Les microtubules (MTs) sont importants pour des processus cellulaires majeurs comme la polarisation, le trafic membranaire, la division cellulaire ainsi que pour l'architecture intracellulaire. En retour, les organites influencent l'organisation et la dynamique des MTs. Mon projet de thèse vise à élucider les interactions fonctionnelles existantes entre les MTs et la sécrétion en adoptant une approche quantitative et systématique. En synchronisant le trafic de différents cargos grâce au système RUSH (Retention Using Selective Hooks) et à une dépolymérisation complète des MTs, nous avons montré que les MTs ne sont pas strictement nécessaires à la sécrétion des cargos. D'une manière générale nous avons observé que le trafic intracellulaire est ralenti mais toujours possible en présence d'un appareil de Golgi dispersé. Nous avons caractérisé deux populations d'éléments golgiens. Elles sont présentes peu après la dépolymérisation des MTs et sont différentes en terme de composition et de capacité de sécrétion. Nos résultats montrent qu'une maturation fonctionnelle des éléments golgiens est nécessaire pour le trafic post-golgien, basée sur l'acquisition de certains facteurs golgiens non identifiés à ce jour. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à l'exocytose au niveau de la membrane plasmique. Nous avons observé une sécrétion préférentielle des protéines à proximité des adhésions focales. Différentes techniques de biologie cellulaire nous ont permis de caractériser cet adressage préférentiel vers les sites d'adhésion de la cellule. Nous avons également corrélé les forces exercées par la cellule sur le substrat avec la direction du transport antérograde. / Microtubules (MTs) are important for major cellular processes like cell polarization, intracellular trafficking, cell division, intracellular architecture. Organelles influence back the MTs organization and dynamics. The goal of my project was to study the involvement of MTs in the intracellular trafficking. Thanks to the Retention Using Selective Hooks (RUSH) system to synchronize the trafficking of cargos and with an efficient way to depolymerize MTs, we showed that MTs were not strictly essential to secretion of cargos. More generally, we showed that intracellular trafficking is slowed down but still possible in the presence of a dispersed Golgi apparatus. Moreover, we characterized two populations of Golgi elements in cells without MTs that are different in terms of secretion ability and composition. Our results demonstrated that functional maturation of Golgi elements is needed to ensure post-Golgi trafficking and that MTs driven post-Golgi transport is not strictly required. Besides working on intracellular trafficking without MTs, we conducted a study on the exocytosis at the plasma membrane. By using an antibody coating on coverslips to immobilize secreted cargos, we visualized the first step of arrival at the plasma membrane. We observed a directed and polarized secretion close to focal adhesions that we characterized by different cell biology technics and microscopy (spinning disk, TIRF…). We highlighted a close relationship between forces exerted by the cell on its substrate and the directionality of the anterograde transport by using patterning and Traction Force Microscopy (TFM).

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le but de la conception d’un biomatériau est de mimer les modèles qui puissent être représentatifs de la matrice extracellulaire (MEC) existant in vivo. Cet objectif peut être atteint en associant une combinaison de cellules et des facteurs biologiques à un biomatériau sur lequel ces cellules peuvent se développer pour reconstruire le tissu natif. Dans cet étude, nous avons crée des surfaces bioactives nanostructurées en combinant la nanolithographie et la fonctionnalisation de surface, en greffant un peptide RGD ou BMP-2 (bone morphogenetic protein 2). Nous avons étudié l’effet de cette nanodistribution sur le comportement des cellules souches mésenchymateuses en analysant leur adhésion et différentiation. Nous notons que la nanodistribution des peptides induit une bioactivité qui a un impact sur l’organisation du cytosquelette, la conformation des fibres de stresse de l’actin, la maturation des adhésions focales (AFs), et le commitment des cellules souches. En particulier, l’aire, la distribution, et la conformation des AFs sont affectes par la présence des nanopatterns. En plus, le RGD et le BMP-2 changent le comportement cellulaire par des voies et des mécanismes différents en variant l’organisation des cellules souches et la maturation de leurs AFs. La nanodistribution influence de façon évidente les cellules souches en modifiant leur comportement (adhésion et différenciation) ce qui a contribué et ce qui contribuera à améliorer la compréhension des interactions des cellules avec la MEC. / The aim of biomaterials design is to create an artificial environment that mimics the in vivo extracellular matrix for optimized cell interactions. A precise synergy between the scaffolding material, bioactivity, and cell type must be maintained in an effective biomaterial. In this work, we present a technique of nanofabrication that creates chemically nanopatterned bioactive silicon surfaces for cell studies. Using nanoimprint lithography, RGD and mimetic BMP-2 peptides were covalently grafted onto silicon as nanodots of various dimensions, resulting in a nanodistribution of bioactivity. To study the effects of spatially distributed bioactivity on cell behavior, mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured on these chemically modified surfaces, and their adhesion and differentiation were studied. MSCs are used in regenerative medicine due to their multipotent properties, and well-controlled biomaterial surface chemistries can be used to influence their fate. We observe that peptide nanodots induce differences in MSC behavior in terms of cytoskeletal organization, actin stress fiber arrangement, focal adhesion (FA) maturation, and MSC commitment in comparison with homogeneous control surfaces. In particular, FA area, distribution, and conformation were highly affected by the presence of peptide nanopatterns. Additionally, RGD and mimetic BMP-2 peptides influenced cellular behavior through different mechanisms that resulted in changes in cell spreading and FA maturation. These findings have remarkable implications that contribute to the understanding of cell-extracellular matrix interactions for clinical biomaterials applications.

