Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Dresden.

Les substances génotoxiques ont la capacité d'altérer l'intégrité de l'ADN, support biochimique de l'hérédité et présentent un risque mutagène et tumorigène avéré pour de nombreuses espèces. Dans le milieu aquatique, les invertébrés sont d'une importance capitale pour le bon fonctionnement de l'écosystème, mais très peu d'outils sont disponibles pour évaluer la génotoxicité chez ces espèces. Pourtant, les nouvelles obligations réglementaires telles que la Directive Cadre Européenne acceptée en 2000, vont de pair avec le développement d'outils sensibles, fiables et précoces à même de proposer un diagnostic robuste de la qualité biologique des écosystèmes. Dans ce contexte, ce travail de thèse a porté sur le développement, la validation, l'interprétation et l'application au milieu naturel d'un biomarqueur de génotoxicité chez une espèce sentinelle du milieu dulçaquicole, le gammarus fossarum. Ces travaux sont à notre connaissance la première évaluation de la génotoxicité chez un crustacé d'eau douce d'intérêt écologique, par le test Comet. L'aspect novateur de ce travail repose sur la mise en évidence d'une relation entre endommagement de l'ADN des spermatozoïdes et succès reproducteur. En s'appuyant sur un protocole standard, nous avons établi une valeur de référence tenant compte de la variabilité spatio-temporelle de la réponse du biomarqueur, ainsi qu'un seuil de dommages à l'ADN au delà duquel des effets significatifs sur la descendance sont observés. Suite aux résultats obtenus sur le terrain par des méthodes d'encagement, l'intérêt d'utiliser ce biomarqueur à vocation écologique dans un cadre d'évaluation du risque environnemental est confirmé / Genotoxicants can induce deleterious changes in DNA, the biochemical carrier of inheritance. However, aquatic invertebrates such as crustaceans still lack genotoxicity biomarkers although these species play an essential role in ecosystems. The European Water Directive Policy (2000) is aimed at a holistic approach to towards integrated water protection, in order to improve the status of aquatic ecosystems. To this end, one approach is to develop and validate biomarkers in ecologically relevant species. In this perspective, the objectives of the present work were to develop, to validate, to study the ecological significance of a genotoxicity biomarker in the freshwater species gammarus fossarum and finally to assess it in the field. This is to our knowledge the first genotoxicity assessment in an ecologically relevant freshwater crustacean, using the comet assay. The novelty of our approach was to evaluate the consequences of the sperm DNA damage on reproduction, a crucial biological function. Taking into account biotic and abiotic factors, a robust reference value in gammarus fossarum spermatozoa DNA damage has been established. Then, a relationship bridging the biomarker response measured in spermatozoa and its consequences on reproduction has been shown enabling the establishment of a DNA damage threshold level leading to significant consequences for the reproduction and possibly subsequent population dynamics. Our work clearly demonstrated that DNZ damage in gammarus fossarum spermatozoa is an accurate and relevant biomarker for environmental risk assessment

Dans le cadre de l'évaluation de la qualité des écosystèmes aquatiques, les réponses en lien avec l'énergie semblent particulièrement pertinentes pour appréhender l'état physiologique des êtres vivants et prévoir des effets populationnels. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail a été de proposer un biomarqueur de l'assimilation de l'énergie chez un amphipode d'eau douce Gammarus fossarum. La caractérisation des activités enzymatiques digestives (amylase, cellulase et trypsine) et des réserves énergétiques (glycogène, lipides et protéines) soumises à l'influence de divers facteurs biotiques et abiotiques (sexe, stade reproducteur, température, conductivité et quantité de nourriture) a permis d'identifier l'amplitude des réponses étudiées afin d'améliorer l'interprétation des réponses obtenues en milieu naturel. Ces résultats ont également validé l'utilisation d'organismes mâles standardisés et nourris ad libitum dans le cadre d'approche active. D'autre part, la pertinence écologique des enzymes digestives en tant que biomarqueur a été évaluée en étudiant le lien existant entre une perturbation des réponses enzymatiques digestives au niveau sub-individuel et ses conséquences au niveau individuel sur le succès reproducteur des gammares. Par ailleurs, dans le cadre de deux campagnes de terrain, les mesures des activités enzymatiques digestives réalisées chez les organismes transplantés ont permis de discriminer les sites en fonction de leur qualité chimique et de proposer pour chaque marqueur une valeur référence et seuil traduisant un effet. Ainsi les activités enzymatiques digestives peuvent être utilisées comme outil pour établir un diagnostic de risque environnemental. / For the assessment of the aquatic ecosystems health, responses related to energy metabolism seem particularly relevant to understanding the physiological state of living organisms and provide population- effects. In this context, the objective of this work was to propose a biomarker of energy assimilation in a freshwater amphipod Gammarus fossarum. The characterization of digestive enzymes activities ( amylase , cellulase and trypsin) and energy reserves (glycogen , lipids and proteins) submited to the influence of various biotic and abiotic factors (sex, reproductive stage , temperature, conductivity and amount of food ) determine the range of responses studied to improve the interpretation of data obtained in the field. These results can also validate the use of standardized male fed ad libitum in caging approach. On the other hand, the ecological relevance of digestive enzymes was assess, the link between digestive enzyme impairments at sub -individual level and its consequences on the fitness of the gammarid population at individual level was established. Furthermore, in the context of two field campaigns, measures of digestive enzyme activities in organisms transplanted allowed to discriminate sites according to their chemical quality and to propose for each marker a benchmarck and a threshold value reflecting an effect. Thus, digestive enzyme activities can be used as diagnostic tool for environmental risk assessment.

