Devant l’augmentation de l’incidence des cancers de prostate de faible risque, les thérapies focales apparaissent comme une alternative séduisante entre la surveillance active et les traitements radicaux classiques. Les thérapies Laser (Thérapie photodynamique [PDT] et thermothérapie laser interstitielle [LITT]) pourraient être des modalités d’application de cette thérapie focale.Dans la première partie de cette thèse, nous discutons du concept de thérapie focale, et de la place des thérapies Laser par rapport aux différentes autres modalités énergétiques. Le premier chapitre de cette partie est consacré à l’émergence de la thérapie focale, à ses bases histopathologiques et à l’importance de l’imagerie dans son application. L’échographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) représentent des outils indispensables pour l’aide au diagnostic, la sélection des patients et le guidage du traitement focal. Les avantages et inconvénients ainsi que les principaux résultats cliniques des différentes modalités énergétiques utilisées pour la thérapie focale sont présentés dans le deuxième chapitre de cette partie. Nous dressons un état de l’art de la PDT et de la LITT pour le traitement focal dans un troisième chapitre. Ces thérapeutiques Laser sont actuellement en développement clinique. Ces deux modalités de traitement reposent sur des principes physiques différents, mais leur application à la thérapie focale pose des problématiques identiques (planification dosimétrique, guidage du traitement interstitiel). Nous précisons les développements actuellement en cours pour résoudre ces problématiques et notamment les travaux de notre unité de recherche. La deuxième partie de cette thèse est dédiée au développement expérimental de LITT pour le cancer de prostate menée au sein de notre unité de recherche. Dans le premier chapitre de cette partie, nous présentons la mise en place d’un modèle animal (Rat Copenhagen avec greffe hétérotopique d’un adénocarcinome prostatique syngénique Dunning R3327-AT2) adapté au traitement par LITT focale. Nous décrivons le monitoring de cette thérapie sous IRM et échographie et démontrons la reproductibilité des volumes de nécrose induits pour un niveau d’énergie donné. Le deuxième chapitre de cette partie est consacré à la mise en place d’un outils de planification dosimétrique adapté à notre modèle in vivo et basé sur la diffusion de chaleur au sein des tissus et au calcul des dommages cellulaires. Enfin dans le troisième chapitre, nous proposons la mise en place d’un fantôme de prostate anatomiquement valide permettant de simuler et d’expérimenter des procédures focales de LITT. Ce fantôme compatible avec un monitoring sous échographie et sous IRM pourrait également être utilisé pour le développement d’autres modalités énergétiques de thérapie focale. / Given the increased incidence of prostate cancer low-risk, focal therapies appear as an attractive alternative between active surveillance and radical treatments. Laser therapies (photodynamic therapy [PDT] and interstitial laser thermotherapy [LITT]) could be modalities of application of this focal therapy.In the first section of this thesis, we discuss the concept of focal therapy, and the place of laser therapies compared to several other energy modalities. The first chapter of this section is devoted to the emergence of focal therapy, its histopathologic bases and the importance of imaging in its application. Ultrasonography and magnetic resonance imaging (MRI) are essential tools to aid diagnosis, patient selection and guidance of focal treatment. The advantages and disadvantages and the main clinical outcomes of different energy modalities used for focal therapy are presented in the second chapter of this section. We summarize a state of the art of PDT and LITT for the focal treatment in a third chapter. These Laser therapies are currently in clinical development. Both treatment modalities are based on different physical principles but their application to focal therapy raises identical issues (treatment planning, guiding interstitial treatment). We specify the developments currently underway to address these issues and particularly the work of our research unit.The second section of this thesis is dedicated to the experimental development of LITT for prostate cancer conducted in our research unit. In the first chapter of this section, we present the development of an animal model (rat Copenhagen with heterotopic and syngenic prostatic adenocarcinoma transplant Dunning R3327 -AT2) for