères à empreinte moléculaire dans le créneau des méthodes analytiques. Egalement applicables à des systèmes miniaturisés, ils devraient aider à la réalisation danalyses automatisées des produits finis et à une libération accélérée. Le gain de temps et les moindres pertes de principe actif conduiront alors à une meilleure disponibilité des traceurs TEP et à leur participation accrue aux objectifs de la médecine personnalisée. Nous pensons dès lors avoir ouvert quelques pistes de recherche prometteuses pour la mise en application de ses nouvelles technologies au domaine de la tomographie à émission de positon. / SUMMARY: The results reported in this work concern the improvement of 18-fluorine labelled radiopharmaceuticals used in routine clinical applications: 2-[18F]fluoro-L-tyrosine and 2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose. The study of the metabolism of non carrier added 2-[18F]fluoro-L-tyrosine in rats confirms that this tracer is rapidly and extensively incorporated into cerebral proteins and is therefore well suited to the assessment of Protein Synthesis Rate (PSR) in vivo by PET. A correction for the appearance of metabolites is advised for quantitative interpretation of the data. An improvement in the radiosynthesis is necessary to make 2-[18F]fluoro-L-tyrosine widely available for its application in oncology and to envisage the extended use of this tracer for the study of the protein synthesis in other physiological or pathological processes. The second chapter deals with use of molecular imprints in the PET radiochemistry. The molecularly imprinted polymers were synthetized, characterized and tested for the production of specific PET tracers and the plasma analysis of the parent metabolites. The third part of the work consisted in a development of new methods for the [18F]fluoride recovery in order to permit the labelling of different precursors through nucleophilic substitution without the evaporation step classically performed in 18-fluorine radiochemistry. The synthesis of 2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose has been used as a tool for the evaluation of the developed methods. Two strategies were considered to concentrate and recover the [18F]fluoride. The first one used ionic solid supports and protic solvents. The second one relied on the use of non ionic solid supports and non protic solvents. Both strategies led us to reach [18F]fluoride incorporation yields as high as in classical radiosyntheses with evaporation. Ionic liquids and tertiary alcohols were also evaluated in order to improve the tolerance of the [18F]fluoride nucleophilic substitution to water. The molecularly imprinted polymers and the new methods for the recovery of [18F]fluoride will now be tested for the implementation of PET tracers radiosynthesis and quality control into microchip devices.

Das S100A4-Protein ist für die Manifestierung eines metastatischen Phänotyps bei vielen Tumorarten von enormer Bedeutung. Die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und der Interaktionspartner von S100A4 stellt daher einen vielsprechenden Forschungsansatz dar, um neue Erkenntnisse über das Verhalten von Tumorzellen während des Metastasierungsprozesses zu erhalten. Darauf aufbauend können neue Ansatzpunkte für die Therapie metastasierender Krebserkrankungen gewonnen werden. In dieser Hinsicht ist das bisher einer Behandlung kaum zugängliche maligne Melanom als besonders aggressiver und frühzeitig metastasierender Tumor ein ideales Modell zur Aufklärung der zellulären und molekularen Prozesse, über die S100A4 seine Metastasen-fördernden Wirkungen ausübt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung der S100A4-RAGE-Interaktion sowie die Untersuchung der Beteiligung von S100A4 an Prozessen der Metastasierungskaskade in vitro und in vivo. Dies erforderte die Herstellung von rekombinantem S100A4-Protein und die Generierung von stabil mit S100A4-transfizierten Melanomzellen, die damit eine heraufregulierte S100A4-Proteinbiosynthese aufweisen. Die Gewinnung von rekombinantem S100A4 in biologisch funktioneller Form unter Verwendung eines prokaryotischen Expressionssystems erfolgte mit einem Reinheitsgrad von ca. 92%. Das rekombinante S100A4-Protein wurde mit dem Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat radioaktiv markiert und charakterisiert. Es wurde die Interaktion zwischen S100A4 bzw. 18F-markiertem S100A4 und der löslichen RAGE-Isoform sRAGE mit einer moderaten Bindungsaffinität im µM-Bereich nachgewiesen. Des Weiteren erfolgte erstmals die Analyse der radiopharmakologischen Eigenschaften