Parmi les outils existants pour l'évaluation de la qualité des milieux aquatiques, les biomarqueurs permettent de détecter précocement l'exposition et/ou les effets d'une contamination. Toutefois, en raison du manque de connaissance fondamentale de leur régulation au niveau moléculaire, peu de biomarqueurs ont été spécifiquement développés chez les invertébrés, alors que ces derniers représentent 95% de la biodiversité animale. Grâce aux récentes avancées technologiques dans le domaine du séquençage de l'information génétique et protéique, la découverte de nouvelles protéines chez ces organismes est à présent possible. Centré sur l'utilisation d'une espèce d'intérêt en écotoxicologique, l'amphipode d'eau douce Gammarus fossarum, et sur la problématique de la perturbation endocrine, ce travail doctoral a pour objectif de découvrir de nouvelles protéines impliquées dans la reproduction du gammare et de proposer des biomarqueurs spécifiques de reprotoxicité. Par une première approche protéogénomique, un important catalogue de protéines a été généré. Puis, afin d'identifier de nouvelles protéines impliquées dans la reproduction, une comparaison entre les protéomes des tissus reproducteurs mâle et femelle a été réalisée, suivi de l'étude de la dynamique du protéome au cours de différents processus physiologiques : ovogénèse, embryogénèse et spermatogénèse. Enfin, une dernière expérience sur des organismes mâles exposés à différents perturbateurs endocriniens a permis d'identifier différents candidats biomarqueurs de reprotoxicité. Cette étude ouvre la voie à des développements rapides de biomarqueurs spécifiques d'une espèce animale d'intérêt en écotoxicologie / Among the tools for assessing biologic quality of aquatic ecosystems, biomarkers are ideally suited for the early detection of contaminant exposure and/or effects. Yet, because of the lack of fundamental knowledge of their molecular regulation, few specific developments have been carried out on invertebrates even though they account for more than 95% of animal biodiversity. Thanks to recent technological advances in nucleic and proteic information sequencing, discovery of new proteins is now possible for these organisms. Focussed on the use of an ecotoxicologically relevant species, the freshwater amphipod Gammarus fossarum and the problem of endocrine disruption, this doctoral thesis aims to discover new proteins involved in gammarid reproductive function and to propose specific biomarkers of endocrine disruption. With a first proteogenomic approach, an important protein catalogue was generated. Next, to identify proteins involved in gammarid reproduction, male and female reproductive tissue proteomes were compared, followed by the study of proteome dynamics in several physiological processes: oogenesis, embryogenesis and spermatogenesis. Finally, a last experiment on male gammarids challenged with different endocrine disrupter chemicals identified several candidate biomarkers of reprotoxicity. This study paves the way for quick developments of specific biomarkers for organisms of interest in ecotoxicology

Techn. Universiẗat, Diss., 2004--Dresden.