processing focal LITT. We describe the monitoring of this therapy under ultrasonography and MRI and demonstrate the reproducibility of the volumes of necrosis induced for one given energy level. The second chapter of this section is devoted to the establishment of a treatment planning tools adapted to our in vivo model and based on tissue heat diffusion and calculation of induced cell damages. Finally in the third chapter, we propose the establishment of an anatomically valid prostate phantom to simulate and test focal LITT procedures. This phantom compatible with ultrasonography and MRI monitoring could also be used for the development of other focal therapy energy modalities.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2006. / Bibliogr.: f. 232-246. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

L'activation des cellules endothéliales par le vascular endothelial growth factor (VEGF) conduit à la formation d'un complexe contenant le VEGFR2 et l'intégrine avp3. Dans ce projet de recherche, nous avons cherché à déterminer les mécanismes par lesquels l'association des récepteurs VEGFR2- avp3 régule l'activation de la kinase d'adhérence focale (FAK) par le VEGF. La constitution du complexe VEGFR2-avp3 est associée au recrutement de la protéine chaperonne Heat shock protein 90 (HSP90) sur le VEGFR2. L'interaction de ce dernier avec HSP90 implique les 130 derniers acides aminés du récepteur et est nécessaire à l'activation de la petite GTPase RhoA et de la RhoA dépendant kinase (ROCK) en réponse au VEGF. L'activation de la kinase ROCK conduit par la suite et de manière directe, à la phosphorylation de FAK sur le résidu serine 732. Ceci entraîne un changement de conformation dans la structure tridimensionnelle de FAK qui rend son résidu tyrosine 407 accessible à la phosphorylation par un membre de la famille de protéines FAK à activité tyrosine kinase non récepteur : la Proline-rich tyrosine kinase- 2 (Pyk2). Pyk2 est en effet activée par le VEGF en aval de l'intégrine av|33. Ces résultats ont été confirmés par l'utilisation de siRNA ciblant ROCK et Pyk2. La phosphorylation des résidus serine 732 et tyrosine 407 sont tous deux impliqués dans le recrutement de la vinculine aux plaques ventrales dans les cellules endothéliales en réponse au VEGF. Finalement, en utilisant des cellules embryonnaires MEF FAK-/- et des siRNA ciblant FAK dans les cellules HUVEC, nous avons démontré le rôle crucial de la phosphorylation de ces deux résidus dans la migration cellulaire. Nos résultats montrent pour la première fois que l'activation des voies VEGFR2/ HSP90/ ROCK-Ser732 et de l'intégrine avp3/ Pyk2-Y407 en réponse au VEGF sont toutes deux nécessaires aux fonctions par lesquelles FAK régule le recrutement de protéines aux points focaux d'adhérence et la migration cellulaire. / Exposure of endothelial cells to vascular endothelial growth factor (VEGF) induces the formation of an oligomeric complex that contains VEGFR2 and integrin avp3. In the present study, we investigated the mechanisms by which HSP90 and the VEGFR2-avp3 integrin complex regulates VEGF-dependant phosphorylation of Focal Adhesion Kinase (FAK). We show that the formation of this complex of receptors is associated with the recruitment of the chaperon Heat shock protein 90 (HSP90) on VEGFR2. The VEGR2/HSP90 interaction implicates the last 130 amino acids of VEGFR2 and is necessary for the activation of the RhoA small GTPase and RhoA-dependant kinase (ROCK). Then, ROCK activation triggers the direct phosphorylation of FAK on serine residue 732. In turn, phosphorylation of Ser732 changes the conformation of FAK making the tyrosine residue 407 accessible to a member of the FAK family of nonreceptor protein tyrosine kinases, the Proline rich tyrosine kinase 2 (Pyk2). In fact, we show that Pyk2 is activated in response to VEGF-dependant activation of integrin (33. These results were confirmed by the use of siRNA against ROCK and Pyk2. Phosphorylation of serine 732 and tyrosine 407 residues are both implicated in vinculine recruitment at the ventral plaques in endothelial cells in response to VEGF. Finally, by using embryonic MEF FAK-/- cells and siRNA against FAK in HUVEC, we show that the phosphorylation of these two residues is critical to promoting cell migration. Our findings underscore for the first time the complementary role played by the VEGFR2- HSP90-RhoA-ROCK-FAK-S732 and avp3-Pyk2-Y407 pathways in transducing the VEGF signal that leads to the assembly of focal adhesions and endothelial cell migration.