Cette thèse propose un modèle et un ensemble de mécanismes pour supporter le développement de bases de données actives. D'une part, le modèle permet la description intégrée des aspects statiques et dynamiques des applications. Pour décrire la structure des traitements sur les informations trois concepts sont proposés : entité focale, activité et procédure. D'autre part, ce modèle est supporté par un ensemble d'outils et de mécanismes permettant de lancer automatiquement, contrôler et suivre l'exécution des activités et procédures. Un des mécanismes qui a mérité une attention particulière est celui du déclenchement automatique d'une activité ou d'une procédure. Ceci implique l'évaluation de préconditions liées aux activités et aux procédures. Leur évaluation est réalisée lors des mises à jour et nécessite potentiellement des accès complexes à la base de données. Cette évaluation se fait en deux phases • la première détermine le sous-ensemble de préconditions à évaluer pour une certaine mise à jour. Ce travail a abouti à l'établissement d'un ensemble de règles de correspondance entre les préconditions et les mises à jour. • la deuxième réalise l'évaluation proprement dite des préconditions. Ce travail a abouti à la définition d'une méthode d'évaluation efficace qui utilise un ensemble de techniques d'optimisation. D'autres mécanismes à souligner sont • l'interaction entre les mécanismes de déclenchement et d'exécution des activités et procédures avec le système transactionnel. • le contrôle persistant de l'exécution des procédures. Ce travail est complété par l'implémentation des différents services proposés.

Nos travaux de recherche menés dans l'ischémie cérébrale néonatale ont évalué l'effet de la Ciclosporine A sur la réduction du volume lésionnel, mais aussi sur le fonctionnement du métabolisme mitochondrial. Nous avons également étudié l'effet du postconditionnement ischémique et les conséquences hémodynamiques de la reperfusion. Le pore de perméabilité membranaire mPTP s'ouvre au cours de l'ischémie néonatale. La CsA, inhibiteur de la Cyclophiline D freine l'ouverture du pore mPTP, améliore la capacité de recapture du calcium par la mitochondrie, la respiration mitochondriale, et limite les effets inflammatoires de l'ischémie. Néanmoins, la CsA ne réduit pas le volume des lésions cérébrales. Nous avons pu montrer que la Cyclophiline D et le pore mPTP étaient bien deux acteurs majeurs dans la constitution des lésions induites par la reperfusion dans l'ischémie cérébrale focale néonatale. Le postconditionnement ischémique ne permet pas de réduire les volumes des lésions. Nous avons montré que la reperfusion chez le jeune était progressive et lente, sans hyperhémie comme chez l'adulte. Cette cinétique de reperfusion est identique dans les deux hémisphères, tant pour la perfusion tissulaire corticale que pour la perfusion des régions cérébrales profondes. La vasoconstriction cérébrale chez le jeune traduit le recrutement précoce de la circulation collatérale mais aussi les dysfonctionnements de la microcirculation cérébrale. Au final, ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques au profil particulier de la reperfusion dans le cerveau immature

Ce travail s'intéresse à l'étude préclinique de l'ischémie cérébrale focale transitoire à travers la caractérisation de la microvascularisation cérébrale grâce à différents outils d'investigation. Il décrit le développement d'un modèle d'ischémie cérébrale réversible par occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne chez le rat. Une ouverture précoce de la barrière hémato-encéphalique après reperfusion a été mise en évidence par l'extravasation d'agents de contraste en imagrie par résonance magnétique nucléaire. L'influence de différents anesthésiques sur l'évolution de la pathologie ischémique a été évaluée par la mesure du débit sanguin cérébral en autoradiographie et l'évaluation histologique des lésions induites. Enfin, une technique d'imagerie par spectroscopie proche-infrarouge permettant la localisation spatiale en temps réel d'un foyer ischémique est présentée.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les problèmes de sécurité constituent le principal obstacle à l'utilisation de robots dans des applications sensibles. Nous répertorions ces problèmes et les solutions partielles qui y sont apportées dans divers domaines d'application de la robotique. Nous détaillons en particulier deux applications qui nous intéressent : le guidage d'un geste médico-chirurgical et l'inspection d'un bol de générateur de vapeur dans une centrale nucléaire. Notre objectif consiste à vérifier de manière globale la bonne exécution de la tâche planifiée. Nous cherchons donc à contrôler la position du robot au moyen de capteurs externes. Aussi étudions-nous les divers types de capteurs de position