L'utilisation en routine de biomarqueurs pour la biosurveillance environmentale présente plusieurs limitations, en particulier chez les invertébrés. Parmis ces limitations, la manque de biomarqueurs spécifiques et de approches multibiomarqueurs sont des contraintes majeurs. En se basant sur les catalogues de gènes et protéines obtenus à partir des études proteogénomiques réalisées antérieurement chez l'espèce clé en écotoxicologie Gammarus fossarum, cette thèse a visé l'identification et validation de biomarqueurs moléculaires pour le diagnostic de perturbations toxiques chez cette espèce. À la suite des méthodologies récentes pour le développement de biomarqueurs en santé humaine, nous avons mis en place un dosage multiplexé rapide et spécifique (en utilisant la spectrométrie de masse Selected Reaction Monitoring) pour quantifier simultanément des dizaines de candidats biomarqueurs protéiques. L'éssai a été appliqué pour l'évlauation de l'importance physiologique des candidats et de sa pertinence comme biomarqueurs à travers des expositions à des polluants chimiques au laboratoire et sur le terrain. Le deuxième axe de cette thèse a visé le développement de biomarqueurs spécifiques d'une perturbation endocrinienne via deux approches. La première approche, basée sur un étude de protéomique comparative avec un perturbateur endocrinien connu chez les arthropodes, a permis d'augmenter l'exhaustivité dans le suivi du protéome avec la détection d'environ 4000 protéines (dont 53 modulés par l'exposition). La deuxième approche a compris des recherches d'homologies de séquence, des analyses phylogénétiques, et des études d'expression de gènes pour proposer des candidats biomarqueurs / The routine use of biomarkers in environmental biomonitoring faces several drawbacks, especially in invertebrates. Among these limitations, the lack of validated species-specific biomarkers and multibiomarker methodologies comprise major constraints. Based on gene and protein catalogs obtained from proteogenomics experiments previously performed on the ecotoxicological-relevant species Gammarus fossarum, this thesis aimed at identifying and validating molecular biomarkers for the diagnostic of toxic perturbations in this species. Following recent methodologies for the development of biomarkers in human disease diagnosis, we implemented a fast, specific, quantitative multiplexed targeted proteomics assay (using Selected Reaction Monitoring mass spectrometry) to study dozens of protein biomarker candidates simultaneously. The assay was applied to assess the physiological importance of protein candidates, and to assess their pertinence as biomarkers after laboratory and field exposures to chemical contamination. The second part of this thesis aimed at the development of specific endocrine disruption biomarkers, through two complementary approaches. The first approach, based on a comparative shotgun proteomic analysis using a known endocrine disruptor for arthropods, allowed exhaustively increasing the whole-proteome analysis through the detection of roughly 4000 proteins (53 modulated by the exposure). The second comprised sequence homology searches, phylogenetic analyses, and gene expression studies for proposing new biomarker candidates identified from literature searches

Parmi les substances polluantes, les perturbateurs endocriniens (PE) sont au coeur des préoccupations scientifiques en raison du risque de ces composés pour l'environnement, et en particulier les écosystèmes aquatiques. L'étude de la disponibilité et de l'impact des PE sur les vertébrés aquatiques, en particulier les poissons, a fait l'objet de nombreux projets et publications. Ces travaux ont conduit au développement d'outils de diagnostic pouvant être utilisés in situ, comme par exemple l'induction de la vitellogénine (Vg) chez les mâles, l'inhibition de la croissance ovarienne et testiculaire, le retard dans la maturité sexuelle, la présence d'individus intersexués et les concentrations anormales en hormones stéroïdiennes. En revanche, peu d'attention a été portée aux invertébrés qui représentent pourtant plus de 95 % des espèces animales et jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement et la santé des écosystèmes aquatiques. Par conséquent, il en résulte un manque d'outils spécifiques de la perturbation endocrinienne chez ces espèces. Dans ce contexte, le travail proposé se focalise tout d'abord sur l'intérêt et la pertinence de la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) pour développer ou transférer entre espèces une méthode de mesure de la Vg chez les invertébrés, incluant les crustacés, les mollusques et les insectes. Ensuite, ce travail s'est intéressé à un crustacé amphipode modèle (Gammarus fossarum) et avait pour objectifs (1) de développer le biomarqueur Vg, via la validation de son rôle fonctionnel dans la reproduction (vitellogenèse, embryogenèse et différences inter-sexe), de sa sensibilité à des composés modèles et jusqu'à son utilisation dans le cadre d'études de terrain à l'aide d'organismes encagés et (2) de développer l'utilisation d'une approche chez la femelle permettant de caractériser le potentiel PE de composés et des systèmes aquatiques, à partir de l'étude de marqueurs individuels / Among pollutants, endocrine disruptors (ED) are in central scientific preoccupation because of the risks of these compounds to the environment, in particular for aquatic ecosystems. The availability and impact study of ED on aquatic vertebrates, in particular fishes, was the subject of many projects and papers. These studies led to the development of diagnostic tools, such as vitellogenin (Vg) induction in male organisms, inhibition of ovarian and testicular growth, delayed sexual maturity, presence of intersex individuals and abnormal concentrations of steroid hormones. However, little attention was paid to invertebrates which account for more than 95% of animal species and play an essential role in functioning and health of aquatic ecosystems. Therefore, the result is a lack of specific tools for endocrine disruption assessment in these species. In this context, the proposed work focuses first on the interest and relevance of mass spectrometry (LC-MS/MS) to develop and to transfer among species a method for measuring Vg in invertebrates species, including crustaceans, molluscs and insects. Then, this work has focused on a model amphipod crustacean (Gammarus fossarum) and aims were (1) to develop the Vg biomarker, through the validation of its functional role in reproduction (vitellogenesis, embryogenesis and inter-sex differences), its sensitivity towards model compounds and to its use in field monitoring, using caged organisms and (2) develop a biotest in the female to assess the ED risk of chemical compounds and aquatic systems, by studying and measuring individual markers