Mon travail de thèse porte sur les épilepsies focales avec ou sans malformations cérébrales de type dysplasie corticale focale. Il s'articule autour de (1) une étude fonctionnelle et génétique sur tissu cérébral postopératoire humain et (2) la caractérisation d'un nouveau modèle génétique chez l'animal. Tout d'abord, des mutations germinales hétérozygotes perte de fonction ont été identifiées dans DEPDC5, NPRL2 et NPRL3 qui codent pour le complexe GATOR1, un inhibiteur du complexe 1 de mTOR (mTORC1). Par la suite, des mutations somatiques cérébrales gain de fonction ont été identifiées dans MTOR. Nous avons émis l'hypothèse que ces mutations entrainent une hyperactivité de mTORC1, responsable des malformations cérébrales et de l'épilepsie des patients. J'ai observé une hyperactivité de mTORC1 dans les cellules cytomégaliques obtenues à partir de tissu cérébral post-opératoire de patients porteurs de mutations dans les gènes de GATOR1 ou MTOR. En parallèle, la caractérisation du premier modèle KO de Depdc5 a montré que les rats Depdc5+/- présentent des anomalies corticales rappelant celles des patients : délamination des couches corticales et cellules cytomégaliques avec une hyperactivité de mTORC1. Ce phénotype est prévenu par l'injection de rapamycine, un inhibiteur spécifique de mTORC1. Une susceptibilité accrue aux crises épileptiques induites par le pentylènetétrazole ainsi qu'un défaut des propriétés neuronales passives et actives ont été rapportés chez les rats Depdc5+/-. En conclusion, mes travaux de thèse ont contribué à mettre en évidence l'implication de la voie GATOR1-mTORC1 dans les épilepsies et dysplasies corticales focales. / In my PhD thesis work, I investigated focal epilepsies with and without brain malformations such as focal cortical dysplasia. I focused on two complementary aspects: (1) genetics and functional studies on human tissue samples and (2) characterization of a novel genetic animal model. First, germline heterozygous loss-of-function mutations were identified in DEPDC5, NPRL2 and NPRL3 genes that encode proteins which together form the GATOR1 complex, a repressor of the mTOR complex 1 (mTORC1). Additionally, brain somatic gain-of- function mutations were identified in MTOR gene that encodes mTOR itself. Both types of mutations are thought to lead to mTORC1 hyperactivity, and cause brain malformation and epilepsy in patients. To test this hypothesis, mTORC1 activity was monitored on post-operative brain tissue from patients carrying GATOR1 or mTOR genes mutations. Cytomegalic cells with mTORC1 hyperactivity were observed. Besides, the characterization of the first Depdc5 KO model revealed that Depdc5+/- rats present cortical structural abnormalities reminiscent of patient histopathology hallmarks: cortical layer dyslamination and cytomegalic cells with increased mTORC1 activity. This phenotype was prevented by rapamycin injection, a specific mTORC1 inhibitor. An increased susceptibility to pentylenetetrazol-induced epileptic seizures, as well as impaired passive and active neuronal properties were observed in Depdc5+/- rats compared to Depdc5+/+ rats. In conclusion, my PhD work largely contributed to emphasize the prominent role of the GATOR1-mTORC1 pathway in focal cortical dysplasia and epilepsies.