von 18F-S100A4 mittels Untersuchungen zur zellulären Assoziation sowie zur metabolischen Stabilität, Bioverteilung und zu In-vivo-Interaktionen mittels Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie in der Ratte. Die In-vitro-Experimente wurden an Endothelzellen (HAEC) und an stabil mit RAGE-transfizierten A375-, A375-mock bzw. nicht transfizierten A375-Melanomzellen durchgeführt. Die A375-hRAGE-Zellen zeigten eine deutlich heraufregulierte RAGE-Proteinbiosynthese während die Endothelzellen eine vergleichsweise geringe intrazelluläre RAGE-Proteinkonzentration aufwiesen. Bei den Melanomzellen kann aufgrund der höheren Assoziation von 18F-S100A4 an A375-hRAGE-Zellen auf eine selektive Bindung von 18F S100A4 an RAGE-Rezeptoren auf der Zelloberfläche geschlossen werden. Die Assoziation von 18F S100A4 an Endothelzellen war bei 37°C in Gegenwart von nicht markiertem rekombinantem S100A4 signifikant vermindert, dementsprechend findet eine spezifische Interaktion von 18F-S100A4 mit Zelloberflächenrezeptoren der Endothelzellen statt. Dieses Ergebnis und die insgesamt höhere Bindung von 18F S100A4 an Endothelzellen im Vergleich zur Assoziation an Melanomzellen lassen neben RAGE noch andere Rezeptoren wie z. B. internalisierende Scavenger-Rezeptoren vermuten. Die In-vivo-Stabilitätsuntersuchungen verdeutlichen einen proteolytischen Abbau von 18F S100A4, allerdings belegen das Vorhandensein von 67% intaktem 18F-S100A4-Protein nach einer Stunde, die Stabilität von 18F-S100A4 in vivo. Die Bioverteilungs- bzw. PET-Untersuchungen zeigen eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende hohe Akkumulation in den Nieren und verdeutlichen somit die renale Ausscheidung von 18F S100A4. Die maßgeblichen Anreicherungen in Milz, Leber, Blut, Lunge und Nebennieren lassen Interaktionen mit Oberflächenrezeptoren dieser Gewebe erkennen. Die temporäre Retention von 18F-S100A4 in der Lunge, dem Hauptsyntheseorgan von RAGE, und die verminderte 18F-S100A4-Akkumulation in Gegenwart des spezifischen RAGE-Liganden glykLDL ist ein Hinweis dafür, dass S100A4 in vivo in der Lunge an RAGE bindet. Die Aktivitätsanreicherungen in Milz, Leber und Nebenniere deuten aufgrund der geringeren RAGE-Synthese in diesen Organen auf die Interaktion von 18F-S100A4 mit anderen Zelloberflächenrezeptoren z. B. aus der Familie der Scavenger-Rezeptoren hin. Die Beteiligung von S100A4 an Metastasierungsprozessen des malignen Melanoms wurde an stabil mit S100A4-transfizierten A375-Melanomzellen, die eine Heraufregulierung der humanen bzw. murinen S100A4-Proteinbiosynthese im Vergleich zu A375-mock- (Vektor-Kontrolle) und nicht-transfizierten A375-Zellen zeigen, untersucht. Die A375-hS100A4-Zellen sezernierten zudem eine signifikant höhere S100A4-Proteinkonzentration in das umgebende Zellkulturmedium im Vergleich zu den Kontrollen. In dieser Hinsicht konnte bei den A375-hS100A4-Zellen, vermutlich aufgrund der höheren extrazellulären S100A4-Konzentration, eine gesteigerte Proliferations-, Motilitäts-, Migrations- und Invasionsrate gegenüber den A375-mock- und A375-Zellen nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang stehen ebenso die gesteigerte RAGE-Proteinbiosynthese und die signifikant höhere Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB bei A375-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Kulturmedium der A375-hS100A4-Zellen. Demnach wirkt vermutlich das extrazelluläre S100A4-Protein als autokriner bzw. parakriner Regulator von RAGE und NF κB. Die subkutane Injektion der A375- und stabil transfizierten A375-Melanomzellen in Nacktmäuse führte zur Entwicklung subkutaner Tumore an der Injektionsstelle. Bereits zwei Wochen nach der Injektion etablierten die A375-hS100A4-Zellen die signifikant größeren Tumore im Vergleich zu den A375-mS100A4-, A375-mock und A375-Zellen. Nach Injektion der Zellen in die Schwanzvene der Nacktmäuse konnte keine Entwicklung von Metastasen im Tierkörper festgestellt werden. IN DER VORLIEGENDEN ARBEIT WURDE NACHGEWIESEN: • RAGE ist ein Rezeptor für das S100A4-Protein. Allerdings gibt es eindeutige Hinweise für weitere S100A4-Zielproteine an der Zelloberfläche. • Die bedeutende Rolle von extrazellulärem S100A4 bei wichtigen zellulären Metastasierungsprozessen sowie bei der Aktivierung von Signalproteinen wie NF-κB und RAGE beim malignen Melanom. Die weitere Aufklärung der S100A4-spezifischen Signalkaskaden und Rezeptoren bei metastasierenden Tumorerkrankungen sowie die Charakterisierung von S100A4 als klinischen Parameter bei Patienten mit malignem Melanom stellen hoch interessante Aspekte in der Krebsforschung dar.