In recent years, due to the development of molecular methods, a great level of cryptic diversity across multiple taxa was discovered. One of these groups are freshwater amphipods. Amphipods due to lower dispersal and recolonization abilities present a suitable model system for studying potential ecological interactions among genetically distant lineages during their secondary contact. In this thesis, I studied the cryptic species complex Gammarus fossarum in a contact zone of several genetically divergent lineages known from the previous research in the Vsetin region. I focused on two main questions: Firstly, whether there are preferences among individuals from different lineages for sexual partners from the same lineage rather than from the different one (i.e., I test for the potential existence of prezygotic reproduction barrier between the lineages). I tested this hypothesis by collecting pairs from natural contact zone and also (in a limited extent) by an aquarium experiment. Secondly, I tested whether these lineages differ in mesohabitat (pool versus riffle) distribution in syntopy, which may indicate competition among lineages and potential diversification of their ecological niches. Animals from nine localities (with expected contact of two lineages per locality) were examined. In more than...

Comme ils conduisent à des modifications de sensibilité toxicologique et de traits d'histoire de vie au sein des populations naturelles exposées, les phénomènes d'adaptation à la contamination questionnent la pertinence de l'évaluation du risque environnemental lié au rejet de contaminants chimiques et sont devenus un champ de recherche important à développer en écotoxicologie. Centrés sur l'étude des capacités d'adaptation de l'amphipode d'eau douce Gammarus fossarum, les travaux présentés ici ont eu pour objectif d'avancer dans la compréhension des effets d'une exposition à long terme au cadmium à l'échelle populationnelle et en milieu naturel. En recourant à des méthodologies de biomonitoring par encagement, de culture et d'exposition au laboratoire et de suivi démographique in situ, une démarche couplant études a priori et rétrospectives sur populations naturelles, a permis d'identifier un phénomène d'augmentation de la tolérance et de modification de traits d'histoire de vie chez une population exposée historiquement au cadmium. Des approches de génétique quantitative conduites sur trois populations ont dans un deuxième temps mis en évidence (1) une faible héritabilité de la sensibilité au cadmium au sein de populations naïves ; et (2) un rôle majeur des effets parentaux induits par l'exposition comme mécanisme populationnel soutenant l'évolution de la tolérance chez cette espèce. Enfin, la caractérisation de la variabilité de la sensibilité au cadmium au sein du genre Gammarus (dix-sept populations) et la mise en regard de la divergence de la population tolérante vis-à-vis de cette variabilité, ont permis de discuter des implications de ces processus évolutifs induits par des expositions environnementales pour l'évaluation du risque lié aux substances chimiques. Ainsi, il apparaît nécessaire de prendre en compte les réponses adaptatives induites par la contamination des milieux comme source de variabilité et d'incertitude afin de proposer une évaluation du risque pertinente intégrant pleinement l'ensemble des impacts des contaminations environnementales sur les populations naturelles / Because they lead to changes in toxicological sensitivities and life history traits within field populations, evolutionary processes supporting adaptation to contamination challenge the relevance of environmental risk assessment of chemical contaminants. Hence their study becomes an important developing field of research in ecotoxicology. Focusing on the study of adaptive capacity of the freshwater amphipod Gammarus fossarum, this work aimed to gain insight into the effects of long term exposure to cadmium at the population scale in the field. By means of biomonitoring methodologies (caging), population demographic sampling, culture and exposure in the laboratory we identified a phenomenon of increased tolerance and modification of life history traits in a natural population historically exposed to cadmium. Quantitative genetics experiments conducted on three populations secondly demonstrated (1) a low heritability of sensitivity to cadmium in naïve populations ; and (2) a major role of parental effects induced by exposure as populational mechanism supporting the development of tolerance in this species. Finally, the characterization of the variability of cadmium sensitivity in the genus Gammarus (seventeen populations), and the analysis of the divergence of the tolerant population in comparison to this variability led us to discuss about the implications of these evolutionary processes induced by environmental exposure for risk assessment of chemicals. Thus, from these results it appears necessary to take into account adaptive responses induced by environmental contamination as a source of variability and uncertainty in order to provide a relevant risk assessment fully integrating all the impacts of environmental contamination on natural populations