L’implication d’un facteur circulant et des dysfonctions du système immunitaire entrainant les altérations de la barrière de filtration glomérulaire a été suggérée dans la pathogénèse de la hyalinose segmentaire et focal récidivante. Nous avons identifié par spectrométrie de masse la présence de la protéine CASK dans des sérums de patients après immunoadsoroption sur une colonne de protéine A. CASK recombinante est capable d'induire des modifications de l’architecture des podocytes in vitro, tels qu’une redistribution de la protéine de diaphragme de fente ZO-1 et de la protéine régulatrice d’actine synaptopodine, et une perte de fibres de stress d’actine. Ces podocytes acquièrent ainsi un phénotype motile et une perméabilité accrue à l’albumine en présence de CASK recombinante in vitro. L’injection de CASK chez des souris entraine une protéinurie et l’effacement des pédicelles de podocytes. L’interaction entre CASK et son récepteur CD98 dans les podocytes a été mise en évidence par l’expérience de pontage covalent et co-immunoprécipitation. L’inhibition de l’expression de CD98 par ARNi a permis de préserver l’architecture des podocytes en présence de CASK. Nous avons remarqué la surexpression de CASK dans les monocytes chez les patients atteints de la HSF récidivante par rapport aux témoins. In vitro, CASK est surexprimée dans les macrophages ayant une polarité M2 et est retrouvée dans le surnageant de la culture de ces cellules. La sécrétion de CASK est associée aux exosomes qui sont des microvésicules d’origine endosomale. Dans les cellules, CASK est partiellement co-distribuée avec ALIX, un marqueur exosomal, et leur interaction a été mise en évidence par co-immunoprécipitation. CASK est fortement exprimée dans les exosomes de patients atteints de HSF récidivante comparé aux donneurs sains. Le traitement des podocytes par des exosomes issus des macrophages de type M2 induit des altérations du cytosquelette et augmente la motilité des podocytes comme cela avait été observé en présence de CASK recombinante. Pour conclure, nous avons identifié CASK comme nouveau facteur soluble qui pourrait jouer un rôle au cours de la HSF récidivante après transplantation rénale. Ces découvertes ouvrent de nouvelles orientations pour le traitement des malades atteints de SNI récidivant. / Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) is often associated with a high rate of progression to end-stage renal disease. The idiopathic form has a high recurrence rate (rFSGS) after transplantation suggesting the presence of a systemic circulating factor that causes the glomerular permeability. This factor can be removed by plasmapheresis or immunoadsorption using protein-A columns. We used mass spectrometry to analyze the proteins eluted from protein-A columns, taken from patients with rFSGS after immunoadsorption. A serum form of calcium/calmodulin-dependent serine/threonine kinase (CASK) was identified in rFSGS patients but not in controls. In cultured podocytes, recombinant CASK induced reorganization of the actin cytoskeleton. We also demonstrated the interaction of CASK with CD98 at the cell surface. Injection of recombinant CASK in mice induced proteinuria and foot process effacement on podocytes. We identified that CASK is produced by monocytes in patients with rFSGS. CASK is also expressed and secreted by M2 polarized macrophages but not by M1 subset. CASK was associated with exosomes produced by these cells. CASK has a partial codistribution with ALIX, an exosomal component involved in their development. We’ve also demonstrated that CASK interacts with ALIX in M2 macrophages. Moreover exosomes derived from M2 macrophages cause podocytes cytoskeleton alterations and increase of podocyte motility as observed previously with recombinant CASK. In conclusion, a serum form of CASK secreted by macrophages acts as a permeability factor in patients with rFSGS suggesting its involvement in the physiopathology of rFSGS.