envisageables avant de proposer une solution qui consiste à apposer des marqueurs passifs sur le robot et à surveiller leur position au moyen de caméras vidéo. Cette manière de procéder implique le calibrage préalable de chacun des composants du système. Nous étudions en détail les méthodes de calibrage intrinsèque de caméras et adoptons une méthode multi-plans que nous étendons au calibrage de caméras à focale variable. Les caméras étant calibrées intrinsèquement, nous proposons une solution pour les recaler par rapport à l'environnement spécifique de chacune de nos deux applications. La dernière phase de calibrage consiste à repérer la position d'un marqueur par rapport au segment du robot qui le porte. Ce problème est tout à fait similaire à la détermination de la position d'une caméra portée par un robot. Nous étudions particulièrement deux solutions classiques dont nous améliorons la précision en minimisant une erreur globale sur un ensemble important de données. Toutes ces étapes étant réalisées, la position des marqueurs peut être prédite, puis vérifiée grâce à un traitement d'images approprié. Des expérimentations complètes ont été menées en vue de montrer la faisabilité du projet et d'évaluer la précision que l'on peut espérer.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap de l'adulte. Favoriser la plasticité cérébrale post-lésionnelle représente un objectif thérapeutique majeur. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire a récemment émergé. Son action, fondée sur la " réparation " du tissu cérébral, a montré un bénéfice sur la récupération fonctionnelle dans des modèles d'ischémie cérébrale. La transposition de ce traitement à l'homme reste à ce jour limitée à des études pilotes. Dans nos travaux précliniques, nous avons montré, après un infarctus cérébral chez le rat, une bonne tolérance et un bénéfice fonctionnel de l'administration intracérébrale (à la phase aiguë) et intraveineuse (à la phase subaiguë) de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) de grade clinique. La survie des CSMh greffées (possible durant plusieurs semaines) et leur différenciation en cellules d'intérêt (neurones, astrocytes) sont très faibles et ne peuvent expliquer à elles seules le bénéfice observé. Parmi les mécanismes d'action possibles des CSM (effet neurotrophique, pro-angiogénique, immunomodulation...), nous avons mis en évidence par IRM un effet microvasculaire précoce. Nous avons également montré l'innocuité du marquage des CSMh par microparticules ferriques pour l'IRM cellulaire et la microscopie. Ce marquage cellulaire est utile pour détecter et suivre par IRM des cellules greffées au sein du cerveau (durant au moins 15 jours), mais nous a paru insuffisant dans le cadre d'une injection IV. Pour évaluer la biodistribution des CSMh injectées par voie IV à la phase subaiguë, nous avons effectué une étude par imagerie nucléaire qui a permis d'identifier l'attraction rapide de CSMh vers l'infarctus cérébral. En parallèle, la mise en place d'un essai clinique de phase 2 a été effectuée. Le délai, la voie optimale d'administration ainsi que la source cellulaire à utiliser restent encore controversés. L'optimisation de la thérapie cellulaire nécessite encore le développement de projets de recherche translationnelle associant les études expérimentales et les essais cliniques. C'est dans ces conditions que la thérapie cellulaire pourrait devenir un traitement efficace après un AVC.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) représentent la première cause de handicap acquis de l'adulte. En dehors de la prise en charge dans une structure de soins spécialisée, l'Unité Neuro-Vasculaire (UNV), le seul traitement efficace est la thrombolyse qui doit être administrée dans les premières heures suivant un AVC ischémique (ou infarctus cérébral). Favoriser la plasticité post-lésionnelle du cerveau représente une alternative thérapeutique majeure. C'est dans ce contexte que la thérapie cellulaire basée sur l'administration de cellules souches a émergé. Son action, fondée sur la " réparation " du tissu cérébral lésé, a montré un bénéfice sur la récupération dans des modèles d'ischémie cérébrale expérimentale. Cependant, de nombreuses questions restent en suspens concernant les mécanismes d'action de ce type de traitement. Par ailleurs, la transposition à l'homme reste à ce jour limitée à des études pilotes encourageantes mais avec de faibles effectifs. L'objectif de nos travaux au Grenoble Institut des Neurosciences (GIN U 836) a été d'évaluer les effets fonctionnels de l'administration de cellules souches mésenchymateuses (CSM) après ischémie cérébrale chez le rat, de préciser les modes d'action possibles. En parallèle de ces travaux expérimentaux, un essai clinique pilote de tolérance chez l'homme (ISIS - HERMES) a été mis en place.