Les réglementations conduisent à multiplier les évaluations du risque écologique lié au rejet des substances chimiques dans les milieux aquatiques avec pour objectif de protéger les populations naturelles. Cependant, ce niveau de protection visé ne peut être utilisé facilement pour établir un lien direct entre une contamination et ses effets. Pour palier cette difficulté, les approches multi-échelles basées sur l'étude des effets des contaminations sur des marqueurs individuels puis sur l'extrapolation de ces effets au niveau des poipulations à partir de modèles de dynamique de population représentent des démarches prometteuses et commencent à être bien acceptées dans les démarches prédictives.Cependant, leur utilisation pour le diagnostic de la qualité des milieux aquatiques reste pour le moment très rare, d'une part en raison de la forte variabilité des réponses des marqueurs individuels in situ liée à l'influence de divers facteurs environnementaux confondants pour l'évaluation de la toxicité, et d'autre part à cause du manque de pertinence environnementale des modèles actuellement proposés. Centré sur l'utilisation de deux espèces couramment observées dans les cours d'eau européens et présentant des caractéristiques écologiques et phylogéniques contrastées : le crustacé Gammarus fossarum et le mollusque Potamopyrgus antipodarum, ce travail doctoral a permis : 1- de proposer une méthodologie pour prendre en compte l'influence des facteurs de confusion dans le but d'améliorer la lecture des bioessais in situ basés sur la mesure des marqueurs individuels sur des organismes encagés et 2- de développer des modèles de dynamique de population écologiquemnt pertinents. / The regulatory framework lead to increase the assessments of the ecological risk linked to the dischaarge of chemical substances in aquatic environment with the aim to protect natural populations. However, this target level of protection cannot be used so easily to etablish a direcet link between a contamination and its effects. In order to overcome this difficulty, the multi-scale approaches based on the study of the effects of the contaminations on individual markers and then on the extrapolation of these effects at the population level with population dynamic models reprensent promising tools and start to bewell accepted in predictive processes. Yet, their use for the diagnosis of water quality remainsrare for the moment, on the one hand, because of the important varaibility of answers of individual makers in situ linked to the influence of diverse confounding environmental factors for the assessments of toxicity and, on the other hand, because pf the lack of environmental relevance of models currently proposed. Focused on the use of 2 species widely observed in European rivers and presenting contrastingecological and phylogenetic characteristics : the Grammar fossarum crutacean and the Potamopyrgus antipodarum mollusc, this doctoral degree first propose a methodology to consider the influenceof confounding factors in order to improve the reading of biological in situ tests based on the measurment of individual markers on caged organisms and second, to develop ecologically relevant population models. Thus, this work allowed to underline the importance of the consideration of confounding factors (i.e. temperature), in different in situ tests based on the measurment of individul markers on caged organisms. Moreover, population models for both species have been defined in order to test the influence of life histories and seasonal variations on demographic sensitivity of populations.