Les crises d'épilepsie proviennent d'une synchronisation pathologique de réseaux neuronaux du cortex. Les crises motrices, générées à partir du cortex moteur primaire, sont souvent pharmaco-résistantes. La résection neurochirurgicale du foyer épileptique est rarement l'option thérapeutique de choix au regard des risques de deficits moteurs potentiellement induits par la résection. Les ganglions de la base ont un rôle important dans la propagation des crises. Des enregistrements par micro-électrode réalisés dans une précédente étude ont montré que les activités des structures d'entrée des ganglions de la base telles que le Putamen, le noyau caudé et le noyau sous-thalamique (NST) sont fortement modifiées pendant des crises motrices. Par exemple, le taux de décharge moyen des neurones du NST et du Putamen augmente et le pourcentage de neurones oscillants synchronisés avec l'EEG durant la période ictale est plus élevé durant les crises que pendant la période inter-ictale. Des études pilotes chez l'humain ont montré un effet bénéfique potentiel de la stimulation cérébrale profonde (SCP) chronique du NST pour traiter les crises motrices pharmaco-résistantes. Le but de notre étude est d'évaluer les effets thérapeutiques de la SCP des structures d'entrée des ganglions de la base. Nous avons dans un premier temps développé un modèle primate de crise d'épilepsie motrice focale stable et reproductible par injection intra-corticale de pénicilline. Nous avons ensuite caractérisé la pharmaco-résistance du modèle. Nous avons implanté stéréotactiquement des électrodes de SCP dans le NST et le Putamen. Le stimulateur a été placé sous la peau dans le dos de l'animal. Un protocole de stimulation à 130 Hz à un voltage inférieur à l'apparition d'effets secondaires a été réalisé dans le NST. Le stimulateur était mis en marche au moment de l'injection de la pénicilline. Un protocole de stimulation à 0 volt a été réalisé comme condition contrôle. Chaque primate étant son propre contrôle. L'apparition des crises, leur nombre et leur durée ont été comparés par période de 1 heure entre la condition stimulée et non stimulée. Chaque session expérimentale a été menée sur une durée de plus de six heures. Nous avons évalué l'effet préventif de la SCP à haute fréquence (130 Hz) du NST sur les crises motrices. Nous avons également étudié l'effet préventif de la SCP à basse fréquence (5-20 Hz) du Putamen sur ce même modèle. Enfin, sur un autre primate, nous avons étudié l'effet combiné de la SCP du NST à haute fréquence et du Putamen à basse fréquence sur les crises motrices. Résultats : Les effets de la SCP chronique du NST à haute fréquence ont été analysés à partir de 1572 crises apparues au cours de 30 sessions expérimentales chez 3 primates. Les effets de la SCP préventive du NST ont été évalués sur 454 crises motrices durant 10 sessions expérimentales chez un primate. L'effet de la SCP du Putamen à basse fréquence a été analysé sur 289 crises durant 14 sessions chez 2 primates. Enfin l'effet combiné de la SCP du NST et du Putamen a été évalué sur 477 crises durant 10 sessions. Les meilleurs résultats ont été obtenus par SCP chronique du NST. L'apparition de la première crise était significativement retardée lorsque le primate était stimulé. Le temps total passé en situation de crise motrice était diminué en moyenne d'environ 69 % (p ≤0.05) par rapport à la condition non-stimulé au regard de la diminution significative du nombre de crises particulièrement durant les 3 heures après le début de la stimulation. La durée de chaque crise était modérément réduite. Les modes de stimulation mono-polaire ou bi-polaire avaient une efficacité similaire. La SCP préventive du NST n'a pas eu d'effet supérieur à la stimulation chronique du NST. La SCP chronique du Putamen à basse fréquence avait un effet positif mais principalement durant les deux premières heures de stimulation. L'effet combiné de la SCP du NST et du Putamen était inférieur à la SCP chronique du NST ou du Putamen.

Devant l'augmentation de l'incidence des cancers de prostate de faible risque, les thérapies focales apparaissent comme une alternative séduisante entre la surveillance active et les traitements radicaux classiques. Les thérapies Laser (Thérapie photodynamique [PDT] et thermothérapie laser interstitielle [LITT]) pourraient être des modalités d'application de cette thérapie focale.Dans la première partie de cette thèse, nous discutons du concept de thérapie focale, et de la place des thérapies Laser par rapport aux différentes autres modalités énergétiques. Le premier chapitre de cette partie est consacré à l'émergence de la thérapie focale, à ses bases histopathologiques et à l'importance de l'imagerie dans son application. L'échographie et l'imagerie par résonance magnétique (IRM) représentent des outils indispensables pour l'aide au diagnostic, la sélection des patients et le guidage du traitement focal. Les avantages et inconvénients ainsi que les principaux résultats cliniques des différentes modalités énergétiques utilisées pour la thérapie focale sont présentés dans le deuxième chapitre de cette partie. Nous dressons un état de l'art de la PDT et de la LITT pour le traitement focal dans un troisième chapitre. Ces thérapeutiques Laser sont actuellement en développement clinique. Ces deux modalités de traitement reposent sur des principes physiques différents, mais leur application à la thérapie focale pose des problématiques identiques (planification dosimétrique, guidage du traitement interstitiel). Nous précisons les développements actuellement en cours pour résoudre ces problématiques et notamment les travaux de notre unité de recherche. La deuxième partie de cette thèse est dédiée au développement expérimental de LITT pour le cancer de prostate menée au sein de notre unité de recherche. Dans le premier chapitre de cette partie, nous présentons la mise en place d'un modèle animal (Rat Copenhagen avec greffe hétérotopique d'un adénocarcinome prostatique syngénique Dunning R3327-AT2) adapté au traitement par LITT focale. Nous décrivons le monitoring de cette thérapie sous IRM et échographie et démontrons la reproductibilité des volumes de nécrose induits pour un niveau d'énergie donné. Le deuxième chapitre de cette partie est consacré à la mise en place d'un outils de planification dosimétrique adapté à notre modèle in vivo et basé sur la diffusion de chaleur au sein des tissus et au calcul des dommages cellulaires. Enfin dans le troisième chapitre, nous proposons la mise en place d'un fantôme de prostate anatomiquement valide permettant de simuler et d'expérimenter des procédures focales de LITT. Ce fantôme compatible avec un monitoring sous échographie et sous IRM pourrait également être utilisé pour le développement d'autres modalités énergétiques de thérapie focale.

Les maladies glomérulaires sont une des principales causes d'insuffisance rénale terminale de nos jours et constituent un problème de santé publique. Le concept classique dans les glomérulopathies accorde à l'agression systémique immune, toxique ou hypertensive le rôle principal dans la formation des lésions glomérulaires. L'hypothèse développée dans ce manuscrit est que épithélium et endothélium, deux composants principaux du parenchyme rénal sont des acteurs majeurs dans la formation des lésions glomérulaires. Trois modèles expérimentaux de glomérulopathie (inflammatoire, toxique et hypertensive) chez la souris nous ont permis d'étudier une voie de signalisation épithéliale γC/JAK/STAT classiquement décrite dans les cellules immunitaires et le système de réponse à l'hypoxie endothéliale afin d'étayer cette hypothèse. Après avoir discuté le rôle principal classiquement attribué aux lymphocytes T dans le modèle anti-membrane basale glomérulaire, un modèle animal de glomérulonéphrite inflammatoire, nous avons démontré le rôle protecteur de la chaîne γ commune (γC) glomérulaire et de sa protéine d'aval STAT5 dans le podocyte au cours du modèle anti-MBG et de la néphropathie à l'adriamycine. Enfin, nous avons étudié le rôle protecteur de EPAS1 (HIF-2α), une sous-unité régulatrice du complexe HIF, dans l'endothélium au cours des lésions glomérulaires hypertensives. Au total, ce travail met en évidence le rôle majeur de l'épithélium et l'endothélium rénal, étroitement liés, dans la formation des lésions glomérulaires. Le parenchyme rénal représente un acteur à part entière dans la physiopathologie de ces lésions comme le montrent les travaux sur les systèmes γC/STAT5 et HIF. / Glomerular diseases are a leading cause of kidney failure and represent a public health problem. Classically, systemic effectors such as the immune system, drug toxicity or hypertension are thought to be the main drivers of glomerular diseases. The hypothesis developed in this manuscript is that epithelium and endothelium, the two main components of the renal parenchyma, are major players in the formation of glomerular lesions. Three experimental models of glomerular disease (inflammatory, toxic and hypertensive) in mice allowed us to study epithelial γC / JAK / STAT signaling classically described in immune cells and the endothelial hypoxia inducible system in order to support this hypothesis. After discussing the main role traditionally assigned to T cells in the anti- glomerular basement membrane model, an animal model of inflammatory glomerulonephritis, we demonstrated the protective role of the glomerular interleukin common γ chain (γC) receptor and its dependent podocyte-specific STAT5 during the anti-GBM model and adriamycin nephropathy. We then showed the protective role of endothelial EPAS1 (HIF-2α), a regulatory subunit of HIF complex in focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) induced by angiotensin II. In total, this work highlights the important role of the closely linked renal epithelium and endothelium in the formation of glomerular lesions using three experimental models of glomerular diseases. The renal parenchyma is a full player in the pathophysiology of these lesions as shown by the works studying γC / JAK / STAT and HIF systems.

La hyalinose segmentaire et focale (HSF) est une maladie rénale sévère dont la physiopathologie est complexe. La récidive de la maladie après transplantation rénale et l’obtention de sa rémission après un traitement par immunoadsorption (IA) illustre l’implication d’un facteur circulant dans sa physiopathologie, capable de se fixer à la protéine A. Récemment, suPAR a été rapporté comme agent causal et marqueur de la HSF. Le premier objectif de notre travail a été de vérifier si suPAR se fixe à la protéine A. Le deuxième objectif a été d’identifier le facteur circulant responsable de la récidive de la HSF après transplantation rénale, à partir de l’analyse par spectrométrie de masse des protéines liées à la colonne de protéine A après (IA). Premièrement, nous avons mesuré la concentration de suPAR par un test ELISA parmi les protéines fixées à la colonne de protéine A après IA chez 7 patients atteints de HSF récidivantes et dans le sérum de 13 patients atteints de HSF récidivantes et de 11 contrôles sains. Le sérum des patients a été immunoadsorbé in vitro sur bille de protéine A sépharose. Nous avons quantifié suPAR avant et après la procédure et dans l’éluat des protéines fixées à la protéine A. La concentration de suPAR est plus élevée chez les patients atteints de HSF récidivantes par rapport aux groupes contrôles. La concentration de suPAR est très faible dans les proteines éluées à partir de la colonne de protéine A, indiquant que suPAR ne se lie pas à la protéine A et n’est pas le facteur circulant élué par les colonnes de protéines A. Deuxièmement, nous avons identifié le FC à partir des protéines fixées à la colonne de protéine A par une caractérisation des protéines par spectrométrie de masse chez des patients traités pour récidive de HSF et chez un patient contrôle. Nous avons recherché le FC dans le sérum de patient atteint de HSF, de patient ayant une néphropathie diabétique et chez des contrôles sains. L’effet de la protéine recombinante du FC a été testé in vitro sur une culture de podocytes et in vivo chez la souris. Nous avons identifié une forme sérique de CASK (calcium calmoduline sérine thréonine kinase), à partir des protéines fixées à la colonne de protéine A après IA. CASK est présente uniquement dans le sérum de patients atteints de HSF et non dans les groupes contrôles. In vitro, la protéine recombinante de CASK (CASKr) induit une redistribution de l’actine du cytosquelette des podocytes en culture par une interaction avec CD98. CASKr altére la perméabilité des podocytes à l’abumine et induit in vivo une protéinurie chez la souris associé à un effacement des pédicelles.En conclusion, suPAR ne se fixe pas à la protéine A ni in vivo ni in vitro. Une forme sérique de CASK est impliqué dans la récidive de la HSF avec comme cible potentiel CD98 sur le podocyte. / Focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS) is a serious disease, the pathogenesis of which is unknown. Its recurrence after transplantation (Tx) and its partial remission after treatment with immunoadsorption (IA) on a protein A column indicate the existence of a circulating factor (CF) responsible for the disease that is able to bind to a protein A column. Recently, the soluble receptor of urokinase (suPAR) was described as the factor responsible for FSGS. The first aim of my work was to test the capacity of suPAR to bind to protein A and to be eliminated by IA. The second aim was to identify the CF responsible of the recurrence of the disease after renal transplantation from the analysis of proteins eluted from protein-A columns from patients with rFSGS who had undergone therapeutic (IA). First, we measured suPAR in eluates of protein A columns from 7 patients with recurrent FSGS after Tx (rFSGS) treated with IA, and in the serum of 13 patients with rFSGS and 11 healthy donors (HD). Additionally, the plasma of these patients was immunoadsorbed in vitro on a protein A Sepharose column and we quantified suPAR in the eluates and in pre- and post-column samples. The concentration of suPAR was higher in the plasma of patients with rFSGS than in the plasma of HD patients. However, the concentration of suPAR was similar before and after IA on protein A for the rFSGS and HD samples. The suPAR concentration was very low in the eluates from protein A columns incubated with plasma from HD or rFSGS patients. However, 85% of rFSGS patients showed a decrease in immunoglobulin G and proteinuria. Secondly, we analyzed proteins eluted from protein-A columns from patients with rFSGS who had undergone therapeutic immunoadsorption. Compared to control a differential band was identified by mass spectrometry. The expression of this protein was tested by immunochemical methods in sera from healthy controls, from patients with proteinuria caused by diabetic nephropathy, and from rFSGS patients. The effect of the recombinant protein was evaluated in vitro (podocytes) and in vivo experiments (mice). A soluble form of calcium/calmodulin-dependent serine/threonine kinase (CASK) eluted from protein-A columns was identified by mass spectrometry. CASK was immunoprecipitated only in the sera from patients with rFSGS. Recombinant CASK induced reorganization of the actin cytoskeleton of cultured podocytes through an interaction with CD98 at the cell surface. In vitro, CASK increased the permeability of podocyte monolayers, and induced proteinuria and foot-process effacement in miceIn conclusion, suPAR does not significantly bind to protein A in vitro or in vivo. Soluble CASK acts as a permeability factor in patients with rFSGS bindinding CD98 on podocytes.

L'adhérence à la matrice extracellulaire dépendante des intégrines est un processus dynamique et hautement régulé assurant la motilité cellulaire. La protéine ICAP-1alpha interagit avec le domaine cytoplasmique de l'intégrine beta1 et désorganise les adhérences focales in vitro. Comme ICAP-1alpha est absent des adhérences, cette protéine pourrait avoir une action transitoire et finement régulée au niveau de beta1. Dans un premier temps, j'ai pu montrer que ICAP-1alpha ralentit la phase d'assemblage des adhérences en maintenant l'intégrine beta1 en état de faible affinité pour son ligand. De façon surprenante, la régulation négative de l'affinité de l'intégrine beta1 par ICAP-1alpha assure la perception des faibles densités de matrice extracellulaire et l'adaptation de la réponse cellulaire adhésive à cet environnement. ICAP-1alpha agit comme un capteur mécanique qui limite l'assemblage des sites d'adhérence et ralentit la migration et l'étalement des cellules sur des matrices peu denses. Dans un second temps, la voie de signalisation contrôlant l'activité de ICAP-1alpha sur la fonction de l'intégrine beta1 a été caractérisée. ICAP-1alpha possède des sites consensus de phosphorylation dont un reconnu par la protéine kinase dépendante du calcium et de la calmoduline de type II, la CaMKII. Plusieurs évidences révèlent que la CaMKII régule la fonction d'ICAP-1alpha. La phosphorylation d'ICAP-1alpha sur le site reconnu par la CaMKII stimule la liaison de cette protéine sur beta maintient cette intégrine en état de faible affinité pour son ligand et réduit la formation des adhérences focales.